李曼曼，溫丙言，朱河水，鐘　凱，楊國宇，王月影

(河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點開放實驗室，鄭州 450002)

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豬lipasin基因的克隆及其對肝細胞LPL基因轉(zhuǎn)錄的影響

李曼曼，溫丙言，朱河水，鐘凱，楊國宇，王月影*

(河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點開放實驗室，鄭州 450002)

摘要：旨在克隆豬lipasin基因，并檢測其對肝細胞LPL基因轉(zhuǎn)錄的影響。本試驗利用同源電子克隆技術(shù)克隆豬lipasin基因，構(gòu)建其真核表達載體轉(zhuǎn)入肝細胞，探討其對LPL基因轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果表明，成功克隆了豬lipasin基因，目的片段大小為615 bp，上傳至GenBank(登錄號：KF017598)，開放閱讀框為594 bp，編碼197個氨基酸，liapsin蛋白的分子量和等電點分別為21.99 ku和6.79；成功構(gòu)建了真核表達載體PB-EGFP-lipasin，實現(xiàn)lipasin基因在肝細胞中的過表達，與對照組相比，PB-EGFP-lipasin轉(zhuǎn)染的細胞中LPL基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。結(jié)果提示，豬lipasin可能通過抑制肝細胞LPL的轉(zhuǎn)錄影響脂代謝。

關(guān)鍵詞：lipasin；豬；克??；肝細胞；LPL

血管生成素樣蛋白(Angiopoietin-like proteins，ANGPTLs)家族包括7個成員，分別為ANGPTL1～ANGPTL7，由7種不同的基因編碼產(chǎn)生[1]。ANGPTLs結(jié)構(gòu)包含氨基端分泌蛋白的信號肽、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和羧基端纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域[1]，ANGPTLs的氨基端和羧基端結(jié)構(gòu)域有不同的功能，ANGPTL3的氨基端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和羧基端纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域分別參與脂代謝調(diào)節(jié)[2]和血管再生[3]。

脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase，LPL)是脂肪細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、乳腺細胞以及巨噬細胞等合成和分泌的一種糖蛋白，以同源二聚體形式保持LPL的活性。LPL可以將乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的甘油三酯分解，為脂肪、肌肉和心等組織提供游離脂肪酸。LPL還參與極低密度脂蛋白和高密度脂蛋白間的載脂蛋白和磷脂的轉(zhuǎn)換，載脂蛋白CⅡ的C端第61～79位氨基酸具有激活LPL的作用。LPL基因表達變化直接影響LPL功能，LPL基因表達異常能導致脂質(zhì)代謝紊亂，影響機體正常的生命活動。

研究表明，ANGPTL3和ANGPTL4在脂代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[4-6]。其作用機制為釋放N端功能區(qū)，以可逆或不可逆的方式干擾LPL二聚體的形成，進而抑制LPL的活性。lipasin蛋白的結(jié)構(gòu)與血管生成素蛋白家族相似，其結(jié)構(gòu)中包含氨基端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和羧基端纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域[7]，屬于ANGPTLs中的一員。將lipasin與7種ANGPTL蛋白的氨基端結(jié)構(gòu)域進行進化分析，發(fā)現(xiàn)lipasin與ANGPTL3親緣關(guān)系最近[8]。ANGPTL3能抑制LPL酶活性在脂代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，提示lipasin可能在脂代謝中發(fā)揮重要作用。研究表明，lipasin能抑制LPL的酶活性，從而降低體內(nèi)甘油三酯的分解，升高血清中甘油三酯的含量[9-10]。lipasin是新發(fā)現(xiàn)的一個脂代謝調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子[11]，有關(guān)豬lipasin基因的研究報道較少。本試驗根據(jù)GenBank已公布的人和鼠的lipasin序列，應(yīng)用同源電子克隆技術(shù)克隆豬lipasin基因，構(gòu)建其真核表達載體轉(zhuǎn)入肝細胞，探討其對LPL基因轉(zhuǎn)錄的影響，為進一步研究豬lipasin基因在脂代謝調(diào)節(jié)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

