包華瓊孫 嵐伊宏亮 柴路維 楊學(xué)妞 丁 杰 蔡 敏

重慶市人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院附屬醫(yī)院，重慶市出生缺陷與生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶　400020）

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精子DNA損傷與男性精液常規(guī)質(zhì)量參數(shù)的關(guān)系*

包華瓊△**孫 嵐△伊宏亮 柴路維 楊學(xué)妞 丁 杰 蔡 敏

重慶市人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院附屬醫(yī)院，重慶市出生缺陷與生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶400020）

△共同第一作者

據(jù)報(bào)道， 近50年來男性精液質(zhì)量持續(xù)下降，不育癥的發(fā)病率越來越高，有10%的育齡夫婦患有不孕癥，其中約50%是丈夫精液質(zhì)量下降引起［1］。精液常規(guī)質(zhì)量分析雖是男性生育能力的主要評估指標(biāo)，但它在全面評價(jià)精子的受精能力等方面有一定局限性。近年來臨床研究表明：在特發(fā)性不育中，有近20%的患者有高水平的精子DNA損傷［2］。這說明精子DNA損傷可能是男性不育的重要因素之一。本研究通過分析精子DNA損傷率與精液常規(guī)質(zhì)量參數(shù)的相關(guān)性，探討精子DNA損傷檢測在男性不育診治中的臨床價(jià)值，為男性不育患者的診斷及治療提供依據(jù)。

材料與方法

一、研究對象

所有精液標(biāo)本于2012年5月至2014年12月在重慶計(jì)生醫(yī)院生殖中心和西南醫(yī)院生殖中心收集。隨機(jī)選取296例不育男性為實(shí)驗(yàn)組，40例正常生育男性為對照組，分別對兩組精液進(jìn)行常規(guī)質(zhì)量參數(shù)分析；用SCD法檢測精子DNA損傷率，并根據(jù)損傷程度（DNA損傷率＜25%，≥25%）將296例不育男性分為兩組。所有研究對象年齡在22～40歲，平均年齡（32.5±5.2）歲；無性功能障礙病史、無遺傳性疾病家族史及外傷，體檢未發(fā)現(xiàn)明顯的附睪、睪丸及輸精管異常；有隱睪癥、無精子癥、精索靜脈曲張、腮腺炎病史患者已排除。

二、精液標(biāo)本收集

所有精液收集和質(zhì)量檢查參照WHO第五版標(biāo)準(zhǔn)和操作程序［3 ，4］。男方禁欲2～7d，手淫法取全部精液于無菌取精杯中，置37℃水浴箱內(nèi)液化后充分混勻，采用計(jì)算機(jī)輔助精液分析檢測精液常規(guī)、動態(tài)及形態(tài)參數(shù)。

三、精子DNA損傷檢測

精子DNA 損傷檢測試劑盒購自深圳市博銳德生物科技有限公司。所有操作步驟參照試劑說明書進(jìn)行。

1. 精子標(biāo)本處理：新鮮精液行常規(guī)檢查后稀釋濃度為（5～10）×106/mL，取60μL 加入已熔化的易熔凝膠管中充分混勻，37℃孵育待用。

2. 變性處理：取30μL精子凝膠混合液包被于已預(yù)冷的載玻片上，置于2～8℃冰箱使其凝固，5min后小心移去蓋玻片，將載玻片立即垂直浸入反應(yīng)液A池，室溫反應(yīng)7min后，再將載玻片浸入反應(yīng)液B池中反應(yīng)25min；最后將載玻片水平浸入大量純化水中洗滌1～2次，每次5min。

3. 脫水、染色：將變性處理后的載玻片依次置于70%、90% 和100% 的梯度乙醇中脫水，各2min。待干燥后用瑞氏染液覆蓋，30s后緩慢加入瑞氏緩沖液，充分混勻。15min后流水沖洗，干燥備用。

4. 精子DNA損傷率計(jì)算：采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法（SCD）檢測原理，根據(jù)光暈的有無和大小判斷精子DNA損傷程度，顯微鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)精子。計(jì)算公式為：精子DNA損傷率（%）=存在DNA損傷精子數(shù)/被觀察精子總數(shù)×100%。精子DNA損傷率＜25%記為正常。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用 SPASS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料用（x±s）表示，行t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman法。

結(jié)　果

一、實(shí)驗(yàn)組與對照組精液參數(shù)比較

與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組不育男性精子DNA損傷率顯著升高，而前向運(yùn)動精子率、精子活動率顯著降低（P＜0.05）。兩組之間年齡、精液量、精子濃度、精子總數(shù)、精子正常形態(tài)率也有一定差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），（見表1）。

