任曉楠，任蓉蓉，劉雪，楊華，秦波音，周曉輝

（上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508）

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Alb-cre/DTR小鼠可誘導性肝損傷模型的建立

任曉楠，任蓉蓉，劉雪，楊華，秦波音，周曉輝*

（上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508）

【摘要】目的 建立Alb-cre/DTR雙轉基因小鼠模型并進行相關表型分析，在此基礎上建立可誘導性肝損模型，用于肝臟疾病的相關研究。方法 將引進的Alb-cre和DTR小鼠擴繁后，通過雜交的方式獲得雙轉基因小鼠。提取小鼠尾部組織DNA，利用PCR方法進行基因型鑒定。在雙轉基因小鼠上腹腔注射白喉毒素，之后在不同時間點進行稱重、采血，檢測血清ALT、AST水平。結果 將Alb-cre和DTR小鼠雜交、篩選后獲得了Alb-cre/DTR雙轉基因小鼠，對該小鼠使用0.625 ng/g劑量的白喉毒素，可使小鼠血清中ALT與AST水平顯著升高，解剖小鼠后觀察到肝整體變白，HE染色結果顯示肝細胞明顯壞死。結論 成功建立可誘導特異性肝損傷小鼠模型。

【關鍵詞】Alb-cre；DTR；轉基因；特異性肝損傷；小鼠

肝疾病是對人類威脅最大的疾病之一［1-2］，除病毒性肝炎外［3-4］，肝臟疾病中肝硬化、肝癌等危害也相當嚴重；肝臟移植手術對于解決肝系統(tǒng)疾病和肝代謝紊亂等來說是一種非常重要的手段［5］，但是肝移植手術仍然面臨很多尚未解決的問題，需要更多的相關研究來提高移植后肝細胞的再生和增殖問題。與肝臟的移植相比，肝細胞的移植更具可行性［6］，所需費用也較小。

建立肝損傷動物模型是研究肝細胞移植和再生的關鍵性技術［7］?；谏鲜鲅芯勘尘?，研究者利用Cre-loxp條件性敲除系統(tǒng)控制轉基因表達的技術，將白喉毒素受體基因特定表達于小鼠肝細胞，構建了Alb-cre/DTR小鼠。目前基于Cre-loxp條件性敲除系統(tǒng)的應用非常多，但是通過該技術使用白喉毒素誘導肝損傷的動物模型還未見相關報道。研究者構建的模型即可通過注射白喉毒素實現(xiàn)可控性、誘導性肝損的發(fā)生，是一種新型的肝損模型。

1　材料與方法

1.1 實驗動物

B6.Cg-Tg（Alb-cre）21Mgn/J小鼠（以下簡稱Alb-cre小鼠）引自美國 Jackson實驗室，pCAGSTOP-DTR-2A-EGFP小鼠（以下簡稱DTR小鼠）引自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司。遺傳背景均系C57BL/6小鼠。

1.2 小鼠的飼養(yǎng)和繁殖

按照SPF級動物飼養(yǎng)標準在上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物中心［SYXK（滬）2015-0008］進行飼養(yǎng)。室內(nèi)溫度20～25℃，相對濕度50% ～60%，每日光照12 h，小鼠飼料、飲水、墊料均經(jīng)高溫高壓滅菌處理。將引進的Alb-cre和DTR小鼠分別繁殖擴群后，采用公∶母=1∶1的同居方式進行繁殖，母鼠妊娠后單籠飼養(yǎng)。產(chǎn)生F1代雜交小鼠后在幼仔21日齡左右離乳，剪腳趾標記，剪鼠尾待檢測基因型。

1.3 主要試劑

動物組織基因組小量提取試劑盒（DK611-02）和2×Taq PCR Master mix（PT102-02）購自上海萊楓生物科技有限公司，瓊脂糖和DNA marker購自北京全式金生物生物技術有限公司，白喉毒素購自Sigma公司。

1.4 小鼠的基因型鑒定

1.4.1 小鼠尾部基因組DNA提取

剪小鼠尾0.5～1 cm置入EP管中，按照上海萊楓生物公司的動物組織DNA提取試劑盒的說明書進行DNA抽提。

1.4.2 小鼠基因組DNA的PCR擴增反應（Alb-cre 和DTR定型用引物如表1）

（1）Alb-cre/DTR小鼠Alb-cre基因的PCR反應體系

下列反應物構成25 μL的反應體系：2×PCR Master Mix 12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O 8.5 μL，共25 μL。PCR反應條件：預變性95℃ 5 min；變性95℃30 s；退火62℃30 s；延伸72℃30 s；共30個循環(huán)，最后再延伸72℃10 min，之后10℃保存。