豬肝組織來自河南省開封市永康豬場，L-02肝細胞購自上海博谷生物有限公司。

1.2試劑與儀器

PB轉(zhuǎn)座子載體質(zhì)粒PB-CMV-Puro-EGFP(SBI公司)；限制性內(nèi)切酶(PstⅠ、NheⅠ、EcoR Ⅰ)、T4 DNA連接酶(NEB公司)；質(zhì)粒提取試劑盒、LA Taq酶、2×SYBR Master Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)；轉(zhuǎn)染試劑Turbofect(Thermo公司)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)、胎牛血清FBS(Gibco公司)；嘌呤霉素(Sigma公司)；E.coliDH5a感受態(tài)細胞(TaKaRa公司)；溫度梯度PCR分析儀(Biometra公司)、熒光定量PCR儀(Eppendorf公司)。

1.3方法

1.3.1lipasin基因的克隆與鑒定根據(jù)GenBank公布的人和鼠的lipasin序列，應(yīng)用同源電子克隆技術(shù)獲得豬lipasin序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計特異性引物，上游引物：5′-CCATGTCCACGC-TCATGCTG-3′；下游引物：5′-TTCTGCCCAAGCAGGCTCAG-3′，預期目的片段為615 bp，引物由TaKaRa公司合成。提取豬肝組織RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用LA Taq聚合酶擴增lipasin基因。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增目的片段并回收，將目的片段與pMD19-T載體連接，重組質(zhì)粒命名為pMD19-lipasin，轉(zhuǎn)化DH5α，進行藍白斑篩選，挑選白色菌落進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒用PstI進行酶切鑒定(片段為192、304和2 812 bp)，將陽性結(jié)果送至上海生物工程有限公司進行測序。

1.3.2PB-EGFP-Lipasin真核表達載體的構(gòu)建與鑒定設(shè)計帶有酶切位點的引物，上游引物：5′-ACTGTCAGCATGTCCACGCTCATGCTGTG-3′,下游引物：5′-ACTGAATTCGGCCGGGAGTGCTGCCATG-3′(下劃線分別為NheⅠ、EcoRⅠ酶切位點和保護堿基)；以測序正確的質(zhì)粒pMD19-lipasin為模板，用LA Taq聚合酶擴增帶有酶切位點的lipasin基因。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收目的片段。

將帶有酶切位點的lipasin片段和PB-EGFP質(zhì)粒分別用NheⅠ、EcoRⅠ進行雙酶切，并用T4 DNA連接酶連接，重組載體轉(zhuǎn)化DH5a，挑選克隆擴大培養(yǎng)，提質(zhì)粒，命名為PB-EGFP-lipasin，將NheⅠ、EcoRⅠ酶切鑒定(片段大小為600和7 252 bp)正確的質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測序。

1.3.3細胞轉(zhuǎn)染與篩選將凍存的L-02肝細胞復蘇，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞生長狀態(tài)良好，按1×105個·mL-1消化接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度為80%～90%時，將PB-EGFP-lipasin和PB-EGFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染24 h后，用含3.0 mg·mL-1嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行篩選，每24 h觀察細胞的狀態(tài)，篩選4 d后得到穩(wěn)定表達的細胞株。將穩(wěn)定表達lipasin(試驗組)和轉(zhuǎn)PB-EGFP質(zhì)粒的肝細胞(陰性對照組)以1×105個·mL-1接種6孔板，待細胞融合度為80%～90%收集細胞，每組3孔，重復3次。

1.3.4Lipasin和LPL基因轉(zhuǎn)錄水平檢測根據(jù)GenBank公布的豬甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、LPL的mRNA序列和本實驗室提交GenBank的豬lipasin基因序列(登錄號：KF017598)，利用軟件Primer 5.0設(shè)計引物，引物序列見表1，由TaKaRa公司合成。利用Trizol法提取細胞總RNA，按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行cDNA合成，采用熒光定量PCR法測定細胞中GAPDH、lipasin和LPL基因的轉(zhuǎn)錄水平。反應(yīng)體系：2.5 μL cDNA，10 μL 2×SYBR?Premix Ex Taq，上下游引物各0.2 μL (20 μmol·L-1)，加水補齊至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。

