王羽凝，穆麗華，王 石，魏沛沛，王 茹，劉 屏（.解放軍總醫(yī)院外科臨床部，北京 008；.解放軍總醫(yī)院臨床藥理研究室，北京 008；.解放軍醫(yī)學院，北京 008；.蚌埠醫(yī)學院，安徽 蚌埠 00；.解放軍總醫(yī)院門診藥房，北京 008）

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·實驗研究·

RP-HPLC法同時測定芍棗膠囊中3種主要成分的含量

王羽凝1，穆麗華2，王 石3，魏沛沛4，王 茹5，劉 屏2（1.解放軍總醫(yī)院外科臨床部，北京 100853；2.解放軍總醫(yī)院臨床藥理研究室，北京 100853；3.解放軍醫(yī)學院，北京 100853；4.蚌埠醫(yī)學院，安徽 蚌埠 233003；5.解放軍總醫(yī)院門診藥房，北京 100853）

[摘要]目的：建立同時測定芍棗膠囊中3種主要成分的RP-HPLC方法。方法：采用RP-HPLC 法，選用Kromasil C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動相：乙腈（A）和水（B）；洗脫梯度：0～10 min 10%～19% A，10～16 min 19%～20% A，16～22 min 20%～90% A，22～25 min 90% A，25～25.1 min 90%～10% A，25.1～35 min 10% A；流速：0.8 mL·min-1。Alltech 2000ES ELSD檢測器，漂移管溫度：115 ℃，空氣流速3.3 L·min-1。結(jié)果：結(jié)果表明芍藥苷，斯皮諾素，3,6'-二芥子?；崽堑臋z測分別在0.975～5.850 μg，0.060～0.660 μg，0.100～0.600 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。上述3種成分的平均回收率（n = 9）分別為99.5% （RSD 0.69%），100.2%（RSD 1.03%），99.9%（RSD 1.20%）。結(jié)論：該方法操作簡單、結(jié)果準確，具有較好的重復性和穩(wěn)定性，為芍棗膠囊的質(zhì)量控制提供理論參考。

[關(guān)鍵詞]芍棗膠囊；芍藥苷；斯皮諾素；3,6'-二芥子?；崽?；反相高效液相色譜法

1　儀器與試藥

Hitachi高效液相色譜儀（日本日立公司），Alltech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器（美國奧泰公司）、梅特勒-托利多AG285型電子天平（瑞士梅特勒公司），KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。芍藥苷對照品（純度：98%，批號110736-201539），斯皮諾素對照品（純度：98%，批號111869-201203）均購自中國食品藥品檢定研究院；3,6'-二芥子?；崽菍φ掌罚ń夥跑娍傖t(yī)院藥理室自制，純度> 98%）。芍棗膠囊（解放軍總醫(yī)院自制，規(guī)格：0.34 g）。乙腈為色譜純，水為超純水；其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的配制

2.1.1對照品溶液 分別精密稱取芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子?；崽菍φ掌愤m量，分別甲醇溶解，配制成芍藥苷0.195 g ·L-1、斯皮諾素0.030 g·L-1、3,6'-二芥子酰基蔗糖0.050 g·L-1，各標準品取適量體積混合作為混合對照品,混合后芍藥苷的濃度為0.039 g·L-1，斯皮諾素0.012 g ·L-1，3,6'-二芥子?；崽?.020 g·L-1。

2.1.2供試品溶液 精密稱定本品內(nèi)容物0.300 0 g，加入70%乙醇適量，加熱回流2 h，濾過，濾渣甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.1.3陰性對照溶液 按處方中藥味的比例，分別稱取除白芍、酸棗仁、遠志外的其他藥材，按照芍棗膠囊的制備工藝和供試品溶液的制備方法分別制備白芍、酸棗仁、遠志的陰性對照溶液。

2.2色譜條件

Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）和水（B）；洗脫梯度：0～10 min 10%～19% A，10～16 min 19%～20% A，16～22 min 20%～90% A，22～25 min 90% A，25～25.1 min 90%～10% A，25.1～35 min 10% A；流速：0.8 mL ·min-1。Alltech 2000ES ELSD檢測器，漂移管溫度：115 ℃；空氣流速：3.3 L·min-1；進樣量：10 μL。