（2）Alb-cre/DTR小鼠DTR基因的PCR反應體系

下列反應物構成25 μL的反應體系：2×PCR master Mix 12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O 8.5 μL，共25 μL。WT rosa-GT PCR反應條件：預變性95℃ 5 min；變性95℃30 s；退火62℃ 35 s；延伸72℃ 35 s；共35個循環(huán)，最后再延伸72℃ 10 min，之后10℃保存。Mutant EGFP PCR反應條件：預變性95℃ 5 min；變性95℃30 s；退火62℃ 20 s；延伸72℃ 20 s；共35個循環(huán)，最后再延伸72℃ 10 min，之后10℃保存。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳及結果分析

PCR之后通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。制備1%瓊脂糖凝膠，取PCR反應終產(chǎn)物10 μL進行電泳，120 V，20 min。電泳后使用凝膠成像系統(tǒng)進行電泳圖片分析。鼠尾瓊脂糖凝膠電泳基因型片段為：鑒定Alb-cre基因，含有該基因的片段大小為275 bp，野生型則沒有相應片段；鑒定DTR，野生型為Rosa-GT引物對擴增片段，大小為469 bp，純合子為DTR/EGFP引物對擴增片段，大小為234 bp，雜合子為469 bp和234 bp，根據(jù)條帶大小鑒別含有雙基因的小鼠。

表1　Alb-cre/DTR小鼠基因型鑒定PCR引物序列Tab.1 The PCR primers and their sequences

1.5 特異性肝損傷小鼠模型的建立

取SPF級Alb-cre/DTR小鼠（含有cre、DTR雜合）和C57BL/6小鼠（購自上海斯萊克實驗動物中心）各3只，9～10周齡，雄性，于實驗前采血，分離血清，檢測造模前小鼠本底ALT、AST值，之后稱取體重，將0.625 ng/g小鼠體重劑量的白喉毒素溶于200 μL的PBS溶液中，通過腹腔注射的方式造模；分別于造模后第1、2、3、4、7、8、9天監(jiān)測小鼠體重并采血，全血標本于室溫靜置1 h后600 r/min離心15 min分離血清，用于ALT與AST指標的檢測，實驗第四天時自然死亡小鼠解剖取肝進行大體觀察，留取肝4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，觀察肝病理組織學改變。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)均以均值±標準差表示，兩組間均值的統(tǒng)計比較實用非配對t檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1 Alb-cre/DTR小鼠Alb-cre基因型鑒定結果

通過PCR檢測Alb-cre/DTR小鼠的Alb-cre基因型，含有Alb-cre基因的小鼠在279 bp有條帶，野生型在相應位置則沒有條帶（圖1）。

圖1　Alb-cre基因型鑒定結果Note.Lanes 1，2 and 4 were Alb-cre mice；Lanes 3 and 5 were wild type mice.Fig.1 PCR identification of Alb-cre gene

2.2 Alb-cre/DTR小鼠DTR基因型鑒定結果

通過PCR檢測Alb-cre/DTR小鼠的DTR基因型，野生型為469 bp，純合子只有234 bp一條帶，雜合子有469 bp和234 bp兩條帶（圖2A和2B）。

2.3 肝損傷表型的建立

2.3.1 小鼠體重變化的比較

造模后，Alb-cre/DTR小鼠的體重開始下降，第4天降至最低，只有原有體重的（87.89%± 0.8822），C57BL/6小鼠為（100.3% ±0.4490），兩者差異有顯著性（P＜0.001）。之后Alb-cre/DTR小鼠體重逐漸恢復，但一直沒有超過C57BL/6小鼠，C57BL/6小鼠體重一直平穩(wěn)上升（圖3）。第0 ～4天小鼠只數(shù)為3只，第7～9天小鼠只數(shù)為2只（第4天Alb-cre/DTR小鼠自然死亡，同時處死1只C57BL/6小鼠作為對照）。

