王洪，魏杰，于鵬麗，鞏薇*，岳秉飛*

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

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實驗小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1實驗室檢測能力驗證結果評價

王洪，魏杰，于鵬麗，鞏薇*，岳秉飛*

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

【摘要】目的 通過實驗小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1檢測能力驗證計劃，了解實驗動物檢測機構檢驗能力，提高實驗動物質(zhì)量檢測水平。方法 按照CNAS批準的能力驗證方案，通過樣品制備，經(jīng)過穩(wěn)定性和均勻性檢驗合格，作為能力驗證樣品。采用隨機編號，發(fā)樣給參加單位，并附作業(yè)指導書。在規(guī)定時限提交檢驗報告和原始記錄復印件，其結果與樣品預檢結果一致的判為滿意結果，不一致或未能提交結果的判為不滿意結果。結果 共有10個實驗室參加本次能力驗證項目，其中滿意結果的實驗室8個，占總參加機構的80%，不滿意的實驗室有2個，占20%。結論 實驗動物質(zhì)量檢測機構在實驗小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1的檢測能力較高，實施能力驗證計劃能夠反映實驗室的檢測水平。

【關鍵詞】能力驗證；實驗動物；蘋果酸酶-1；異檸檬酸脫氫酶-1

實驗動物質(zhì)量控制是保證實驗動物質(zhì)量和動物實驗可靠程度的根本手段，全國已經(jīng)通過國家實驗動物質(zhì)量檢測機構技術審查的實驗室有20多家。各省市級藥檢院也配備有相應的進行動物實驗和實驗動物質(zhì)量控制的實驗室。為了增加實驗室間的技術交流，提高檢測水平，按照實驗室認可和實驗室資質(zhì)認可的有關要求，中國食品藥品檢定研究院-國家實驗動物質(zhì)量（遺傳、微生物）檢測中心，組織實施本次能力驗證活動：NIFDC-PT038“實驗小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1檢測”。

實驗室能力驗證計劃是通過實驗室間檢測結果的比對來衡量實驗室能力的活動，是實驗室證明其檢測技術能力水平的一種手段。能力驗證是國際通行的實驗室質(zhì)量控制方法，已成為世界各國政府以及國際實驗室認可組織廣泛采用的重要技術手段。生化標記檢測法是近交系實驗小鼠遺傳質(zhì)量評價的重要方法，國家標準GB/T14927.1-2008中要求進行14個生化標記位點的測定，其中小鼠腎勻漿中的蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1，這兩個位點要求的檢測技術具有一定的難度。

本次實驗室間比對的目的是要了解參加實驗室在本檢測項目的技術水平和能力，分析考察實驗室間差異，從而掌握實驗室檢測能力，為加強質(zhì)量管理體系建設提供數(shù)據(jù)支持。更重要的是發(fā)現(xiàn)并解決檢驗中存在的問題，促進各實驗室加強質(zhì)量管理，完善程序，提高檢測水平［1］。

1　材料和方法

1.1 實驗動物

實驗動物：SPF級8周齡雄性小鼠C57BL/6和BABL/c各10只來源于中國食品藥品檢定研究院【SCXK（京）2014-0013】。SPF級8周齡CBA雄性小鼠10只，來源于上海斯萊克實驗動物有限公司【SCXK（滬）2012-0002】。按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 檢測樣品

本次比對試驗提供的被測樣品為小鼠腎勻漿凍干樣品。制備方法：按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷，處死動物，剖腹，取小鼠腎臟2只，加入蒸餾水，蒸餾水與臟器的比例為2∶1（V/W）。勻漿后，放置到4℃低溫高速離心機中，15 000 r/min，30 min。取上清，加一定體積的保護劑，分裝，每瓶裝量100 mg，用凍干機凍干。小鼠腎勻漿凍干樣品為紅色固體。加蓋，封口膜封口，封口袋包裝。采用隨機數(shù)字方式編號（表1）。貯藏條件為密封，冷藏。每個參加實驗室分配3瓶樣品，通過冷鏈運輸方式運輸。樣品已經(jīng)經(jīng)過均勻性和穩(wěn)定性檢查，滿足質(zhì)量控制的要求［2-4］。

表1　能力驗證樣品隨機分組編號Tab.1 Random numbers of the samples

1.3 參加實驗室

本次能力驗證活動面向全國藥檢系統(tǒng)和實驗動物質(zhì)量檢測中心以及相關企業(yè)檢測實驗室。報名參加本次能力驗證活動的實驗室共計10個，10家實驗室全部提交有效結果。10家實驗室主要是實驗動物檢測中心、疾控中心、高校和企業(yè)內(nèi)部實驗室。10家實驗室主要分布于北京、上海、廣東、湖南，、湖北，、遼寧、吉林、陜西和新疆等地。

