胡春風 綜述 劉紅英 審校

濰坊醫(yī)學院生物科學與技術(shù)學院（濰坊　261053）

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CFTR基因多態(tài)性對男性生殖影響的研究進展

胡春風 綜述 劉紅英 審校

濰坊醫(yī)學院生物科學與技術(shù)學院（濰坊261053）

囊性纖維化（cystic fibrosis， CF）是白種人中常見的致死性常染色體隱性遺傳病，是由囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrisis transmembrane conductance regulator， CFTR）基因的突變引起的［1，2］，CFTR基因編碼的蛋白質(zhì)具有多種功能，包括cAMP依賴的氯離子通道，碳酸氫鹽的分泌和上皮細胞鈉通道的調(diào)節(jié)［3，4］。同時，CFTR也參與了先天性雙側(cè)輸精管缺如、梗阻性無精子癥和男性不育［5］。CFTR基因多態(tài)性導(dǎo)致的臨床疾病一直以來備受人們關(guān)注。通過對CFTR基因多態(tài)性引起疾病機制的深入研究，我們可以對攜帶這些遺傳病的夫婦在應(yīng)用輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology， ART）之前，先進行胚胎植入前遺傳學診斷（preimplantation genetic diagnosis， PGD）［6］，這將提高后代基因的健康率。本文主要綜述了CFTR基因多態(tài)性的研究進展。

一、CFTR的結(jié)構(gòu)

CFTR基因于1989年被Riordan等［7］首先克隆并鑒定，全長230kbp［8］，定位于人類7q31.2，有27個外顯子［9］（見表1），編碼一條含1480個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。

表1　CFTR編碼區(qū)外顯子情況［9］

CFTR是一種位于脂質(zhì)上皮細胞頂膜依賴cAMP調(diào)控的氯離子通道蛋白［10］，屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體（ATP-binding cassette transporter，ABC）家族的一種跨膜蛋白質(zhì)［11］。結(jié)構(gòu)上具有該家族成員的特征：兩個跨膜結(jié)構(gòu)域（membrane spanning domains，MSDs）MSD1和MSD2；兩個核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（nucleotide binding domains，NBDs）NBD1和NBD2；一個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域R domain（如圖1）?？缒そY(jié)構(gòu)域MSD1和MSD2共同構(gòu)成選擇性通道。正常情況下，該通道被陰離子或調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域R domain阻斷，當胞內(nèi)氯離子濃度升高時，高濃度氯離子激活cAMP依賴的蛋白激酶，通道打開，進而調(diào)節(jié)通道的開閉；另外，胞外的氯離子濃度也可影響通道的門控，它的濃度升高也可以促進通道的打開，CFTR允許氯離子雙向通透［12］。

圖1　CFTR氯離子通道推測的結(jié)構(gòu)模型［12］

CFTR廣泛存在于上皮組織如胰腺、腸道、汗腺、輸精管等多個器官中，胞內(nèi)定位于上皮細胞的頂膜［4］。在這些部位參與物質(zhì)和液體的分泌，維持管腔內(nèi)電解質(zhì)及內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡。

二、CFTR的功能與調(diào)節(jié)

CFTR氯離子通道的開放及關(guān)閉是通過細胞內(nèi)激酶和磷酸酶活性［13］的平衡以及細胞ATP水平嚴格控制的。CFTR的主要功能是調(diào)節(jié)cAMP依賴的氯離子跨膜轉(zhuǎn)運，cAMP水平的提高能夠激活蛋白激酶A（PKA），蛋白激酶A的活化將引起R domain中絲氨酸的磷酸化，這是CFTR被激活的先決條件［11，14，15］。一旦R domain被磷酸化，ATP隨之結(jié)合NBD2，當NBD1末端的磷酸基被剪切時，CFTR立體構(gòu)象發(fā)生改變，通道打開氯離子流出。隨后，NBD2的ATP被水解，促使通道還原到不活動狀態(tài)（見圖2）。由此可見，磷酸化后的CFTR氯離子通道需要ATP維持通道的開放和關(guān)閉。此外，有研究表明一種R domain缺失的CFTR突變，在ATP存在的情況下，并不依賴磷酸化而使通道開放或關(guān)閉，R domain與NBDs相互作用并調(diào)節(jié)其與ATP的親和力［12］。目前越來越多的研究結(jié)果支持氯離子濃度的變化會使CFTR的立體構(gòu)象改變，從而影響CFTR的磷酸化。

圖2　CFTR氯離子通道的門控機制模式圖

在正常上皮細胞中，CFTR通道開放，氯離子和鈉離子分別從細胞頂膜和細胞側(cè)面的通路先后離開細胞，隨后水分子也離開細胞。當CFTR結(jié)構(gòu)異常時，氯離子不能正常輸出，此時鈉離子、水分子的排出也受到阻滯，致使細胞外堆積更多的粘液，在一些器官（如胰腺、呼吸道）的腔道中形成栓塞。同時，細菌也會在黏液中寄生，造成感染，使嗜中性粒細胞釋放大量蛋白酶，進而引起免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［16］。長期的感染和炎癥最終造成病情的惡化，疾病晚期會出現(xiàn)器官功能衰竭等癥狀。研究CFTR在臨床疾病病理發(fā)生中的作用對于疾病的診斷和治療具有重要的應(yīng)用價值。