2.3.2 小鼠谷丙轉氨酶（ALT）值變化

腹腔注射白喉毒素后，Alb-cre/DTR小鼠的血清ALT值與C57BL/6小鼠相比顯著升高，在造模后的第2天達到峰值，高達（1419±455.7）IU/mL，C57BL/6小鼠為（36.67±7.667）IU/mL，兩者差異有顯著性（P＜0.05）。之后Alb-cre/DTR小鼠ALT值降低，第4天又再次升高，為（1117±3.0）IU/ mL，且有一只小鼠肝損嚴重出現(xiàn)死亡，對照組小鼠僅為（37.0±13.2）IU/mL，兩者差異有顯著性（P＜0.001）。之后Alb-cre/DTR小鼠ALT值又再次降低（圖4）。

圖2　DTR基因型鑒定結果Note.Note：Lanes 1，2 and 5 were DTR homozygous mice；Lanes 3 and 4 were DTR heterozygous mice.Fig.2 PCR identification of DTR gene

圖3　小鼠體重變化曲線Note.Compared with the C57BL/6 mouse，***P＜0.001.Fig.3 Changes of body weight in the mice

2.3.3 小鼠谷草轉氨酶（AST）值變化

Alb-cre/DTR小鼠的血清AST值與C57BL/6小鼠相比顯著升高，趨勢與ALT值一致。在造模后的第2天達到峰值，高達（1260±329.1）IU/mL，C57BL/6小鼠為（84.67±16.13）IU/mL，兩者差異有顯著性（P＜0.05）。之后Alb-cre/DTR小鼠AST值降低，第4天又再次升高，為（1293±98.00）IU/mL，且有一只小鼠肝損嚴重出現(xiàn)死亡，C57BL/6小鼠僅為（73.33±15.90）IU/mL，兩者差異有顯著性（P＜0.001）。之后Alb-cre/DTR小鼠AST值又再次降低（圖5）。

圖4　小鼠ALT水平變化曲線Note.Compared with the C57BL/6 mice，*P＜0.05，***P＜0.001.Fig.4 The curves of ALT changes in the mice

圖5　小鼠AST水平變化曲線Note.Compared with C57BL/6 mice，*P＜0.05，***P＜0.001.Fig.5 The curves of AST changes in the mice

2.3.4 小鼠肝大體觀察與病理學監(jiān)測結果

取Alb-cre/DTR死亡小鼠肝大體觀察，其肝臟較C57BL/6正常小鼠明顯變白，損傷顯著（圖6）。

C57BL/6小鼠肝組織結構正常，肝小葉結構完整，肝細胞索與肝血竇排列規(guī)則，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，未見肝細胞變性及壞死等變化；而Alb-cre/DTR死亡小鼠肝內(nèi)部出現(xiàn)了肝細胞核碎裂，核溶解消失等病理現(xiàn)象，表現(xiàn)出嚴重的肝細胞壞死現(xiàn)象（圖7）。

圖6　小鼠肝大體觀察Note.A.C57BL/6 mouse；B.Alb-cre/DTR mouse.Fig.6 Gross appearance of the mouse livers

3　討論

圖7　小鼠肝病理圖（HE染色，標尺=20 μm）Note.A.C57BL/6 mouse；B.Alb-cre/DTR mouse.Fig.7 Histological changes in the liver tissue of the mice.HE staining，bar=20 μm）

肝移植手術對于解決肝臟系統(tǒng)疾病和肝代謝紊亂等是一種重要的手段，所以肝臟損傷的動物模型是研究肝細胞移植和再生的重要技術平臺。然而，缺乏合適的小動物模型很大程度上限制了肝移植技術優(yōu)化相關的臨床前研究［8-9］。就小鼠而言，移植的外源肝細胞要在小鼠體內(nèi)嵌合、再生成功，其先決條件之一是要求肝本身有損傷，外源植入的肝細胞才有機會克服生存競爭而“殖民”成功?，F(xiàn)有的動物模型，例如Alb-uPA小鼠模型曾被應用于肝細胞移植研究中，但是由于uPA小鼠繁殖困難，死亡率高，移植手術需要在小鼠出生2周內(nèi)完成且手術風險較大等一系列問題而限制了其廣泛應用［10］。

