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芒果核苷二磷酸激酶(NDPK)基因克隆及表達分析

2016-07-09 18:39羅睿雄趙志常黃建峰黨志國高愛平
熱帶作物學(xué)報 2016年11期
關(guān)鍵詞:生物信息學(xué)分析表達分析基因克隆

羅睿雄 趙志常 黃建峰 黨志國 高愛平

摘 要 采用3′RACE和RT-PCR技術(shù)克隆芒果核苷二磷酸激酶基因全長cDNA序列,并用實時熒光定量PCR分析該基因的表達模式。結(jié)果表明:MiNDPK1基因cDNA全長1 019 bp,開放閱讀框為447 bp,編碼148個氨基酸。MiNDPK1蛋白定位于細胞質(zhì),無信號肽和跨膜區(qū)域,具有典型的核苷二磷酸激酶活性結(jié)構(gòu)域和其他磷酸化活性位點;與麻瘋樹、橡膠樹同源性最高為89%,與菠菜同源性最低為82%。MiNDPK1在芒果各組織中均有表達,以葉片中表達最高,其次是花和果皮;在芒果進入生殖時期的花芽分化期表達量最高,此后在芒果果實發(fā)育進程中逐漸降低并趨于平穩(wěn)。結(jié)合病害處理轉(zhuǎn)錄組樣本中的差異性表達結(jié)果,推測芒果MiNDPK1基因在花芽分化進程、抗病性誘導(dǎo)及免疫應(yīng)答通路上發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞 芒果;核苷二磷酸激酶;基因克?。簧镄畔W(xué)分析;表達分析

中圖分類號 S667.7 文獻標(biāo)識碼 A

核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate kinase,NDPK)是一種保守性多功能蛋白,其首要功能是依靠該酶上一保守的組氨酸殘基介導(dǎo)催化二磷酸核苷(Nucleoside diphosphate,NDP)和三磷酸核苷(Adenosine triphosphate,ATP)之間的磷酸基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)來維持生命體細胞內(nèi)ATP和NTP等濃度的平衡[1],參與UTP和GTP生物合成過程,在生物體新陳代謝方面起重要作用。NDPK蛋白由Berg等[2]于1953年發(fā)現(xiàn)以來,主要在人和動物領(lǐng)域研究較為深入,植物中研究較晚,但其普遍存在于原核、真核生物中,并多數(shù)以四聚體的形式存在于原核生物中,而在真核生物中卻以六聚體形式存在;已有研究結(jié)果認為,NDPKs基因是一種古老基因,并以家族的形式存在,定位于細胞溶質(zhì)、細胞核、線粒體及葉綠體中,是一種分泌蛋白。人類基因組中存在8個NDPKs基因(NDPKH1-NDPKH8),植物中發(fā)現(xiàn)的主要有NDPK1-4四個類型(擬南芥、水稻),而支原體等部分微生物不存在NDPKs基因,但多數(shù)物種存在至少一種NDPK基因[3]。

隨著研究的深入,NDPKs被看作是一種“管家酶”,主要功能是維持NDP和NTP代謝平衡[1]。NDPK以其具有催化磷酸基團轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)的功能,在動物中不同細胞環(huán)境發(fā)揮特異性功能,起著控制細胞增殖、調(diào)控轉(zhuǎn)錄[4]、蛋白質(zhì)磷酸轉(zhuǎn)移[5-7]、DNA修復(fù)損傷[8]、細胞分化[9]、細胞的移動[10]、糖類和脂類代謝[11-12]等作用;而動物核苷二磷酸激酶家族中的2個重要成員NDPK-A和NDPK-B中的NDPK-A與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系更為密切,NDPK-A被認為通過多種作用機制抑制腫瘤轉(zhuǎn)移,在乳腺癌、胰腺癌、肝癌和惡性黑色素瘤等癌癥患者癌組織中的表達水平與癌組織的轉(zhuǎn)移潛能呈負相關(guān)[13-16],也用于腫瘤(NDKA)和結(jié)直腸癌(CRC)等病癥的生物標(biāo)志物[17]。在植物體上,NDPKs除在植物種子萌發(fā)、生長發(fā)育[18-19]、內(nèi)源激素[20]、植物色素A/B[21]和煙草細胞凋亡[22]起調(diào)控作用外,還參與如鹽害、低溫[23]、高溫[24]、干旱[25]、機械損傷[26]、熱激[27]、紫外光照射[28]、氧化脅迫[29]、金屬離子[30]、化學(xué)藥劑(甲基紫羅堿和脫落酸等)[31-32]、病害[33]等生物與非生物堿脅迫的應(yīng)答機制。此外,NDPKs也參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[29,34]、乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[35]、保護防御相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達[36]及響應(yīng)光剌激等方面的作用。