表1PCR擴增反應(yīng)的引物

Table 1The primers used in PCR amplification reactions

1.3.5熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，通過公式計算細胞中l(wèi)ipasin和LPL基因的轉(zhuǎn)錄水平：Ratio= EtargetΔCt target(control-sample)/ EreferenceΔCt ref (control-sample)，其中，Ratio為mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平；Etarget為目的基因擴增效率；Ereference為內(nèi)參基因擴增效率，Ctcontrol為對照組的Ct值，Ctsample為樣品組的Ct值。對mRNA相對表達量采用Prism 6.0統(tǒng)計軟件分析處理，組間采用學生t檢驗，*代表P<0.05，差異顯著，**代表P<0.01，差異極顯著。

2結(jié)果

2.1lipasin基因的克隆和鑒定

lipasin基因擴增結(jié)果見圖1，在約615 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預期片段大小相符；質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果見圖2，在192、304和2 812 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預期片段大小相符；將酶切鑒定正確的質(zhì)粒測序結(jié)果與電子克隆序列進行比對，且上傳至GenBank(登錄號：KF017598)。lipasin基因的開放閱讀框大小為594 bp，編碼197個氨基酸，liapsin蛋白的分子量和等電點分別為21.99 ku和6.79。

2.2真核表達載體PB-EGFP-lipasin的鑒定

真核表達載體PB-EGFP-lipasin的鑒定結(jié)果見圖3。由圖3可知，NheⅠ、EcoRⅠ雙酶切后分別得到約600 bp的目的片段和7 252 bp的載體片段，與預期結(jié)果一致，提示真核表達載體PB-EGFP-lipasin構(gòu)建成功。

2.3熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR檢測結(jié)果見圖4。由圖4可知，樣品中LPL、lipasin、GAPDH基因的熔解曲線均較集中，有單一的熔解曲線峰，基本上無雜峰出現(xiàn)，說明LPL、lipasin、GAPDH基因的擴增產(chǎn)物特異性較好。各基因在每個樣品中的Ct值均不相同，說明不同樣品中各基因的起始模板數(shù)不同。

2.4lipasin基因的轉(zhuǎn)錄水平

lipasin基因的轉(zhuǎn)錄水平見圖5。由圖5可知，空載體PB-EGFP轉(zhuǎn)染細胞中未檢測到lipasin基因的轉(zhuǎn)錄，PB-EGFP-lipasin轉(zhuǎn)染的細胞中有l(wèi)ipasin基因的轉(zhuǎn)錄；與空載體PB-EGFP轉(zhuǎn)染細胞相比，PB-EGFP-lipasin轉(zhuǎn)染的細胞中l(wèi)ipasin基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升(P<0.01)。提示lipasin基因在肝細胞中實現(xiàn)了過表達。

2.5lipasin對LPL基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

lipasin對LPL基因轉(zhuǎn)錄水平的影響見圖6。由圖6可知，與空載體PB-EGFP轉(zhuǎn)染細胞相比，PB-EGFP-lipasin轉(zhuǎn)染的細胞中LPL基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(P<0.05)，即lipasin過表達后能使LPL基因轉(zhuǎn)錄水平下降。提示lipasin可能抑制LPL基因的轉(zhuǎn)錄。

3討論

Lipasin是ANGPTL家族中的一個新成員，由肝產(chǎn)生后進入血液，調(diào)節(jié)血漿甘油三酯的水平，其分泌嚴格受機體營養(yǎng)水平的調(diào)控，禁食時肝和脂肪組織中的lipasinmRNA水平及血漿中的蛋白水平明顯降低[12]。lipasin與ANGPTL3親緣關(guān)系最近[8]，ANGPTL3能夠抑制LPL的酶活性，進而在脂代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，提示lipasin可能參與脂代謝的調(diào)節(jié)。lipasin基因突變與人的低密度脂蛋白和高密度脂蛋白血癥密切相關(guān)。脂肪生成時誘導lipasin蛋白高表達，禁食或寒冷條件下lipasin和ANGPTL4的表達變化相反。敲除小鼠lipasin基因，血漿甘油三酯含量較低，當lipasin基因過表達時，甘油三酯水平顯著提高[13]。推測lipasin在調(diào)控血漿甘油三酯水平和外周組織攝取脂肪酸方面發(fā)揮重要作用[14-15]。

