王 磊，劉貴棟，劉 麗，劉玉婕，婁宏君，齊 超，肖洪彬*，遲文成

1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

2. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)電氣工程及自動(dòng)化學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001

健康和糖尿病大鼠紅細(xì)胞熒光光譜非線性程度差異

王 磊1，劉貴棟2*，劉 麗1，劉玉婕1，婁宏君1，齊 超2，肖洪彬1*，遲文成1

1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

2. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)電氣工程及自動(dòng)化學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001

糖尿病是嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病之一，對(duì)其進(jìn)行早期診斷尤為重要。由于糖尿病病程的發(fā)展會(huì)對(duì)血液中紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響，因此利用紅細(xì)胞熒光光譜在特征峰位和峰高等方面的差異性，可以對(duì)糖尿病狀態(tài)進(jìn)行診斷。在選取光譜信號(hào)的差異性作為特征向量方面，可以采用熒光光譜信號(hào)的非線性程度作為特征向量。為更好地描述熒光光譜信號(hào)的非線性，采用延遲向量方差(DVV)法描述信號(hào)的非線性程度。采用迭代幅度匹配傅里葉變換(IAAFT)法產(chǎn)生原始數(shù)據(jù)的替代數(shù)據(jù)，通過比較原始數(shù)據(jù)與替代數(shù)據(jù)的延遲向量方差確定原始數(shù)據(jù)的非線性特征。以原始數(shù)據(jù)目標(biāo)方差為橫坐標(biāo)，以其替代數(shù)據(jù)目標(biāo)方差為縱坐標(biāo)，畫出延遲向量方差散布圖。健康大鼠紅細(xì)胞熒光光譜的延遲向量方差散布圖與其對(duì)角線幾乎重合，說明健康大鼠紅細(xì)胞熒光光譜非線性程度較低；而糖尿病大鼠紅細(xì)胞熒光光譜的延遲向量方差散布圖偏離其對(duì)角線，說明糖尿病大鼠紅細(xì)胞熒光光譜非線性程度較高，并且氨基酸對(duì)應(yīng)的光譜段非線性程度更深。據(jù)此，提出健康和糖尿病熒光光譜之間的非線性差異程度可以作為糖尿病早期診斷的特征之一。

糖尿??；紅細(xì)胞；熒光光譜；延遲向量方差

引 言

糖尿病是世界三大嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。目前全世界糖尿病患者已達(dá)3億，其中95%的患者為Ⅱ型糖尿病患者。對(duì)糖尿病的早診斷、早治療至關(guān)重要。糖尿病病程發(fā)展伴隨著血糖、血脂等物質(zhì)的代謝紊亂，在此過程中不規(guī)則的代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)血細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響，而血液中含量最多的細(xì)胞就是紅細(xì)胞，因此紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的變化可以反映糖尿病對(duì)細(xì)胞的破壞作用，從而為診斷和治療糖尿病提供輔助依據(jù)。研究表明，利用紅細(xì)胞熒光光譜在特征峰位和峰高的差異可以輔助診斷高黏血癥[1]。因此，糖尿病狀態(tài)下和健康狀態(tài)下紅細(xì)胞熒光光譜存在的差異也可以作為輔助診斷糖尿病的依據(jù)。在利用信號(hào)差異作為特征量方面，可以利用信號(hào)的非線性特征作為特征量[2]。在描述信號(hào)非線性特征方面，延遲向量方差(DVV)法[3]是描述信號(hào)非線性特征的有效方法，該方法通過比較被測(cè)信號(hào)與其替代數(shù)據(jù)的方差確定被測(cè)信號(hào)的非線性特征。利用DVV法分析糖尿病和健康大鼠紅細(xì)胞熒光光譜非線性程度的差異，從而為糖尿病的早期診斷和治療提供輔助依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

實(shí)驗(yàn)所用熒光分光光度計(jì)是日本島津公司生產(chǎn)的RF-5301PC，以氙燈為激發(fā)光源，掃描范圍為300～700 nm，激發(fā)光狹縫寬度和發(fā)射光狹縫寬度均為1.5 nm。以440 nm波長(zhǎng)為激發(fā)光，測(cè)量健康大鼠和糖尿病大鼠紅細(xì)胞熒光光譜。每檢測(cè)一份樣品后，用95%乙醇和去離子水洗滌樣品池。

1.2 樣品制備

采用Srinivasan的STZ造模法[4]對(duì)雄性SD大鼠進(jìn)行Ⅱ型糖尿病模型的誘導(dǎo)。雄性SD大鼠共30只，平均體重為200 g，隨機(jī)分為2組：糖尿病模型組和健康對(duì)照組。