芒果(Mangifera indica L.)是中國熱帶亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟作物,是世界第二大熱帶水果,素有“熱帶水果之王”的美稱。芒果的熱帶屬性導(dǎo)致芒果對逆境脅迫比較敏感,如開花期的低溫陰雨天氣,容易引起芒果授粉受精不良,座果率降低,也易導(dǎo)致病害的發(fā)生促使芒果大量腐爛[37];干旱、鹽等脅迫后易導(dǎo)致芒果果實變小、產(chǎn)量降低,從而影響品質(zhì)[38]。本試驗在芒果炭疽病樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中查找的差異性表達序列,經(jīng)比對確認該片段為芒果核苷二磷酸激酶(NDPK)基因,根據(jù)片段序列設(shè)計3′RACE引物,并擴增3′端序列,經(jīng)拼接比對分析,預(yù)測獲得含開放閱讀框的cDNA序列;進一步設(shè)計全長引物,然后PCR擴增獲得準(zhǔn)確全長基因序列,對其進行生物信息學(xué)和不同組織器官的表達模式分析,旨在為進一步探明芒果核苷二磷酸激酶基因的功能作用、調(diào)控逆境脅迫及免疫應(yīng)答通路方面的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試芒果品種為貴妃芒,保存于海南省儋州市的農(nóng)業(yè)部儋州芒果種質(zhì)資源圃。選擇生長一致的貴妃芒,采集芒果根、莖、葉、花、果,用于不同組織器官的表達分析;采集芒果從花芽分化期至果實成熟期之間不同時期組織材料,用于芒果果實發(fā)育過程中的表達分析。所有采集組織材料液氮速凍并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 提取芒果RNA,參照天根生化科技有限公司的RNAprep pure Plant Kit說明書進行,采用TAKARA的 3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase反轉(zhuǎn)錄獲得3′RACE擴增cDNA模版,采用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成第一鏈cDNA模板,具體操作參照說明書進行。

1.2.2 NDPK1基因克隆 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)序列片段,運用Primer 5設(shè)計3′RACE特異引物3′-GSP1、3′-GSP2;以拼接的cDNA序列設(shè)計MiNDPK1基因的全長特異引物MiNDPK1-F1、MiNDPK1-R1(表1)。以3′RACE cDNA模板擴增NDPK1基因3′端序列,使用上游外側(cè)特異性引物(3′-GSP1)和3′RACE Outer Primer進行1st PCR反應(yīng)。如果1st PCR反應(yīng)未能得到目的產(chǎn)物,再使用上游內(nèi)側(cè)特異性引物(3′-GSP2)和3′RACE Inner Primer進行2nd PCR反應(yīng)。 外側(cè)PCR反應(yīng)體系設(shè)置為:cDNA模板2 μL,1×cDNA Dilution Buffer Ⅱ 2 μL,3′RACE Outer Primer和3′-GSP1引物各(10 μm) 2 μL,10×LA PCR Buffer Ⅱ(Mg2+)4 μL,MgCl2(25 mmol/L)3 μL,LA Taq(5 U/μL)0.25 μL,補足水至總體積為50 μL。PCR反應(yīng)程序為:95 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共25個循環(huán);72 ℃ 10 min;第二輪PCR反應(yīng)則以第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍后,取2 μL作為模版進行第二輪PCR擴增,除引物更換為內(nèi)側(cè)引物外,其余體系同第一輪PCR,PCR反應(yīng)程序同第一輪,但循環(huán)數(shù)改為30個循環(huán)。PCR結(jié)束后,取 5~10 μL的PCR反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳,確認3′RACE PCR擴增產(chǎn)物,再進行回收純化,連接到pMD18-T克隆載體上并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的DH5α大腸桿菌中,涂板培養(yǎng),挑取單克隆經(jīng)菌液PCR驗證獲得陽性單克隆送往英俊公司測序。

1.2.3 MiNDPK1基因生物信息學(xué)分析 采用NCBI ORF Finder查找基因開放閱讀框ORF,采用DNAMAN軟件推導(dǎo)氨基酸序列;采用CLUSTA W進行NDPK1氨基酸多重序列比對;采用MEGA6構(gòu)建不同物種NDPK1蛋白氨基酸系統(tǒng)進化樹;采用NCBI BlastP對芒果MiNDPK1基因的氨基酸序列進行比對分析;使用ProtParam在線預(yù)測MiNDPK1蛋白理化性質(zhì);使用Subloc v1.0在線亞細胞定位;采用SMART和Motif Scan、Scanprosite在線分析蛋白功能結(jié)構(gòu)域;利用SOPMA在線預(yù)測NDPK1的二級結(jié)構(gòu);