CFTR主要功能是調(diào)節(jié)上皮細胞頂膜cAMP依賴的氯離子跨膜轉(zhuǎn)運，此外CFTR還具有調(diào)節(jié)上皮細胞鈉離子通道，促進碳酸氫鹽分泌以及調(diào)節(jié)鉀通道［17］等功能，對體內(nèi)液體轉(zhuǎn)運起著至關(guān)重要的作用。但在突變的囊性纖維化細胞中，就不能激活這些氯離子通道了，因此可見CFTR的結(jié)構(gòu)功能在細胞膜離子轉(zhuǎn)運中的重要性并非一般。

三、CFTR基因多態(tài)性與囊性纖維化

（一）囊性纖維化

囊性纖維化（cystic fi brosis， CF）是白種人［18］中常見的致死性常染色體隱性遺傳病。CF在歐美新生兒的發(fā)病率為1/（2 000～3 000），我國則極為罕見［19］。田欣倫等［20］發(fā)現(xiàn)，中國人CF患者的CFTR基因突變類型與西方有很大差異，采用歐美國家CFTR基因的篩查突變譜很難發(fā)現(xiàn)中國的CF患者，因此西方醫(yī)生對中國CF患者的診斷也有困難。CF是由CFTR基因突變致其編碼的CFTR蛋白功能缺陷所引起的［19］?？蓪?dǎo)致黏液增多而致全身外分泌腺阻塞及功能紊亂。并累及肺臟、胰腺、肝臟及生殖系統(tǒng)等多個臟器，以呼吸系統(tǒng)損害最為突出［21］。近年來，對CF的治療取得了很大進展，特別是針對功能缺陷的CFTR蛋白進行靶向治療以及個性化治療［22］。

（二）CFTR基因突變類型

引起CFTR結(jié)構(gòu)變異的突變種類繁多，已有超過1900多種不同的CFTR基因突變類型，影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運、合成、運輸、CFTR的功能［11］。為更好的理解基因型及表型關(guān)系，近年研究者根據(jù)這些基因突變的分子機制及產(chǎn)生后果將突變的CFTR基因分為6類［18］：Ⅰ類和Ⅱ類突變的典型特征是使CFTR表達的數(shù)量減少。Ⅰ類突變即無義突變，由于移碼突變或錯義突變等出現(xiàn)新的終止密碼子（PTCs），產(chǎn)生不穩(wěn)定的mRNA，或是出現(xiàn)經(jīng)過刪減的，縮短的功能缺陷蛋白；Ⅱ類突變是CFTR折疊或成熟的缺陷，致使缺陷CFTR在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被過早的降解而不能被正確地運輸至頂膜處，包括CF最常見突變類型F508del［23］；然而，Ⅲ類和Ⅳ類突變主要表現(xiàn)為通道異常。Ⅲ類突變是破壞CFTR的調(diào)節(jié)區(qū)，使CFTR的磷酸化和與ATP結(jié)合不能正常進行，影響通道的激活； Ⅳ類突變的CFTR通道能打開及關(guān)閉，但其孔隙構(gòu)象的異常，導(dǎo)致氯離子的轉(zhuǎn)運降低；V類突變，RNA剪接異常，同時產(chǎn)生正常和異常的轉(zhuǎn)錄子，使正常CFTR蛋白數(shù)量減少；Ⅵ類突變是由于CFTR蛋白的C-末端截斷所致。

（三） CF基因突變體F508del

在德國最常見的CFTR基因突變體是△F508，位于外顯子Exonl0中三對堿基的缺失，即引發(fā)蛋白質(zhì)508F位點苯丙氨酸的編碼基因缺失［24］。此類突變體引起蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的異常折疊，當在核糖體內(nèi)合成的CFTR蛋白原轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面進行加工時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的泛素連接酶多酶復(fù)合體可以識別出，由于△F508缺陷基因的錯誤表達而被刪除的CFTR蛋白中的第二個MSD錯誤折疊結(jié)構(gòu)區(qū)域，然后多酶復(fù)合體將被錯誤表達的CFTR蛋白區(qū)域降解，從而使得CFTR蛋白無法照常運送到細胞膜中形成氯離子運輸通道［2］，即使其中有少數(shù)被正確翻譯的CFTR蛋白被運送到細胞膜中也不能使原本的氯離子通道有效形成，因此造成氯離子以及其他相關(guān)離子及小分子物質(zhì)（如鈉鉀離子等）運輸?shù)膰乐卣系K。