1.4 比對項目

本次試驗要求進行小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1檢測，檢測指標包括蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1a基因型和蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1b基因型。

1.5 實驗方法

本次能力驗證活動沒有要求統(tǒng)一的檢測方法，以各實驗室上報的檢測結果作為依據(jù)。為保證檢測結果具有可比性，所提供的樣品無需加工處理，可直接開封，加入70 μL蒸餾水溶解后取樣測定。檢測結果為定性的結果，報告基因型a型或者b型。測定完成后將結果報告單與原始記錄一并提交。

1.6 評價方法［5］

本次能力驗證活動的結果是定性的結果，依據(jù)國家標準GB/T14927.1-2008，對各實驗室提供的檢測結果進行評價，實驗室提供的結果與標準結果一致時，判定為滿意結果；實驗室提供的結果與標準結果不一致時，判定為不滿意結果。如圖1所示。

圖1　蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1均一性檢驗Note.1.Sample 1；2.Sample 2；3.Sample 3；4.Sample 4；5.Standard 1；6.Standard 2；7.Standard 3；8.Sample 5；9.Sample 6；10.Sample 7.Fig.1 Results of the homogeneity test of malic enzyme 1 and isocitrate dehydrogenase 1

2　結果

小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1能力驗證結果：

對于海外品牌而言，阿里巴巴集團并非進入中國唯一的“快通道”。此次進博會期間，蘇寧海外采購的訂單額預計150億歐元（約合人民幣1185億元），5000個海外品牌由此進駐中國。600多個海外品牌借力唯品會進入中國市場，采購訂單額達100億元人民幣。談及進博會，網(wǎng)易考拉CEO張蕾認為，中國跨境電商市場正在迎來“黃金窗口期”。這次盛會上，網(wǎng)易考拉與110家海外企業(yè)達成品牌合作意向，累積達成200億元人民幣的采購協(xié)議。

本次比對樣品共發(fā)放給10家報名實驗室，提交有效結果的實驗室共10個，獲滿意結果的實驗室8家，占參加單位的80%；不滿意結果有2家，占參加單位的20%。見表2。

3　討論

從各實驗室反饋的原始記錄中統(tǒng)計，本次能力驗證活動各實驗室均采用國家標準GB/T14927.1-2008推薦的生化標記檢測法。

表2　能力驗證蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1結果統(tǒng)計一覽表Tab.2 Results of testing for malic enzyme 1 and isocitrate dehydrogenase 1

3.1 能力驗證的重要性

作為日常監(jiān)督檢查的輔助手段，能夠有效提升實驗室的檢測能力，促進實驗室保持有效的檢測能力，同時幫助部分實驗室及時發(fā)現(xiàn)自身的不足并加以改進。我們在2013年實施相關的能力驗證計劃時，發(fā)現(xiàn)有1家實驗室不具備相應的檢測能力。同一家實驗室，在2015年的能力驗證活動中依然反饋了不滿意結果。說明該實驗室的質(zhì)量體系存在一定問題，有必要通過持續(xù)地參加相應的能力驗證活動來促進該檢測實驗室加強實驗室的質(zhì)量管理，便于促進檢測水平的提高。

3.2 不滿意結果的原因分析

不滿意結果的實驗室有2家：代碼為905的實驗室將樣品CBG0080010的異檸檬酸脫氫酶-1判斷為A型，而標準結果是B型。代碼為301的實驗室將樣品CBG0060007的異檸檬酸脫氫酶-1判斷為B型，而標準結果是A型。這兩家實驗室提供的結果與標準結果不一致，判定為不滿意結果。代碼為905的實驗室提供的原始結果圖，條帶可見，但沒有圖注釋，無法進一步分析不滿意結果的原因。代碼為301的實驗室提供的原始結果圖，無法看到條帶，也不能進一步分析不滿意結果的原因。

3.3 沒有進行的操作不應該出現(xiàn)在原始記錄中

本次能力驗證發(fā)放的是凍干樣品，不需要進行樣本采集、離心、勻漿等操作步驟，因此這些沒有進行的操作不應該出現(xiàn)在原始記錄中。有2家實驗室沒有按照實際情況進行原始記錄。

