田美杰，孫英健，官佳懿，沈紅

（北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)科學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)（中獸醫(yī)）北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

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橙皮苷對(duì)小鼠抗氧化作用及抗氧化酶基因表達(dá)的影響

田美杰，孫英健*，官佳懿，沈紅*

（北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)科學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)（中獸醫(yī)）北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

【摘要】目的 探討橙皮苷（HDN）對(duì)機(jī)體抗氧化作用的影響。方法 采用分光光度法、鄰苯三酚自氧化法和Fe2+-鄰二氮菲法檢測(cè)HDN體外清除自由基、抑制線粒體腫脹和紅細(xì)胞氧化溶血；實(shí)驗(yàn)小鼠灌服不同濃度HDN （0、80、160、320 mg/kg）連續(xù)12 d，ELISA和分光光度法檢測(cè)小鼠組織中MDA含量，抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-PX）活力，RT-PCR技術(shù)分析抗氧化物酶mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 與對(duì)照組比較，HDN組自由基（·OH、O2-·、DPPH·）清除率明顯提高，小鼠紅細(xì)胞體外氧化溶血和線粒體腫脹顯著降低；小鼠組織及血清中MDA含量降低，抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX活力明顯高于對(duì)照組，組織中抗氧化酶mRNA（SOD、CAT、GSH-PX）表達(dá)上調(diào)。結(jié)論 HDN能夠清除自由基，降低自由基引起的細(xì)胞氧化損傷，抑制過氧化物生成，上調(diào)抗氧化酶基因表達(dá)及提高酶活力，呈現(xiàn)良好的抗氧化作用。

【關(guān)鍵詞】橙皮苷；抗氧化酶；基因表達(dá)

動(dòng)物體的正常生理活動(dòng)有賴于機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，自由基對(duì)于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)十分重要，當(dāng)機(jī)體受到如外源性異物、輻射等刺激時(shí)，易誘發(fā)產(chǎn)生大量自由基，從而對(duì)機(jī)體內(nèi)DNA和組織細(xì)胞造成一定程度損傷，引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。自由基是指未經(jīng)配對(duì)的電子基團(tuán)，易與機(jī)體細(xì)胞膜上的磷脂結(jié)合，攻擊細(xì)胞膜而造成一定損傷［1］。紅細(xì)胞膜含有豐富的不飽和脂肪酸，自由基可作用于膜上的蛋白分子，易造成紅細(xì)胞膜氧化損傷、通透性增大、細(xì)胞變脆，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生紅細(xì)胞溶血［2］。細(xì)胞內(nèi)的線粒體同樣也是自由基攻擊的對(duì)象，自由基通過影響線粒體膜呼吸鏈的電子傳遞，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷［3］。

橙皮苷（HDN）是一種天然黃酮類化合物，生物來源廣泛，可由豆科、蕓香科、柑橘屬等植物中提?。?］。研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷及其衍生物對(duì)體外多種自由基具有良好的清除作用，如對(duì)二苯代苦味?；杂苫―PPH·）、超氧陰離子自由基（·O2-）和羥自由基（·OH）自由基的清除［5～7］。Naveen Tirkey等［8］研究發(fā)現(xiàn)，四氯化碳可致大鼠肝急性損傷，引起大鼠肝勻漿中谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）以及過氧化氫酶（CAT）水平下降，而橙皮苷可以明顯的抑制這些變化，發(fā)揮明顯的抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)HDN對(duì)自由基清除、抗氧化物酶（SOD、CAT、GSH-PX）活力及其基因表達(dá)，探討HDN的抗氧化作用。

1　材料與方法

1.1 材料

橙皮苷（HDN）、DPPH、二硫蘇糖醇（DTT）、硫代巴比妥酸（TBA）購自美國 Sigma公司，丙二醛（MDA）、SOD、CAT、GSH-PX檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，鄰苯三酚、硫酸亞鐵、鄰二氮菲購自國藥化學(xué)試劑廠，TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自北京艾德萊生物科技有限公司，SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（RR420A）購自日本TaKaRa公司，所用引物由華大科技公司合成，PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