1.2.4 MiNDPK1基因的表達分析 根據(jù)獲得的芒果NDPK1基因序列設(shè)計熒光定量引物MiNDPK1-F2、MiNDPK1-R2;以芒果Actin1肌動蛋白基因設(shè)計內(nèi)參引物Actin-F、Actin-R(表1)。實時定量PCR在Thermo PikoReal上進行,PCR反應(yīng)體系為10 μL,具體參照TAKARA公司SYBRTMTPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書進行。PCR擴增程度為:95 ℃ 7 min;94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個循環(huán);實驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù),數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法計算相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)處理與圖標(biāo)制作采用Excel 2013和DPS7.05統(tǒng)計軟件,差異顯著性分析采用Ducan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 MiNDPK1基因克隆

以芒果總RNA反轉(zhuǎn)錄的3′RACE cDNA為模板擴增芒果NDPK基因的3′端序列,得到500 bp的條帶(圖1-A),經(jīng)回收、純化、亞克隆,將陽性單克隆送樣測序后,獲得序列與轉(zhuǎn)錄組獲得的原序列片段拼接。以拼接的序列設(shè)計全長特異引物擴增獲得含ORF的全長編碼序列,約為450 bp(圖1-B),經(jīng)NCBI比對,確認獲得含有ORF的芒果核苷二磷酸激酶基因全長cDNA序列,命名為MiNDPK1。其cDNA全長1 019 bp,5′-UTR長度為348 bp,3′-UTR長度為224 bp,且含有16 bp的ployA尾巴,完整開放閱讀框ORF全長為447 bp,編碼148個氨基酸(圖2)。

2.2 MiNDPK1基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 MiNDPK1同源性分析 采用NCBI BlastP對芒果MiNDPK1基因的氨基酸序列進行比對分析,結(jié)果表明,芒果MiNDPK1與其他物種的氨基酸序列同源性在82%~90%,其中與麻瘋樹Jatropha curcas(ADB85102)、橡膠樹Hevea brasiliensis(ADR30796)、木薯Manihot esculenta(OAY49435)同源性最高為89%,與菠菜Spinacia oleracea(KNA14344)同源性最低為82%。不同物種NDPK氨基酸序列同源性均高達82%以上,結(jié)合由Clustal W多重序列比對結(jié)果(圖3),說明NDPK1蛋白在進化上的高度保守性。進一步用MEGA6.0軟件將芒果MiNDPK1與其他物種的25個NDPK蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4),芒果與毛果楊Populus trichocarpa(ABK95604)、風(fēng)信子Hyacinthus orientalis(AAT08712)、可可樹Thebroma cacao(EOX96493)、野山茶Camellia sinensis(AEC10975)、橡膠樹、木薯等聚為一大類,形成木本植物中熱帶亞熱帶植物較近的親緣關(guān)系。而與花生Archis hypogaea(AAZ20283)、大豆Glycine max(ACU14249)、玉米Zea mays(DAA46325)等草本植物親緣關(guān)系較遠。由此,利用同源基因的進化距離可明顯區(qū)分各科屬間的進化關(guān)系。

2.2.2 MiNDPK1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

使用ProtParam在線分析結(jié)果表明,MiNDPK1蛋白分子式為C748H1 163N195O213S5,相對分子質(zhì)量為16.45 ku,等電點為6.58,正電荷的氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為18,負電荷的氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為17;脂肪系數(shù)為86.22,總平均疏水性為-0.142,不穩(wěn)定系數(shù)為29.53,是穩(wěn)定蛋白;亞細胞定位于細胞質(zhì)(RI=9),無信號肽,也不存在跨膜區(qū)域。經(jīng)過SMART和Scanprosite軟件在線分析,MiNDPK1編碼氨基酸中第2~136為典型核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate kinases)活性結(jié)構(gòu)域,76~79、83~86為酰胺化位點,43~46為酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點,12~17、99~104為N端肉蔻?;稽c,31~33、53~55、83~85、100~102為蛋白激酶C磷酸化位點,102~104為細胞連接序列,42~49為酪氨酸激酶磷酸化位點,112~120為核苷二磷酸激酶活性位點。利用SOPMA在線預(yù)測NDPK1蛋白的二級結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,42個α-螺旋占28.38%,43個隨機卷曲占29.05%,41個延伸鏈占27.70%,22個β-轉(zhuǎn)角占14.86%。

2.3 MiNDPK1基因的表達分析

2.3.1 MiNDPK1基因在不同組織器官中的表達分析 檢測芒果不同組織器官中MiNDPK1基因的表達量,結(jié)果表明,MiNDPK1基因在根、莖、葉、花、果實等器官中均有表達,其中在葉中表達量最高,其次是果皮和花,在莖和種子中的表達量最低(圖5)。