STZ模型誘導(dǎo)：對(duì)SD大鼠每日給予高脂飼料(脂肪含量占58%、蛋白質(zhì)25%、其余組成為碳水化合物)誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為30天，隨后給予小劑量STZ(35 mg·kg-1)腹腔注射。注射7日后，測(cè)量大鼠空腹血糖值，糖尿病模型組大鼠空腹血糖顯著高于對(duì)照組，分別為(17.1±0.5)mmol·L-1和(5.1±0.2)mmol·L-1，隨機(jī)血糖也顯著高于對(duì)照組，提示造模成功。

紅細(xì)胞懸浮液制備：實(shí)驗(yàn)所用血液樣品來自糖尿病組和健康組大鼠，經(jīng)眼眶取血，取出一部分加5%肝素抗凝獲得全血溶液，加入適量生理鹽水，經(jīng)3 000 r·min-1的高速分離機(jī)離心10 min，加入pH 為 7.4，0.01 mol·L-1的PBS緩沖液(Biotopped Life Science公司)重懸、洗滌以去除棕黃色血膜層和血清層，洗滌3次，分離出純凈的紅細(xì)胞溶液待用。

1.3 數(shù)據(jù)分析

延遲向量方差法是建立在替代數(shù)據(jù)法的基礎(chǔ)上的。替代數(shù)據(jù)法由Theiler等[5]提出，其主要思想是首先指定某種線性隨機(jī)過程為零假設(shè)，并依據(jù)該假設(shè)產(chǎn)生相應(yīng)一組替代數(shù)據(jù)，然后分別計(jì)算比較原始數(shù)據(jù)和替代數(shù)據(jù)集的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，如果原始數(shù)據(jù)算得的值與替代數(shù)據(jù)集的值有顯著差異，則拒絕該零假設(shè)，說明原始數(shù)據(jù)中存在非線性成分。產(chǎn)生替代數(shù)據(jù)的方法主要有隨機(jī)相位(PR)法和迭代幅度匹配傅里葉變換(IAAFT)法。IAAFT法產(chǎn)生的替代數(shù)據(jù)更接近原始數(shù)據(jù)，因此采用IAAFT法產(chǎn)生替代數(shù)據(jù)。Gautama等[3]提出的延遲向量方差法通過比較原始數(shù)據(jù)及其替代數(shù)據(jù)的延遲向量方差確定原始數(shù)據(jù)的非線性特征。該方法以標(biāo)準(zhǔn)距離為橫坐標(biāo)，目標(biāo)方差為縱坐標(biāo)得到原始數(shù)據(jù)及替代數(shù)據(jù)在不同標(biāo)準(zhǔn)距離下的DVV分布圖。如果數(shù)據(jù)是非線性的，原始數(shù)據(jù)與替代數(shù)據(jù)的DVV分布圖應(yīng)有偏差。若以原始數(shù)據(jù)目標(biāo)方差為橫坐標(biāo)，以其替代數(shù)據(jù)目標(biāo)方差為縱坐標(biāo)，可以得到更為直觀的DVV散布圖。如果DVV散布圖曲線與其對(duì)角線重合，說明原始數(shù)據(jù)是線性的；反之，DVV散布圖曲線偏離對(duì)角線，說明原始數(shù)據(jù)是非線性的。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜分析

用440 nm激發(fā)光檢測(cè)紅細(xì)胞樣品，得到健康組、糖尿病組紅細(xì)胞典型熒光光譜如圖1所示。從圖中可以看出，對(duì)于正常紅細(xì)胞，在300～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，存在兩個(gè)熒光特征峰，峰位分別在340和690 nm處，兩個(gè)峰的強(qiáng)度之比約為1.91。而對(duì)于糖尿病紅細(xì)胞，在300～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，也存在兩個(gè)熒光特征峰，峰位分別在329和673 nm處，兩個(gè)峰的強(qiáng)度之比約為0.57。健康紅細(xì)胞在690 nm處的熒光峰非常弱，而糖尿病紅細(xì)胞在673 nm處熒光峰較強(qiáng)。糖尿病紅細(xì)胞熒光峰與健康紅細(xì)胞熒光峰相比，出現(xiàn)藍(lán)移。340 nm處的熒光峰是氨基酸的特征峰，而690 nm處的熒光峰為卟啉類物質(zhì)的特征峰。熒光光譜圖說明，糖尿病大鼠紅細(xì)胞中氨基酸含量稍微高于健康紅細(xì)胞中氨基酸含量，而卟啉含量明顯高于健康大鼠。由于卟啉是合成血紅蛋白的重要原料，糖尿病狀態(tài)下，血紅素合成代謝異常，導(dǎo)致大量卟啉不能與鐵結(jié)合，卟啉堆積。