按照上述色譜條件進行測定，結(jié)果顯示芍藥苷，斯皮諾素，3,6'-二芥子?；崽堑纳V峰得到很好的分離，陰性對照品對樣品測定無干擾，待測組分與相鄰組分均達到基線分離，各成分理論塔板數(shù)不低于3000，分離度良好，詳見圖1。

圖1　HPLC 色譜圖A–芍棗膠囊供試品，B–對照品，C–白芍陰性對照，D–酸棗仁陰性對照，E–遠志陰性對照；1–芍藥苷，2–斯皮諾素，3–3,6'-二芥子?；崽荈ig 1 HPLC ChromatogramsA–sample, B–reference substance, C–Baishao negative control, D–Suanzaoren negative control, E–Yuanzhi negative control; 1–paeoniforin，2 - spinosin，3 - 3，6'-disinapoyl sucrose

2.3線性關(guān)系考察

按“2.2”項下色譜條件，分別精密吸取芍藥苷對照品溶液5、10、15、20、25、30 μL，斯皮諾素對照品溶液2、6、10、14、18、22 μL，3,6'-二芥子?；崽菍φ掌啡芤?、4、6、8、10、12 μL注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以進樣量的常對數(shù)為橫坐標（X），以峰面積的常對數(shù)為縱坐標（Y），計算芍藥苷、斯皮諾素和3,6'-二芥子?；崽堑幕貧w方程分別為Y = 0.996 X + 5.435，r = 0.999 9；Y = 1.009 X + 4.305，r = 0.999 9；Y = 1.007 X + 4.824，r = 0.998 9。結(jié)果表明，芍藥苷，斯皮諾素，3,6'-二芥子?；崽欠謩e在0.975～5.850 μg，0.060～0.660 μg，0.100～0.600 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4精密度實驗

精密吸取同一濃度的對照品溶液10 μL，按“2.2”項下色譜條件，重復進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子酰基蔗糖峰面積的RSD分別為0.71%、0.94%、0.86%，表明儀器精密度良好。

2.5穩(wěn)定性實驗

按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件，分別在0、2、8、12、24 h進樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果顯示，芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子酰基蔗糖峰面積的RSD分別為0.92%、1.21%、1.63%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6重復性實驗

精密稱取芍棗膠囊6份，按“2.1.2”項下制備供試品溶液6份，分別按“2.2”項下色譜條件，分別進樣10 μL，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果顯示，芍藥苷、斯皮諾素和3,6'-二芥子?；崽瞧骄糠謩e為23.602、0.880、0.621 mg·g-1，RSD分別為1.32%、0.91%、1.26%，表明該方法重復性良好。

2.7加樣回收率實驗

精密稱取9份已知含量的同一批芍棗膠囊，分別加入適量芍藥苷、斯皮諾素和3,6'-二芥子?；崽菍φ掌啡芤?，按“2.1.2”項下制備供試液，進樣10 μL，記錄峰面積，計算各對照品的加樣回收率。結(jié)果表明，芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子酰基蔗糖的平均回收率分別為99.5%、100.2%、99.9%，RSD分別為0.69%、1.03%、1.20%。詳見表1。

2.8樣品含量測定

按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別對4批次芍棗膠囊中芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子酰基蔗糖的含量進行分析，記錄色譜峰面積，根據(jù)回歸方程計算各組分含量，詳見表2。

3　討論

3.1色譜條件選擇

芍棗膠囊中的芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子?；崽堑淖畲笞贤馕詹ㄩL差別較大，使二極管陣列檢測器很難同時測定3種主要成分，而蒸發(fā)光散射檢測器為質(zhì)量型檢測器，流動相在檢測前即已蒸發(fā)，因此提高了其基線的穩(wěn)定性和檢測的準確性。本課題組曾嘗試采等度洗脫，但分離效果不夠理想，在篩選了多個梯度流動相之后，最終選定乙腈（A）和水（B）作為流動組，洗脫梯度：0～10 min 10%～19% A；10～16 min 19%～20% A；16～22 min 20%～90% A；22～25 min 90% A；25～25.1 min 90%～10% A；25.1～35 min 10% A。在此色譜條件下，色譜圖結(jié)果顯示基線平穩(wěn)，雜質(zhì)峰少，分離度良好。霧化氣體流速和漂移管溫度是蒸發(fā)光散射檢測器的兩個重要可調(diào)節(jié)參數(shù)。實驗中經(jīng)過反復、仔細調(diào)節(jié)參數(shù)，得到了最優(yōu)信噪比及平穩(wěn)基線。