6～8周齡KM小鼠40只，體重20～22 g，清潔級(jí)，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK-（軍）2012-0004】。無菌手術(shù)在北京農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物示范中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行【SYXK（京）2010 -0003】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理

取小鼠40只隨機(jī)分四組，每組10只，空白對(duì)照組小鼠每天灌服生理鹽水，HDN組小鼠每天灌服不同劑量HDN（80、160、320 mg/kg），連續(xù)灌服12 d。

1.2.2 自由基的清除分析

（1）Fe2+-鄰二氮菲氧化法測(cè)定·OH自由基的清除

試劑參比管（A3）中加入1 mL鄰二氮菲溶液（0.75 mmol/L）、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）2 mL、蒸餾水1 mL、1 mL FeSO4溶液（7.5 mmol/L）和1 mL 0.1%H2O2，混勻后37℃反應(yīng)90 min，取適量反應(yīng)液于比色皿，紫外分光光度計(jì)測(cè)536 nm吸光度值（A）；取不同濃度HDN（10、20、40、80、160 μg/ mL）1 mL加入已盛有4 mL蒸餾水的離心管內(nèi)制備樣品參比管（A0）；5 mL反應(yīng)體系溶液得到反應(yīng)體系參比管（A2）；樣品反應(yīng)管（A1）則將試劑參比管體系中的H2O2換為不同濃度HDN，根據(jù)公式計(jì)算羥自由基清除率［5］，·OH清除率（%）=（A1-A0-A2）/ （A3-A2）×100%，其中A1—樣品反應(yīng)管的吸光度值；A0—樣品參比管的吸光度值；A2—反應(yīng)體系管的吸光度值；A3—試劑管的吸光度值。

（2）鄰苯三酚自氧化法測(cè)定O2-·自由基清除

樣品反應(yīng)管（A2）中加入PBS緩沖液（pH 8.3）5 mL，50 μL不同濃度HDN，25℃恒溫水浴中溫育20 min，然后加入25 mmol/L鄰苯三酚40 μL，混勻后繼續(xù)25℃恒溫水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)3 min，快速滴加50 μL二硫蘇糖醇溶液（50 mg/mL DTT）終止反應(yīng)，立即混勻，室溫放置5 min，上清液在322 nm波長(zhǎng)A值；空白參比管（A0）將上述體系中不同濃度HDN和鄰苯三酚換為等體積PBS緩沖液，試劑參比管（A1）則將鄰苯三酚換為等體積PBS緩沖液，根據(jù)公式計(jì)算超氧陰離子清除率［6］，O2-·清除率（%）= （A2-A1+A0）/A0×100%，A0—空白參比管吸光度值；A1—樣品參比管吸光度值；A2—樣品反應(yīng)管吸光度值。

（3）分光光度法測(cè)定DPPH·自由基的清除

樣品反應(yīng)管中加入0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液1.2 mL、不同濃度HDN 0.5 mL，加入2.3 mL雙蒸水將反應(yīng)體系體積補(bǔ)足為4 mL，充分混勻；樣品參比管中加入不同濃度HDN 0.5 mL與3.5 mL雙蒸水；試劑參比管中加入1.2 mL DPPH-乙醇溶液和2.8 mL雙蒸水；室溫下靜置，避光反應(yīng)30 min，紫外分光光度計(jì)517 nm處測(cè)定上清液A值，根據(jù)公式計(jì)算自由基清除率［5］，DPPH·清除率（%）=（A0-A1+A2）/A0×100%，其中A1—樣品反應(yīng)管的吸光度值；A2—樣品管的吸光度值；A0—反應(yīng)體系管的吸光度值。