研究者將Alb-cre小鼠和DTR小鼠雜交后獲得Alb-cre/DTR小鼠，該小鼠是同時表達 Alb-cre和DTR基因的，DTR［11-12］是指條件性轉入人白喉毒素受體（diphtheria toxin receptor，DTR）基因，該基因的前端含有轉錄終止信號（STOP）位點，在STOP位點兩側還有Cre酶識別的LoxP位點。因此，DTR基因表達受Cre/LoxP系統(tǒng)［13］控制，當在特定組織表達有Cre酶時，可通過識別LoxP而將STOP位點切除，從而啟動DTR基因的表達。Alb-cre小鼠含有在肝中特異性表達的白蛋白（Alb）基因啟動子，可以在肝組織中特異性表達Cre酶，故而Alb-cre/DTR小鼠就可在肝特異性表達人白喉毒素受體（DTR），通過腹腔注射白喉毒素（DT）就可以特異性地誘導Alb-cre/DTR小鼠的肝發(fā)生損傷。

研究者通過腹腔注射白喉毒素到該小鼠體內(nèi)，建立了一種新型的可控性、誘導性肝損小鼠模型。該模型小鼠出現(xiàn)了以下特征，在腹腔注射白喉毒素后第2天ALT與AST值達到高峰，在第3天出現(xiàn)回落，在第4天又重新回到峰值，第3天的回落可能是由于某些代償性調(diào)節(jié)機制的作用，但由于白喉毒素可能還未完全清除，所以第4天又重新出現(xiàn)峰值，這與之前肝損模型的大多數(shù)研究規(guī)律相累似［14-15］；同時研究者也希望參照前人研究成果在ALT峰值期間進行相關實驗，后續(xù)考慮可通過更低劑量多次注射的方式使小鼠處于持續(xù)的肝損傷狀態(tài)，從而更利于相關研究的進行。

該模型由于可以通過調(diào)控白喉毒素的注射時間而解決Alb-uPA小鼠手術窗口期短的問題，使手術時間更靈活，可根據(jù)實驗的具體要求來確定肝損模型的建立時間。此外，其他研究2011年報導建立的FKB-caspase-8調(diào)控的可誘導性肝損小鼠模型雖然比較成功，但人肝細胞嵌合效率較低［15］，研究者希望該模型的構建可以在一定程度上提高外源人肝細胞的高重建率。綜上所述，該模型的建立是肝細胞移植研究、人源化肝臟小鼠模型構建等的重要基礎，在肝疾病基礎性研究中具有廣泛應用前景，并可應用于相關新型藥物的篩選研發(fā)。

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Establishment of an Alb-cre/DTR mouse model of inducible liver injury

REN Xiao-nan，REN Rong-rong，LIU Xue，YANG Hua，QIN Bo-yin，ZHOU Xiao-hui*
（Shanghai Public Health Clinical Center，Shanghai 201508，China）

【Abstract】Objective To analyze the Alb-cre/DTR mouse phenotype，and establish a model of induced liver damage to serve basic researches of liver diseases.Methods The introduced Alb-cre and DTR mice were crossed to obtain Alb-cre/DTR mice and the genomic DNAs were extracted from the tail tissue of the mice for genotying by PCR.Diphtheria toxin was intraperitoneally（i.p.）injected into the Alb-cre/DTR mice，then the body weights were monitored and the sera were collected for the detection of serum ALT and AST levels.Results By crossing Alb-cre and DTR mice we obtained the Alb-cre and DTR double transgenic mouse.The intraperitoneal injection of diphtheria toxin in a dose of 0.625 ng/g body weight significantly induced liver injury in these mice，as showed by the elevated levels of ALT and AST，the gross appearance of liver damage and the pathological changes such as necrosis in the liver tissue.Conclusions We have obtained a novel mouse strain of Alb-cre/DTR by crossing Alb-cre and DTR mice.Liver damages in those Alb-cre/DTR mice can be induced by injection of diphtheria toxin.This established mouse model of inducible liver damage is a useful platform for the studies of liver damage and recovery，as well as liver transplantation.

【Key words】Alb-cre；DTR；Transgene；Induced liver injury；Mice

【中圖分類號】Q95-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）02-0134-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.005

［基金項目］上海市科技發(fā)展基金實驗動物研究項目（項目編號12140900300）；上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題（項目編號20144Y0073）；上海市公共衛(wèi)生臨床中心中心科研課題面上項目（項目編號2014M08）。

［作者簡介］任曉楠（1986-），女，碩士，從事肝炎肝病相關動物模型研究，E-mail：renxiaonan66@126.com

［通訊作者］周曉輝（1971-），男，副教授，E-mail：zhouxiaohui@shaphc.org

Corresponding author：ZHOU Xiao-hui，E-mail：zhouxiaohui@shaphc.org

［收稿日期］2015-09-02