表1　芍棗膠囊加樣回收率實驗結(jié)果. n = 9Tab 1 Results of recovery test of Shaozao capsules. n = 9

表2　芍棗膠囊樣品含量測定結(jié)果. mg·g-1Tab 2 Content determination of Shaozao capsules sample. mg·g-1

3.2提取方法考察

提取方法的選擇對比了超聲和回流提取方法，結(jié)果顯示加熱回流提取法的效果更佳，并且耗時短、操作方便。溶媒的選擇考察了甲醇、95%乙醇、70%乙醇、水，結(jié)果顯示70%乙醇提取效果最好。隨后考察了溶劑量（1∶10，1∶50，1∶100）和提取次數(shù)，結(jié)果表明，50倍量的70%乙醇，加熱回流提取2 h，可提取完全。

3.3結(jié)果分析

含量測定結(jié)果表明，不同批次之間相同指標成分含量差異不明顯，表明提取工藝穩(wěn)定、可靠。本研究建立了同時測定芍棗膠囊中芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子?；崽堑姆聪喔咝б合嗌V測定方法，為芍棗膠囊的質(zhì)量控制提供了理論參考。

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Determination of three main constituents in Shaozao capsules by RP-HPLC

WANG Yu-ning1, MU Li-hua2, WANG Shi3, WEI Pei-pei4, WANG Ru5, LIU Ping2(1. Clinical Surgery Division, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2. Department of Clinical Pharmacology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 3. Medical School of Chinese PLA, Beijing 100853, China; 4. Faculty of Pharmacy, Bengbu Medical College, Bengbu 233003, China; 5. Outpatient Pharmacy, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

[ABSTRACT]Objective: To establish the quantitative method of three main constituents in Shaozao capsules by RPHPLC method. Methods: The separation was performed on Kromasil C18column （4.6 mm × 250 mm，5 μm） by RP-HPLC method. The mobile phase consisted of acetonitrile (A) and water (B), elution gradient was as follows: 0–10 min 10%–19% A; 10–16 min 19%–20% A; 16–22 min 20%–90% A; 22–25 min 90% A; 25–25.1 min 90%–10% A; 25.1–35 min 10% A. The flow rate was 0.8 mL ·min-1. The detector was Alltech 2000ES ELSD. The temperature of drift tube was 115 ℃ and the air flow rate was 3.3 L·min-1. Results: The linear ranges of the three components were 0.975–5.850 μg (paeoniflorin), 0.060–0.660 μg （spinosin） and 0.100–0.600 μg （3，6'-disinapoyl sucrose) respectively. The average recoveries of the above three components in Shaozao capsules were 99.5% (RSD 0.69%), 100.2% (RSD 1.03%), 99.9% (RSD 1.20%) respectively. Conclusion: The method was reliable, simple, and precise, which was suitable for quality control of Shaozao capsules.

[KEY WORDS]Shaozao capsules；Paeoniforin；Spinosin；3，6'-disinapoyl sucrose; RP-HPLC

[中圖分類號]R917

[文獻標識碼]A

[文章編號]1672–8157(2016)02–0077–04

[基金項目]軍隊“十二五”中醫(yī)藥推廣研發(fā)項目（10ZYZ141）

[通信作者]劉屏，女，研究員，主要從事中藥化學和中藥藥理研究。E-mail：liuping301@126.com

[作者簡介]王羽凝，女，主管藥師，主要從事中藥藥理和中藥化學研究。E-mail：sunny_5087@163.com

收稿日期：（2015-11-21 修回日期：2016-01-12）