1.2.3 TBA檢測(cè)脂質(zhì)過氧物丙二醛（MDA）生成抑制率

首先制備小鼠不同組織（肝、腎、脾、心臟）勻漿液，用生理鹽水稀釋，分別取1 mL組織勻漿液置于樣品反應(yīng)管，然后向管內(nèi)加入1 mL不同濃度HDN；分別取1 mL組織勻漿液置于對(duì)照管，然后向管內(nèi)加1 mL生理鹽水；向上述各管中加入100 μL硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L）和40 μL H2O2（60 mmol/L），置于37℃水浴鍋內(nèi)反應(yīng)1 h，然后冷卻，加入1 mL 15%三氯乙酸和1 mL 0.6%TBA，混勻后在沸水中煮沸顯色15 min，冷卻后3000 r/min離心10 min，取上清液加入比色管，紫外分光光度計(jì)測(cè)定532 nm A值，按公式計(jì)算MDA生成抑制率，MDA抑制率（%）=（1-A1/A0）×100%，其中A1—樣品反應(yīng)的吸光度值；A0—對(duì)照管的吸光度值。

1.2.4 肝線粒體腫脹檢測(cè)

線粒體懸液制備：制備小鼠肝勻漿液，4℃ 3000 r/min離心15 min，向沉淀中加入預(yù)冷勻漿介質(zhì)蔗糖（0.25 mol/L）洗滌3次，收集離心上清液合并于4℃10 000 r/min離心20 min，肝線粒體沉淀用預(yù)冷Tris-HCl緩沖液（10 mol/L）制成線粒體懸液［4］。

樣品反應(yīng)管（A1）加入3 mL肝線粒體懸液、50 μL FeSO4（0.1 mmol/L）、50 μL H2O2（0.1 mmol/ L）、1 mL不同濃度HDN；空白對(duì)照管（A2）加入3 mL肝線粒體懸液、1 mL Tris-HCl緩沖液；陽性對(duì)照管（A0）加入3 mL肝線粒體懸液、50 μL FeSO4、50 μL H2O2、1 mL Tris-HCl緩沖液；混勻反應(yīng)，紫外分光光度計(jì)測(cè)定520 nm A值，按公式計(jì)算抑制率（%）=［A0-（A1-A2）］/A0×100%。

1.2.5 紅細(xì)胞氧化溶血檢測(cè)

紅細(xì)胞懸液制備：取小鼠血液于4℃ 2500 r/min離心10 min，棄上清然后加入等滲生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，最后制成1%紅細(xì)胞懸浮液。取1 mL紅細(xì)胞懸液和4 mL生理鹽水加入空白對(duì)照管（A2）；陽性對(duì)照管（A0）為1 mL紅細(xì)胞懸液和4 mL生理鹽水以及50 μL 100 mmol/L H2O2（100 mmol/L）；樣品反應(yīng)管（A1）加入1 mL紅細(xì)胞懸液和50 μL不同濃度HDN及3.950 mL生理鹽水；向上述各管加入50 μL H2O2混勻，置于37℃水浴鍋內(nèi)溫育1 h，冷卻后2000 r/min離心5 min，紫外分光光度計(jì)測(cè)415 nm處A值；按公式計(jì)算紅細(xì)胞溶血率（%）=A1/A0×100%［4］，陽性對(duì)照組A值為100%紅細(xì)胞溶血率，A1A2分別為樣品反應(yīng)管和空白對(duì)照管A值。

1.2.6 小鼠組織和血清中MDA含量的檢測(cè)

于末次給藥24 h后處死小鼠，眼眶采血，取小鼠肝和腎，用預(yù)冷PBS中洗去浮血，濾紙拭干，稱取1 g組織和9倍組織重量體積預(yù)冷生理鹽水置于勻漿機(jī)勻漿，4℃3000 r/min離心10 min，收集上清液備用。血液于離心管2000 r/min離心15 min，分離血清。

分別取0.1 mL血清和上清液按試劑盒的說明操作，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)532 nm MDA含量。

1.2.7 小鼠組織中抗氧化酶檢測(cè)

取已制備的組織勻漿液按試劑盒說明操作，根據(jù)公式計(jì)算SOD、CAT、GSH-PX活力。

1.2.8 熒光定量PCR檢測(cè)抗氧化物酶基因表達(dá)