3.4 原始記錄的復核人以及審核人有漏簽的情況發(fā)生。

3.5 原始記錄中的醋纖膜電泳圖應拍照,利于長期保存

醋酸纖維素膜顯色會隨著時間逐漸變淡直至完全褪去，雖然可以體現(xiàn)實驗結果的原始性，但不利于結果的長期保存，建議拍照存檔。

3.6 圖題和圖注應詳細標注

內(nèi)容詳盡的圖題和圖注有利于實驗結果的分析，尤其是對不滿意結果的原因分析。這次參加能力驗證的實驗室有個別實驗室沒有圖題和圖注，無法對結果作分析判斷。

3.7 多數(shù)實驗室能夠提供清晰內(nèi)容詳盡的原始記錄電泳圖（如圖2所示）

3.8 組織對實驗室的培訓宣貫

一次能力驗證的結果只能證明實驗室參加的本次能力驗證活動的情況，不能說明實驗室的檢測水平，只有持續(xù)參加同一項目的能力驗證活動，其總體結果才能反映實驗室的能力狀況［6-10］。CNASRL01：2011《實驗室認可規(guī)則》、CNAS-RL02：2010《能力驗證規(guī)則》規(guī)定申請認可和獲準認可的實驗室必須通過參加能力驗證活動（包括CNAS組織實施或承認的能力驗證計劃、測量審核）證明其技術能力。只有在能力驗證活動中表現(xiàn)滿意，或?qū)τ诓粷M意結果能證明已開展了有效糾正措施的實驗室，CNAS方受理認可申請或予以認可。當不滿意結果已不能符合專業(yè)標準或規(guī)范時，除實施糾正措施并驗證其有效性外，實驗室還應自行暫停在相應項目的證書/報告中使用CNAS認可標識。在驗證糾正措施有效后，實驗室可自行恢復使用認可標識。對不能滿足能力驗證領域和頻次要求，或雖參加了能力驗證但結果不滿意且未在180天（能力驗證結果報告發(fā)布之日起計）內(nèi)開展糾正措施及其驗證活動的實驗室，CNAS可撤銷其相應項目的認可資格。對參加了CNAS組織及其承認的能力驗證活動且有穩(wěn)定滿意表現(xiàn)的實驗室，在CNAS的各類評審中可考慮適當簡化相關項目的能力確認過程。實驗室應保存上述記錄以備評審組檢查［11，12］。

通過實施本次實驗小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1檢測能力驗證計劃，我們發(fā)現(xiàn)，全國藥檢系統(tǒng)和實驗動物質(zhì)量檢測中心以及相關企業(yè)檢測實驗室具備蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1檢測能力，個別實驗室的檢測水平需要提高，對個別檢測能力有待提高的實驗室建議加強質(zhì)量管理體系的建設，盡快提高檢測能力。每次能力驗證計劃完成后，CNAS都及時公布參加能力驗證計劃的合格實驗室名單，為各級政府管理部門利用實驗室資源提供了基礎數(shù)據(jù)，為實驗動物領域的社會委托檢驗和政府部門布置監(jiān)督抽查任務提供了可靠的選擇依據(jù)，對促進我國的實驗動物工作起到了積極的推動作用。

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Laboratory proficiency evaluation of the detection ability of malic enzyme 1 and isocitrate dehydrogenase 1 in mouse kidneys

WANG Hong，WEI Jie，YU Peng-li，GONG Wei*，YUE Bing-fei*
（National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective To investigate the detection capacity of malic enzyme 1 and isocitrate dehydrogenase 1 （Mod1&Idh1）in the laboratory animal monitoring laboratories in China in order to understand the detection capacity of laboratories and to improve the detection level of laboratory animals'quality.Methods Based on the program approved by CNAS，samples preparing，homogeneity test and stability test of malic enzyme 1 and isocitrate dehydrogenase 1 in the mouse kidneys were carried out.Standard operation procedure and samples with random numbers were distributed to the laboratories.The laboratories should submit the result reports before the time limit expires.If the laboratory reports were the same with the standard results，the laboratories will receive satisfactory remark.If laboratory reports were not the same with the standard results，the laboratories will receive unsatisfactory remark.If a laboratory did not submit report，the laboratory will also receive unsatisfactory result.Results Eight laboratories out of 10（80%）enrolled laboratories reported satisfactory experiment results，and two laboratories（20%）presented unsatisfactory results.Conclusions The whole detection level of laboratories in Mod1&Idh1 is relatively high in the laboratory animals monitoring laboratories in China.It can reflect the detection level of laboratories to conduct the laboratory capacity evaluation.

【Key words】Capacity evaluation；Laboratory animal；Malic enzyme 1；Isocitrate dehydrogenase 1

【中圖分類號】Q95-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）02-0199-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.017

［基金項目］實驗用動物病原分子生物學快速檢測新技術研究與應用（編號：2015BAI07B02）。

［作者簡介］王洪（1977-），女，副研究員。研究方向：動物遺傳學。E-mail：littstar@163.com。

［通訊作者］岳秉飛（1960-），男，研究員。研究方向：實驗動物學，E-mail：y6784@126.com。鞏薇（1973-），女，副研究員。研究方向：實驗動物管理。E-mail：hou20121221@126.com

Corresponding author：YUE Bing-fei，Email：y6784@126.com.GONG Wei，Email：hou20121221@126.com

［收稿日期］2016-01-13