四、CFTR基因突變與生殖

研究表明，CFTR基因突變可使健康男性出現(xiàn)先天性雙側(cè)輸精管缺如、先天性單側(cè)輸精管缺如或精子質(zhì)量下降造成男性不育。先天性輸精管缺如（congenital absence of the vas deferens，CAVD）臨床上又分為先天性雙側(cè)輸精管缺如（congenital bilateral absence of the vas deferens，CBAVD）和先天性單側(cè)輸精管缺如（congenital unilateral absence of the vas deferens，CUAVD）。CUAVD患者多數(shù)同時合并無精子癥 ，其原因往往是除了缺如的一側(cè)輸精管病變外，對側(cè)生殖系存在先天性或后天感染等病理因素［25］。CBAVD目前普遍認為CFTR基因突變是其重要病因，M470V多態(tài)性為CFTR基因在外顯子10上323位點A→G多態(tài)導(dǎo)致的氨基酸替換，屬于錯義突變，堿基為A則編碼甲硫氨酸（Met），堿基為G則編碼纈氨酸（Val）。M470V多態(tài)性能影響CFTR蛋白氯離子通道內(nèi)在活性，同時也與生育能力相關(guān)，Met470相比Val470生育能力更低。曾國華等［26］應(yīng)用PCR-單鏈構(gòu)象多肽（PCR-SSCP）及DNA測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了CFTR基因的外顯子10上225位點C堿基的缺失，這是我國人群中首次發(fā)現(xiàn)CBAVD患者的CFTR基因突變，通過對該患者的睪丸超微結(jié)構(gòu)進行研究發(fā)現(xiàn)，精子細胞頭部畸形，胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)明顯顆粒狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)核內(nèi)空泡。精子細胞中段線粒體鞘部分或完全缺失。CBAVD對不育的影響也有睪丸的因素。CBAVD患者通常存在睪丸生精功能障礙，因此其治療的有效方法是應(yīng)用穿刺技術(shù)吸取精子結(jié)合卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）技術(shù)助孕。然而，Lu等［27］對實施ICSI的945例無精子癥患者的研究顯示，攜帶CFTR突變基因的CBAVD患者其輔助生殖下一代出現(xiàn)流產(chǎn)或死胎的概率更高。研究發(fā)現(xiàn)，女性CF患者伴有月經(jīng)失調(diào)，宮頸黏液增稠，精子獲能下降并影響CF女性的生育能力。

目前，在美國及一些歐洲國家，CFTR基因突變檢測已應(yīng)用于植入前遺傳學診斷（preimplantation genetic diagnosis， PGD），將CFTR基因突變篩查作為我國PGD的檢查項目，能挑選出攜帶健康CFTR基因的胚胎，對CAVD患者生育健康下一代具有一定的臨床意義。目前國內(nèi)外部分研究采取對CFTR全外顯子基因突變篩查［28］，但大多數(shù)研究實施的CFTR基因突變檢測只是檢測一些常見的突變位點，很可能造成漏檢。

五、研究前景

目前，人們對于CFTR基因多態(tài)性研究最多的是呼吸道和消化道的病變，而對于生殖系統(tǒng)的研究時間尚短。就CF而言，無論是中國還是西方醫(yī)生，都應(yīng)注意中國患者CFTR突變譜的特異性［20］，且不能忽視漏檢基因的存在，其次疾病發(fā)生的原因也并非單一，如發(fā)病的地域性，發(fā)病的輕重及個體差異。對不育癥的治療，最常用最有效的是ICSI技術(shù)，但也存在一定的問題，ICSI技術(shù)可能會將突變的CFTR基因不可避免的遺傳給后代，致使后代不育。因此，攜帶遺傳病的夫妻在進行ICSI技術(shù)之前，應(yīng)先進行胚胎種植前遺傳學診斷，若存在CFTR基因突變還需進行基因治療。

在基因治療方面，其效果遠沒有預(yù)期的好，加上一些器官（如肺）結(jié)構(gòu)復(fù)雜且難以靶向，目前基因治療尤其個性化治療還沒有根本上的突破?；蛟S可從表觀遺傳學、mRNA、蛋白質(zhì)的修飾加工方面考慮，找到更多更有效的治療方法?？傊谂R床工作中要提高對CFTR基因多態(tài)性的重視，盡可能多的尋找我國患者CFTR基因突變位點，臨床醫(yī)生應(yīng)多關(guān)注那些表型并不典型的患者，對他們進行更深入的診治。因此，我們應(yīng)該竭盡全力擴大調(diào)查人群的樣本量，建立適合我國國情的CFTR基因突變譜，以使更多患者得到及時的診斷和治療。期待CFTR基因多態(tài)性在疾病診斷和治療方面有新的突破。

致謝：本課題受國家計生委科研項目資助 （項目編號：C1-89）

關(guān)鍵詞囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子； 不育，男性；多態(tài)現(xiàn)象， 遺傳

doi∶10.3969/j.issn.1008-0848.2016.02.016

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（2015-12-05收稿）

中圖分類號R 698.2