（1）總RNA提取：取100 mg小鼠肝、腎組織剪碎，加入1 mL Trizol研磨，研磨液置入EP管靜置5 min，然后4℃12 000 r/min離心10 min，取上清液于EP管中再加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s靜置2 min，4℃12 000 r/min離心15 min，吸出上清液并加入等體積異丙醇輕輕混勻，放置10 min后4℃12 000 r/ min離心10 min，棄上清加1 mL 75%乙醇，4℃12000 r/min離心3 min，重復(fù)2次，室溫靜置晾干RNA后加入DEPC水20 μL混勻，檢測(cè)A260和A280值，確定RNA純度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）cDNA的合成：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TURE-script 1st Strand cDNA Synthesis Kit，反應(yīng)體系20 μL，為總RNA 3 μL、Oligo（dT）1 μL、5×RT Reaction Mix 4 μL、TUREscript H-RTase 0.8 μL、RNase free H2O 10.2 μL，混勻置于PCR儀，42℃孵育1 h，65℃孵育15 min，反轉(zhuǎn)錄即得cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）PCR檢測(cè)與分析：在0.2 mL的PCR薄壁管中建立PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL，為cDNA 2 μL、上下引物各1 μL、SYBR Premix Ex Taq（2×）10 μL、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、滅菌蒸餾水5.6μL；PCR反應(yīng)條件為95℃30 s，95℃5 s，55～59℃（引物最適溫度）30 s，95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，共40個(gè)循環(huán)；最后采用與熒光定量PCR儀配套的Step One Software v2.1分析PCR數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表1。

表1　SYBR real-time PCR反應(yīng)引物序列Tab.1 Sequences of the primers in SYBR real-time PCR

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)比較差異。

2　結(jié)果

2.1 HDN體外抗氧化作用

2.1.1 HDN對(duì)自由基清除

HDN體外清除自由基的結(jié)果見圖1，與對(duì)照組比較，HDN在0～160 μg/mL劑量范圍內(nèi)對(duì)·OH自由基清除顯著提高，且表現(xiàn)量效關(guān)系（圖1A）；HDN組有較好的清除作用，HDN在0～80 μg/mL劑量范圍內(nèi)對(duì)O2-·自由基清除明顯提高，80 μg/mL時(shí)清除率達(dá)到最大值，160 μg/mL組清除率有所下降（圖1B）；HDN對(duì)DPPH·自由基清除隨著HDN劑量增加清除率大幅提高（圖1C）。

圖1　HDN對(duì)自由基清除的影響（ABC分別為·OH、O2-·、DPPH·自由基）Fig.1 Effect of HDN on free radical scavenging（ABC indicate OH，O2-，DPPH free radical，respectively）

2.1.2 HDN對(duì)線粒體腫脹和紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用

與陽性對(duì)照組比較，HDN組紅細(xì)胞氧化溶血顯著降低，且隨HDN劑量增加紅細(xì)胞溶血逐漸降低，表現(xiàn)明顯量效關(guān)系（圖2）。隨HDN劑量增加，HDN組肝線粒體腫脹抑制率明顯增加，即線粒體腫脹程度明顯降低；且隨著肝線粒體與HDN作用時(shí)間延長(zhǎng)，肝線粒體腫脹抑制率明顯提高（圖3）。

2.1.3 HDN對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制作用

HDN組不同組織MDA抑制率均低于陽性對(duì)照組，但隨著HDN劑量增加抑制率呈升高趨勢(shì)，表明組織中MDA生成降低，其中肝組織MDA抑制率提高最明顯，HDN為80 μg/mL時(shí)肝組織MDA抑制率最大，HDN在40和80 μg/mL時(shí)肝線粒體MDA抑制率也較高；HDN為20～80 μg/mL時(shí)腎MDA抑制率逐漸提高，40 μg/mL時(shí)MDA抑制率最高；HDN在10～80 μg/mL范圍心臟MDA抑制率逐漸升高，80 μg/mL組心臟MDA抑制率最大，160 μg/mL時(shí)MDA抑制率有所降低（圖4）。