表1　實(shí)驗(yàn)組與對照組各項(xiàng)精液參數(shù)比較（±s）

表1　實(shí)驗(yàn)組與對照組各項(xiàng)精液參數(shù)比較（±s）

*與對照組相比，P＜0.05

項(xiàng)目　　對照組（n=40）　　實(shí)驗(yàn)組（n=296）年齡（歲）　33.5±5.5　32.4±4.9精液量（mL）　3.8±1.5　3.2±1.2精液濃度（×106/mL）　65.1±31.4　58.7±39.3精子總數(shù)（×106）　238.9±153.4　200.9±132.6前向運(yùn)動精子（%）　47.9±14.8　26.5±14.3*精子活動率（%）　68.6±10.7　42.2±12.7*精子正常形態(tài)率（%）　10.7±5.3　8.2±2.7精子DNA損傷率（%）　10.2±2.4　19.6±3.7*

二、精子DNA損傷程度與精子常規(guī)質(zhì)量參數(shù)的關(guān)系

296例不育男性中，按精子DNA損傷程度（DNA損傷率＜25%，≥25%）分為兩組。與＜25%組比較，≥25%組中男方的前向運(yùn)動精子率、正常形態(tài)率明顯降低（P＜0.05）；兩組之間年齡、精液量、精子濃度、精子總數(shù)、精子活動率也有一定差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），（見表2）。

表2　精子DNA損傷程度與精子常規(guī)質(zhì)量參數(shù)的關(guān)系

三、精子DNA碎片率與精子常規(guī)質(zhì)量參數(shù)相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：精子 DNA 損傷率與男方年齡呈正相關(guān)；與前向運(yùn)動精子率、正常形態(tài)率呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），（見表3）。

表3　精子DNA損傷率與精子常規(guī)質(zhì)量參數(shù)相關(guān)性分析

討　論

精液常規(guī)檢查是傳統(tǒng)診斷男性不育第一參考指標(biāo)，但有其局限性［4］。臨床研究發(fā)現(xiàn)：男性不育患者中有15%左右顯示精液常規(guī)質(zhì)量參數(shù)正常。近年來，精子DNA損傷作為一項(xiàng)新的評價(jià)精子功能的指標(biāo)，已逐漸應(yīng)用于男性不育癥的診療和研究中。精子DNA損傷會引起精子功能和受精能力下降，導(dǎo)致不孕不育［5， 14］。

在精子形成過程中，染色質(zhì)的核蛋白經(jīng)歷了從組蛋白-過渡蛋白-魚精蛋白的轉(zhuǎn)變，以維持精子DNA的完整性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組不育男性的精子DNA損傷率顯著升高，而前向運(yùn)動精子率、精子活動率顯著降低（P＜0.05）。這與Rybar［6］、Blumer等［7］的報(bào)道相一致。當(dāng)魚精蛋白合成缺陷或功能異常時(shí)，會造成精子染色質(zhì)濃縮過程異常，形成結(jié)構(gòu)松散的染色質(zhì)，引起精子DNA損傷［8， 15］。而這一系列的改變會直接導(dǎo)致精子線粒體功能損傷，從而引起前向運(yùn)動精子率減低，精子活力下降，引發(fā)男性不育［9］。另一方面，可能是由于精液中存在異常增多的白細(xì)胞可誘導(dǎo)精子產(chǎn)生過量的氧自由基，損傷精子膜的流動性和完整性，導(dǎo)致精子核DNA變性或斷裂，從而破壞精子功能［10］。綜上所述，精子DNA 損傷可使精子的運(yùn)動能力下降，活力降低，影響精子與卵子的結(jié)合，最終導(dǎo)致不育。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)：當(dāng)精子DNA損傷率≥25%時(shí)，前向運(yùn)動精子率、正常形態(tài)率均明顯降低（P＜0.05）；且相關(guān)性分析顯示，精子DNA損傷率與前向運(yùn)動精子率、正常形態(tài)率呈負(fù)相關(guān)。這首先可能是因?yàn)樵谖闯墒炀雍突尉拥募?xì)胞核內(nèi)含有大量的組蛋白，使得魚精蛋白含量降低，與DNA結(jié)合疏松，導(dǎo)致精子DNA損傷，活動率下降。其次，精子形態(tài)與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)［11， 12］。精液中的畸形精子是過量活性氧的主要來源，它們引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致精子DNA完整性損傷進(jìn)而產(chǎn)生更多的畸形精子，而這些畸形精子又會相應(yīng)的加重精子DNA的損傷。兩者之間相互影響，形成惡性循環(huán)。