2.3.2 MiNDPK1基因在不同生長發(fā)育時期的表達分析 根據(jù)芒果MiNDPK1基因在不同生長發(fā)育階段的表達模式分析可知,MiNDPK1基因在芒果花芽分化期表達量最高,其后進入花期迅速下降,下降幅度為66.59%,進入果期后在種子發(fā)育過程中平穩(wěn)表達(圖6)。

3 討論與結(jié)論

NDPK1蛋白是屬于NDPK家族蛋白之一,布于真核、原核生物中。動物中主要有平衡細胞內(nèi)ATP和NTP濃度及其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能[1,13-15]。在植物中存在調(diào)控植物生長發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答、病蟲害感應(yīng)等作用[26,30,33,36]。目前,已經(jīng)從菠菜Spinacia oleracea(KNA14344)[39]、擬南芥Arabidopsis thaliana(AEE82742)[40]、煙草Nicotiana tabacum(AAZ85394)[41]、豌豆Pisum sativum(BAA12982)、嗜冷假交替單胞菌Psychrophilic Pseudoalteromonas sp.[42]等物種中克隆到NDPKs基因。本實驗首次從芒果葉片中克隆到MiNDPK1基因的cDNA序列,全長1 019 bp,開放閱讀框477 bp,編碼148個氨基酸,定位于細胞質(zhì)中,該蛋白不具有信號肽和跨膜區(qū)域,說明其不存在膜受體功能,亦不能定位于膜的錨定蛋白或離子通道等,這與其他如甘蔗[25]等物種NDPK1基因具有相似的結(jié)構(gòu)功能。另外,該蛋白含有酪蛋白激酶ii、蛋白激酶C、酪氨酸激酶,特別是核苷二磷酸激酶等多個磷酸化活性位點,使得NDPK1蛋白可通過磷酸化與去磷酸化調(diào)控細胞內(nèi)相關(guān)酶活性功能,并使之對外界刺激產(chǎn)生迅速的反饋調(diào)節(jié)。這表明NDPK1具有重要的化學(xué)反應(yīng)催化功能及其調(diào)控植物響應(yīng)逆境脅迫的作用機制。NDPK1的進一步深入研究將有助于揭示其生物學(xué)特性并開發(fā)可能存在的農(nóng)業(yè)應(yīng)用價值。

已有研究結(jié)果表明,植物胞質(zhì)中的NDPK1是NDPKs的主要存在形式,占NDPKs總活性的70%以上,幾乎分布于根尖葉片、塊莖等所有再生組織中[43]。本實驗對芒果MiNDPK1基因在不同組織器官表達量分析結(jié)果表明,MiNDPK1在根、莖、葉、花、果實等器官中中均有表達,其中在葉中表達量最高,其次為果皮,這可能是因NDPKs能夠結(jié)合植物光敏色素的紅激發(fā)形式提高自身活性功能,參與植物光敏色素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[20]及通過調(diào)控其他相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進而影響葉綠體發(fā)育和葉綠素的生物合成[44]有關(guān),表明NDPKs對植物光合作用起到關(guān)鍵作用。其在芒果花芽分化期的高表達量也印證了NDPKs主要分布于根尖、葉片等再生組織,并在植物早期生長和分化階段發(fā)揮作用的觀點[31],與Galvis等[45]研究豌豆MtNDPK基因在幼嫩葉片及花蕾生殖器官表達量高于其他組織器官的結(jié)論一致。

NDPK1也參與植物傷害、熱休克、低溫、干旱、鹽、金屬離子和化學(xué)藥劑等逆境脅迫應(yīng)答,并起到正向調(diào)控的作用[25-29,32,46-47],脅迫消失后應(yīng)答終止[27]。如干旱處理甘蔗幼苗和鷹嘴豆莖后NDPK基因均表達上調(diào)[25,48];NDPK還可誘導(dǎo)冷脅迫相關(guān)基因pBC442、病程相關(guān)蛋白基因OsPR2a、氧化脅迫相關(guān)蛋白基因POD、CAT、OsPR4等保護防御相關(guān)基因或參與細胞信號傳導(dǎo)相關(guān)基因的表達[36,46,49]。本試驗所用序列片段亦是從芒果病害轉(zhuǎn)錄組樣本差異基因中獲得,預(yù)示芒果MiNDPK1也可能參與芒果病害的響應(yīng)或調(diào)控其他抗病相關(guān)基因的表達而提高其抗病能力。但具體的抗病機理和調(diào)控機制還需深入到蛋白質(zhì)組水平上研究才能予以明確。

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