圖2　HDN對(duì)紅細(xì)胞氧化溶血的影響Fig.2 Effects of HDN on hemolysis of erythrocytes

圖3　HDN對(duì)肝線粒體腫脹的影響Fig.3 Effects of HDN on hepatocyte mitochondria swelling

圖4　HDN對(duì)不同組織和線粒體脂質(zhì)過氧化物（MDA）形成的影響Fig.4 Effects of HDN on the MDA production in different tissues and hepatocyte mitochondria

2.2 HDN對(duì)小鼠抗氧化作用的分析

2.2.1 HDN對(duì)小鼠組織中MDA含量的影響

與對(duì)照組比較，HDN組小鼠肝、腎組織和血清中MDA含量明顯低于對(duì)照組，隨HDN量增加組織和血清中MDA含量明顯減少，其中以肝最明顯，其次腎（圖5）。

圖5　HDN對(duì)不同組織和血清中MDA生成的影響Fig.5 Effects of HDN on the MDA production in the liver，kidney and serum

2.2.2 HDN對(duì)小鼠腎抗氧化酶活力及基因表達(dá)的影響

小鼠的腎組織中抗氧化酶（SOD、CAT、GSHPX）活力及基因表達(dá)結(jié)果見圖6-8。由圖6知，HDN組小鼠腎SOD活力隨HDN劑量提高逐漸增強(qiáng)，高劑量組最明顯極顯著高于對(duì)照組（圖6A）；PTPCR檢測(cè) SOD（SOD1、SOD2）基因表達(dá)，結(jié)果隨著HDN劑量提高SOD1和SOD2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量增加，SOD2表達(dá)量高于SOD1（圖6B）。與對(duì)照組比較，HDN三個(gè)劑量組小鼠腎組織CAT活力均顯著高于對(duì)照組，中劑量組CAT活力最高（圖7A）；CAT基因mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)一致，不同劑量HDN組CAT mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，以中劑量組表達(dá)量最高（圖7B）。HDN組小鼠腎GSH-PX活力均高于對(duì)照組，且中劑量組GSH-PX活力最高（圖8A）；中高劑量組CAT基因相對(duì)表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組（圖8B）。

圖6　HDN對(duì)腎組織SOD活力及基因mRNA表達(dá)的影響（A表示S0D活力，B表示S0D基因表達(dá)）Fig.6 Effects of HDN on the SOD activity and its gene mRNA expression in the kidneys （A.SOD activity；B.SOD mRNA expression）

圖7　HDN對(duì)腎組織CAT活力和基因mRNA表達(dá)的影響Fig.7 Effects of HDN on the CAT activity and its gene mRNA expression in the kidneys

圖8　HDN對(duì)腎組織GSH-PX活力及基因mRNA表達(dá)的影響Fig.8 Effects of HDN on the GSH-PX activity and its gene mRNA expression in the kidneys

2.2.3 HDN對(duì)小鼠肝抗氧化酶活力及基因表達(dá)的影響

小鼠肝抗氧化酶（CAT、GSH-PX、SOD）活力結(jié)果見圖9，與對(duì)照組比較，不同劑量HDN組肝CAT活力均明顯高于對(duì)照組，其中低劑量組最高，且極顯著高于對(duì)照組（圖9A）；HDN組肝GSH-PX活力均極顯著高于對(duì)照組，且中劑量組最高（圖9B）；隨著HDN劑量提高肝SOD活力逐漸增強(qiáng)，高劑量組最強(qiáng)極顯著高于對(duì)照組（圖9C）?？寡趸富虮磉_(dá)與蛋白一致，三種抗氧化酶（CAT、GSHPX）基因mRNA表達(dá)相對(duì)量均顯著高于對(duì)照組（圖10）。

圖9　HDN對(duì)肝組織抗氧化物酶活力的影響（ABC分別為CAT、GSH-PX、SOD）Fig.9 Effects of HDN on the activity of antioxidant enzymes in the livers.A：GSH-PX.B：SOD.C：CAT.