另外，本研究中顯示精子DNA損傷率與男性年齡呈正相關(guān)。這提示隨著年齡的增長，由于氧化應(yīng)激或精子凋亡機(jī)制減退等原因，使得其自身無法有效清除DNA受損的精子［2， 13］。這可能是35歲以上男性生育能力逐漸下降的原因之一。

總之，精子DNA損傷檢測能夠揭示精子染色質(zhì)濃縮程度和精子成熟度等細(xì)微異常。將其作為精液常規(guī)質(zhì)量分析的補(bǔ)充，并結(jié)合其他精子功能指標(biāo)，更能全面客觀地評估男性生育力，這將對男性不育的病因?qū)W及治療方法產(chǎn)生深遠(yuǎn)的理論意義和臨床實(shí)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞精子； DNA損傷； 精液常規(guī)； 不育，男性

doi∶10.3969/j.issn.1008-0848.2016.02.012

參 考 文 獻(xiàn)

1 Chen SS ， Huang WJ. Differences in biochemical markers

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2曾蘭， 葉飛， 李運(yùn)星， 等. 精子DNA完整性與精液常規(guī)參數(shù)相關(guān)性分析. 中國計(jì)劃生育和婦產(chǎn)科 2014； 6（4）∶ 47-50

3谷翊群， 陳振文， 盧文紅， 等. 人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊（第五版）. 北京∶ 人民衛(wèi)生出版社， 2011∶ 10-35

4曹小蓉， 閆峰， 平萍， 等. 人類精子庫檔案信息管理系統(tǒng)及臨床應(yīng)用. 中國男科學(xué)雜志 2011；25（12）∶38-41

5陳俊清， 羅勝萍， 黃誠剛. 精漿活性氧水平與男性不育的相關(guān)性研究. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志 2011； 32（9）∶ 1002-1004

6Rybar R， Markova P， Veznik Z， et al. Sperm chromatin integrity in young men with no experiences of infertility and men from idiopathic infertility couples. Andrologia 2009； 41（3）∶ 141-149

7Blumer CG， Fariello RM， Restelli AE， et al. Sperm nuclear DNA fragmentation and mitochondrial activity in men with varicocele. Fertil Steril 2008； 90（5）∶ 1716-1722

8張歡， 鄭屹， 鄭九嘉， 等. 精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換對精子DNA損傷程度和精液參數(shù)的影響. 中國男科學(xué)雜志2015； 24（6）∶ 24-29

9陸杉， 倪運(yùn)萍， 劉娟， 等. 前向運(yùn)動精子數(shù)量對男性因素不孕者宮腔內(nèi)人工授精臨床妊娠率的影響. 重慶醫(yī)學(xué)2014； 23（8）∶ 2991-2993

10徐志鵬， 孫海翔， 張寧媛. 精子 DNA 損傷與輔助生殖技術(shù). 中華男科學(xué)雜志 2008； 14（3）∶ 259-263

11張洲， 師娟子， 邢俊平， 等. 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與精液常規(guī)參數(shù)、精子畸形率和DNA完整性的相關(guān)性. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào) 2010； 32（16）∶ 1788-1792

12Hauser R， Meeker JD， Singh NP， et al. DNA damage in human sperm is related to urinary levels of phthalate monoester and oxidative metabolites. Hum Reprod 2007；22（3）∶ 688-695

13Sakkas D， Alvarez JG. Sperm DNA fragmentation∶mechanisms of origin， impact on reproductive outcome，and analysis. Fertil Steril 2010； 93（4）∶ 1027-1036

14Osman A， Alsomait H， Seshadri， et al. Does the extent of sperm DNA fragmentation affect IVF or ICSI outcome∶a systematic review and meta analysis. Hum Reprod 2013；28 （supp 1）∶ i9-i12

15谷龍杰， 陳振文， 許劍鋒. 不育男性精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與精液常規(guī)參數(shù)的關(guān)系. 中國男科學(xué)雜志 2009； 23（3）∶ 29-32

（2015-08-10收稿）

*基金項(xiàng)目資助：重慶市科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc，2013ggB00001）；重慶市基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（2013cstc-jbky-01707）

中圖分類號R 321.33

**通訊作者，E-mail：baohuaqiong@163.com