圖1 大鼠紅細(xì)胞熒光光譜

2.2 光譜非線性程度差異

圖2為利用DVV散布圖法分析健康和糖尿病大鼠紅細(xì)胞熒光光譜的非線性結(jié)果。由圖2(a)和(b)可見，健康大鼠的DVV散布圖曲線與對(duì)角線偏差較小，說明所分析信號(hào)的非線性程度較低。由圖2(c)和(d)可見，糖尿病大鼠DVV散布圖曲線明顯偏離對(duì)角線，說明糖尿病大鼠紅細(xì)胞熒光信號(hào)非線性程度較高。比較圖2(c)和(d)可知，300～435 nm段散布圖曲線偏離對(duì)角線更多，說明該段熒光光譜非線性程度更高。300～435 nm段光譜反映了紅細(xì)胞氨基酸含量改變的情況，由此可知，糖尿病紅細(xì)胞氨基酸含量的變化出現(xiàn)非線性。健康組和糖尿病組30只大鼠的紅細(xì)胞熒光光譜都具有上述特點(diǎn)。由于成熟紅細(xì)胞內(nèi)不存在蛋白質(zhì)的合成代謝過程，氨基酸含量的變化很可能反映了紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的變化，其非線性程度加深進(jìn)一步說明了紅細(xì)胞膜正常的結(jié)構(gòu)和功能已被打破。健康大鼠和糖尿病大鼠300～435 nm段光譜的散布圖曲線差異明顯，因此該段光譜的非線性特征可以作為輔助診斷糖尿病的特征之一。

圖2 健康大鼠和糖尿病大鼠紅細(xì)胞熒光光譜非線性分析結(jié)果

3 結(jié) 論

利用延遲向量方差法研究了健康大鼠和糖尿病大鼠紅細(xì)胞熒光光譜信號(hào)的非線性程度差異。研究結(jié)果表明，糖尿病大鼠紅細(xì)胞光譜信號(hào)非線性程度比健康大鼠紅細(xì)胞光譜信號(hào)高，尤其是氨基酸所對(duì)應(yīng)的光譜信號(hào)非線性程度更高。因此，通過DVV法得到的熒光光譜的非線性特征可以作為糖尿病輔助診斷的依據(jù)。

[1] ZHAO Yan, CHEN Li-na, ZHANG Liang-cai, et al(趙 妍，陳麗娜，張良才，等). Journal of Harbin Medical University(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)), 2008, 42(3): 224.

[2] David J C, Frederick M B, Kenneth R L, et al. IEEE Trans. on Biomedical Engineering, 1995, 42(4):411.

[3] Gautama T, Mandic D P, Marc M. IEEE Trans. on Biomedical Engineering, 2004, 51(5): 728.

[4] Srinivasan K, Viswanad B Lydia Asrat. Pharmacological Research, 2005, 52: 313.

[5] Schreiber T, Schmitz A. Physica D, 2000, 142(3): 346.

(Received Jun. 26, 2015; accepted Oct. 30, 2015)

*Corresponding authors

Difference of Nonlinear Degree between Healthy and Diabetic Rat Erythocyte Fluorescence Spectrum

WANG Lei1, LIU Gui-dong2*, LIU Li1, LIU Yu-jie1, LOU Hong-jun1, QI Chao2, XIAO Hong-bin1*, CHI Wen-cheng1

1. Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

2. School of Electrical Engineering and Automation, Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, China

Diabetes mellitus is one kind of chronic diseases which seriously threaten human health. It is very important to diagnose in the early stage. With the development of diabetes, the structure and function of erythrocyte in the blood will change. So the peak position and peak height of erythrocyte fluorescence spectrum are different. These differences can be used to determine the status of diabetes. In the selection of the difference of spectral signal as the feature vector, the nonlinear degree of fluorescence spectrum can be used as the feature vector. In order to describe the nonlinearity of the fluorescence spectrum signal, the nonlinear degree of the signal is described with the delay vector variance (DVV) method. By using the method of iterative amplitude adjusted Fourier transformation (IAAFT) to generate surrogate data of raw data, the nonlinear characteristic of the raw data is determined by comparing the DVV of the original data and the surrogate data. The variance of the original data is the horizontal coordinates, and the variance of the surrogate data is the longitudinal coordinates, thus the DVV scatter plot is drawn. The DVV scatter plot of healthy rat erythrocyte fluorescence spectrum is almost coincident with its diagonal, which means the nonlinear degree of healthy rat erythrocyte fluorescence spectrum is lower. The DVV scatter plot of diabetic rat erythrocyte fluorescence spectrum deviates from its diagonal, which means the nonlinear degree of healthy rat erythrocyte fluorescence spectrum is higher, also the corresponding amino acid spectrum nonlinearity is deeper. Therefore, it is proposed that the nonlinear difference between the healthy and diabetic fluorescence spectrum can be used as a feature of early diabetes diagnosis.

Diabetes; Erythrocyte; Fluorescence spectrum; Delay vector variance

2015-06-26，

2015-10-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173186, 61178066)資助

王 磊，1983年生，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士研究生 e-mail: 86832408@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: gtomasd@hit.edu.cn；hrbxiaohongbin@126.com

O433.4

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)10-3207-04