圖10　HDN對(duì)肝組織抗氧化物酶基因mRNA表達(dá)的影響Fig.10 Effects of HDN on the antioxidant enzyme gene mRNA expression in the livers

3　討論

機(jī)體正常生理狀態(tài)下，紅細(xì)胞膜上蛋白酶分子易受自由基攻擊，造成紅細(xì)胞膜氧化損傷，膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白酶活性下降，紅細(xì)胞膜完整性被破壞，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血［9］。王垣芳等［10］研究櫻桃葉黃酮體外抗氧化活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著黃酮濃度的升高，抑制紅細(xì)胞氧化溶血的作用越強(qiáng)，其抑制率達(dá)到79%，而姜云云等［11］研究也得到一致結(jié)論，蘆筍中分離出的黃酮苷單體有很強(qiáng)的抑制紅細(xì)胞氧化溶血的活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HDN能明顯降低小鼠紅細(xì)胞溶血率，緩解紅細(xì)胞氧化溶血，隨HDN劑量提高抑制細(xì)胞溶血作用增強(qiáng)，結(jié)果表明HDN對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激有一定保護(hù)作用。

線粒體是氧化磷酸化作用的主要場(chǎng)所，機(jī)體正常情況下只有小部分的氧被還原成為超氧陰離子自由基（O2-·），但在異?；虿±頎顟B(tài)下線粒體受到損傷，可產(chǎn)生大量的O2-·和·OH等物質(zhì)，引起細(xì)胞功能變化，誘發(fā)多種疾?。?2］。研究認(rèn)為，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道的異常開放可引起線粒體腫脹，表現(xiàn)線粒體吸光度降低，通過檢測(cè)其吸光度值可分析評(píng)價(jià)線粒體腫脹度［13］。呂靜［14］對(duì)荷葉黃酮抗氧化的研究表明，荷葉黃酮對(duì)VC-FeSO4系統(tǒng)誘導(dǎo)的肝線粒體腫脹有很好的抑制作用，并存在量效關(guān)系，最小吸光度值在0.2左右。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果HDN能較好清除三種自由基（O2-·、·OH和DPPH·），隨HDN劑量提高和與線粒體作用時(shí)間延長(zhǎng)，HDN顯著抑制線粒體腫脹，保護(hù)其免受自由基攻擊。

脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量可直接反應(yīng)機(jī)體受自由基攻擊的程度，是一種可用于衡量自由基代謝程度的重要指標(biāo)。婁桂予等［15］報(bào)道采用家兔高脂飲食構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDN可抑制家兔血清中MDA和NO生成。EISayed等［16］通過給成年雄性大鼠口服丙烯腈（CAN）構(gòu)建氧化損傷模型，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HDN處理組的大鼠組織中MDA含量明顯降低，GSH-PX和SOD活力明顯提高。有研究發(fā)現(xiàn)HDN能明顯緩解和恢復(fù)由角叉萊膠引發(fā)的大鼠脂質(zhì)過氧化物（LPO）增多、抗氧化因子谷胱甘肽（GSH）減少和SOD活力降低等［17］。2010年Chen等［18］研究發(fā)現(xiàn)HDN能顯著降低人肝細(xì)胞氧化應(yīng)激后的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物水平。