肝作為營養(yǎng)物質(zhì)代謝的中心，也是脂代謝的重要器官。研究表明，人的lipasin主要存在于肝組織中，小鼠的肝和脂肪組織中l(wèi)ipasin比較豐富，尤其是棕色脂肪組織[9]。有關(guān)豬lipasin基因的研究報道較少，本試驗利用同源電子克隆技術(shù)獲得豬lipasin基因序列，從肝組織中成功克隆lipasin基因，并且已上傳至GenBank(登錄號：KF017598)。lipasin基因開放閱讀框大小為594 bp，編碼197個氨基酸，liapsin蛋白的分子量和等電點分別為21.99 ku和6.79。

生理和病理狀態(tài)下LPL活性與各器官組織的營養(yǎng)需要密切相關(guān)。小鼠和人的LPL功能異常會引起嚴重的高甘油三酯血癥[16]。研究表明，lipasin能抑制LPL的酶活性，從而降低體內(nèi)甘油三酯的分解，升高血清中甘油三酯的含量[9-10]，是新發(fā)現(xiàn)的一個脂代謝調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子[11]。推測lipasin可能直接抑制了LPL活性，也可能通過促進ANGPTL3的剪切，暴露其N端結(jié)構(gòu)域，進而抑制LPL的活性[17]。研究發(fā)現(xiàn)，lipasin和ANGPTL3共表達時，能使血漿中甘油三酯的含量提高10倍，提示二者可能存在協(xié)同作用[13]。本試驗將構(gòu)建的真核表達載體PB-EGFP-lipasin轉(zhuǎn)入肝細胞，檢測lipasin過表達后LPL的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lipasin過表達能顯著降低LPLmRNA水平，提示lipasin能抑制LPL的轉(zhuǎn)錄，為豬lipasin可能參與血漿甘油三酯的代謝調(diào)控提供了試驗依據(jù)，真核表達載體PB-EGFP-lipasin的構(gòu)建成功為進一步研究豬lipasin在脂代謝調(diào)控中的作用提供了技術(shù)支持和保障。

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(編輯郭云雁)

Cloning of PorcinelipasinGene and Its Effect onLPLGene Transcription in Liver Cell

LI Man-man，WEN Bing-yan，ZHU He-shui，ZHONG Kai，YANG Guo-yu，WANG Yue-ying*

(KeyLaboratoryofAnimalBiochemistryandNutritionofMinistryofAgriculture，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

Key words:lipasin；porcine；clone；hepatocyte；LPL

Abstract:The study aimed to clone thelipasingene and investigate its effects onLPLgene transcription in liver cell in pig.The porcinelipasingene was obtained by using homologous electronic cloning techniques and the eukaryotic expression vector was constructed and transfected into hepatocytes，and further to identify its effect on the transcription level ofLPLgene.The results showed thatlipasingene was successfully cloned，the segment size was 615 bp，it was deposited to GenBank with the accession number KF017598.The size of open reading frame (ORF) oflipasinwas 594 bp and it encoded 197 amino acids.The weight of lipasin molecular and theoretical isoelectric point were 21.99 ku and 6.79，respectively.The recombinant eukaryotic expression vector PB-EGFP-lipasin was successfully constructed and transfected into hepatocyte，realizing the overexpression oflipasingene.Compared with the control group，the transcription level ofLPLmRNA decreased significantly in PB-EGFP-lipasin transfected hepatocyte.These results suggest thatlipasinmay affect lipid metabolism by inhibiting theLPLgene transcription in hepatocyte.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.027

收稿日期：2015-03-18

基金項目：農(nóng)業(yè)部“948”重點計劃(2011-G35)；農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因重大專項(2014ZX0801015B)；河南省重點科技攻關(guān)項目(112102310705)

作者簡介：李曼曼(1989-)，女，河南許昌人，碩士生，主要從事動物生物技術(shù)方面的研究，E-mail：1065857330@qq.com *通信作者：王月影，副教授，碩士生導師，E-mail：wangyueying2008@126.com

中圖分類號：S828；S813.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0411-06