過氧化氫酶（CAT）主要功能是參與活性氧代謝過程，它與SOD、POD組成了一個(gè)清除自由基的級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系，在清除自由基和保護(hù)機(jī)體免受損傷方面具有重要的作用［19］。超氧化物歧化酶（SOD）是一類金屬酶，根據(jù)活性中心結(jié)合的金屬離子不同，SOD主要分為Cu/Zn-SOD和Mn-SOD兩類，它能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，再經(jīng)過CAT作用轉(zhuǎn)化為水和氧氣，從而達(dá)到清除超氧陰離子自由基的目的［20-21］。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）能夠催化谷胱甘肽清除生物體內(nèi)有害自由基（主要是氧自由基）或脂質(zhì)過氧化物，從而抑制自由基的生成［22］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果HDN能明顯降低組織中MDA水平，提高肝腎及血液中三種抗氧化物酶（SOD、CAT、GSH-PX）活力。蔣守群［23］研究大豆異黃酮（GEN）對(duì)嶺南黃羽肉雞骨骼肌細(xì)胞GSH-PX影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)液中添加GEN后，細(xì)胞抗氧化能力增強(qiáng)，細(xì)胞中GSH-PX mRNA表達(dá)上調(diào)。陽坦［24］研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽提取物能夠提高山羊肌細(xì)胞中抗氧化酶（GSH-PX、CAT和SOD）基因表達(dá)，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝腎組織抗氧化物酶基因表達(dá)水平上調(diào)，結(jié)果與前人報(bào)道一致。

綜上所述，本研究結(jié)果表明HDN能顯著清除自由基，抑制紅細(xì)胞溶血和線粒體腫脹，降低組織脂質(zhì)過氧化，提高抗氧化物酶活力和基因水平表達(dá)，提示HDN具有良好的抗氧化作用，其作用機(jī)制可能是通過提高抗氧化酶基因表達(dá)調(diào)控抗氧化作用。

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Effect of hesperidin on the antioxidant activity and antioxidant enzyme gene expression in mice

TIAN Mei-jie，SUN Ying-jian*，GUAN Jia-yi，SHEN Hong*
（College of Animal Science and Technology，Beijing University of Agriculture/ Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Veterinary Medicine，Beijing 102206，China）

【Abstract】Objective The aim of this study was to investigate the effects of hesperidin（HDN）on antioxidant activity in mice.Methods HDN scavenging free radicals was detected by spectrophotometry，inhibition of mitochondrial swelling was detected by pyrogallol autoxidation，and erythrocyte hemolysis was detected by Fe2+phenanthroline.The mice were fed with HDN at different concentrations（0，80，160，320 mg/kg）by gastric gavage for 12 days.ELISA and spectrophotometric methods were used to assay the amount of MDA in mouse liver and kidney tissues and the activity of antioxidant enzymes（SOD，CAT，GSH-PX），and the antioxidant enzyme gene mRNA expression was analyzed by RT-PCR.Results Compared with the control group，the radical（·OH，O2-·，DPPH·）clearance rate was significantly increased in the HDN groups.There was a significant decrease of oxidative hemolysis of erythrocytes and mitochondrial swelling in vitro. MDA content in the mouse liver and kidney tissues and serum showed a decrease，and the activity of antioxidant enzymes （SOD，CAT，GSH-PX）in the HDN group was significantly higher than that in the control group.There was an up-regulation of mRNA expression of antioxidant enzyme in mouse liver and kidney tissues.Conclusions The results showed that HDN can eliminate free radicals，reduce cell oxidative damage caused by free radicals，inhibit superoxide production，upregulate antioxidant enzyme gene expression and enhance their enzyme activity，thus showing a good antioxidant effect.

【Key words】Hesperidin；Antioxidant enzymes；Gene expression

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）02-0150-08

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.008

［基金項(xiàng)目］北京市教委項(xiàng)目（PXM2013014207000067和 KM201410020005），北京農(nóng)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)科研能力提升工程項(xiàng)目（KCT2014012）。

［作者簡(jiǎn)介］田美杰（1990-），女，碩士研究生，專業(yè)：獸醫(yī)藥理，Email：763746834@qq.com。

［通訊作者］沈紅（1961-），女，研究方向：免疫藥理。Email：shenhong921@sina.com。孫英?。?970-），女，研究方向：中獸藥藥理與毒理。Email：yjsun51@sina.com

Corresponding author：SHEN Hong，E-mail：shenhong921@sina.com；SUN Ying-jian，Email：yjsun@sina.com

［收稿日期］2015-09-11