董晨　李偉才　魏永贊　王弋　鄭雪文　胡會剛

摘 要 β-淀粉酶（beta-amylase，Bmy）是一類關鍵的淀粉水解酶，在香蕉果實成熟淀粉降解轉化為可溶性糖的過程中發(fā)揮著重要的作用。為了全面了解Bmy基因在香蕉基因組中的特征，研究基于香蕉基因組數(shù)據(jù)，通過生物信息學的方法對香蕉Bmy基本理化性質、二級結構預測、亞細胞定位、內含子和外顯子結構和保守結構域進行初步的預測與分析，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明：編碼香蕉β-淀粉酶的基因有15個，根據(jù)在染色體的位置命名為MaBmy1～15，MaBmy基因家族編碼的氨基酸范圍在68～1 453 aa，編碼的蛋白相對分子量介于7.8～162.6 ku之間，15個MaBmy蛋白中有10個偏酸性，5個偏堿性。不穩(wěn)定指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)6個MaBmy蛋白為穩(wěn)定蛋白；疏水性分析表明，所有的MaBmy蛋白為親水性蛋白；香蕉MaBmy家族內含子最少含有2個，最多的含有10個；進化分析表明，MaBmy家族分4個亞家族，且與水稻的親緣關系較近。研究結果為深入探討MaBmy基因的功能及調控香蕉果實成熟的應用奠定基礎。

關鍵詞 香蕉；β-淀粉酶；基因家族；系統(tǒng)進化分析

中圖分類號 S668.1 文獻標識碼 A

Bmy（EC3.2.1.2）是一種外切酶，作用于α-1，4-線性糖苷鏈的非還原末端，逐次以麥芽糖為單位切斷α-1，4-葡聚糖鏈，從而產(chǎn)生麥芽糖和有限糊精[1]。Bmy屬于糖苷水解酶家族14，含有一個保守結構域Glyco_hydro_14結構域（PF01373）。這個保守結構域含有2個高度保守的區(qū)域，分別位于N端以及另外一個相對中心的位置[2]。研究證明，Bmy在許多植物中表現(xiàn)為多基因家族。例如，擬南芥基因組中可能含有9個Bmy基因（AtBmy1～9）[3]。水稻有10個，玉米13個，二穗短柄草11個，高粱和谷子各10個Bmy基因[4]。其中，AtBmy1～AtBmy4為葉綠體質類型，在淀粉降解中發(fā)揮不同的作用；AtBmy3是夜間葉片淀粉降解主要的催化基因；而AtBmy4對AtBmy1和AtBmy3基因編碼的酶活起到調控作用。擬南芥中2個在根系生長發(fā)育過程中起關鍵作用的轉錄因子AtBmy7和AtBmy8分別結合一個順式作用元件，其中都包含一個Gbox和一個類似BR-反應元件[5]。通過分子克隆等生物學方法已分別從水稻、大麥、黑麥、小麥、玉米中克隆出多個Bmy編碼基因[6]。

淀粉的降解是由α-淀粉酶和Bmy協(xié)同作用的結果；淀粉是香蕉果實以及其他許多肉質果實發(fā)育過程中碳同化物的一種過渡形式，其降解代謝同果實發(fā)育過程密切相關[7-11]。汪永保研究菠蘿蜜成熟過程中Bmy基因的表達時發(fā)現(xiàn)，Bmy參與調控菠蘿蜜果實成熟中淀粉粒被降解成可溶性糖的過程，但Bmy基因相對于ɑ-淀粉酶基因來說表達量相對較低，推測二者可能共同影響著菠蘿蜜果實質地和品質的形成[12]。在香蕉中，未成熟的果實果肉中有大量的淀粉存在，而在成熟期的果肉中這些淀粉被Bmy催化降解為可溶性糖[13]。王永章等[14]認為Bmy可能參與了蘋果果實內淀粉的降解，與果實成熟有一定關系。

香蕉是熱帶亞熱帶最重要的水果之一，在果實發(fā)育過程中淀粉的合成和降解是其重要的生理過程，這個過程不僅影響香蕉的產(chǎn)量，同時也影響香蕉果實的品質。2012年已完成并公布了香蕉全基因組測序結果，在全基因組范圍內對家族基因進行分析鑒定和進化分析以及相關基因功能推測提供了數(shù)據(jù)支持[15]。迄今為止，香蕉全基因組水平上E2基因家族[16]和ARF基因家族[17]已先后被鑒定出來，而關于Bmy家族的報道較少。本研究通過對香蕉全基因組的分析，鑒定出其Bmy家族的全部基因，并且對鑒定出的家族基因進行基本理化性質分析、基因結構分析、序列比對分析、進化分析及保守基序進行分析，為更深入開展MaBmy基因的功能及調控香蕉果實成熟的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以香蕉（Musa acuminata）為研究對象，基因數(shù)據(jù)來源于Phytozome11基因組數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）及The Banana Genome Hub數(shù)據(jù)庫（http：//banana-genome.cirad.fr/）。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥、水稻和玉米Bmy基因序列的獲取

利用擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopsis.org/）和水稻RAP數(shù)據(jù)庫（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/）以及Phytozome11基因組數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）通過基因查找和Blast序列比對，最終找出擬南芥、水稻和香蕉中所有Bmy基因序列并編號。

1.2.2 香蕉Bmy基因的氨基酸序列屬性分析

將獲得的香蕉Bmy的氨基酸序列投入ExPASy（http：//www.expasy.org/）站點，利用其中的ProtParam tool軟件分析Bmy蛋白的分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)和疏水性等基本的理化性質。香蕉Bmy蛋白亞細胞定位采用Plant-mPLoc Server（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）分析。二級結構分析采用在線SOPMA程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）分析。所有參數(shù)均為默認值。

1.2.3 香蕉Bmy基因結構分析 從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫得到的香蕉Bmy的基因序列和cDNA序列，利用Gene Structure Display Server（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）分析內含子和外顯子組成。MaBmy保守結構域采用PFAM（http：//pfam.xfam.org/search）在線工具查找。

1.2.4 多序列比對和系統(tǒng)進化分析 利用Clustal X1.83對香蕉、水稻和擬南芥中所有Bmy蛋白序列進行比對，結合MEGA6.0軟件構建香蕉Bmy蛋白以及擬南芥、水稻蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，系統(tǒng)發(fā)育進化樹生成采用鄰接法（neighbor joining，NJ），參數(shù)設置：使用neighbor-joining法則的P-距離（P-distance）模型構建，選擇了成對刪除（pairwise deletion）空位（gap）的選項，Bootstrap method取值1 000。

1.2.5 香蕉Bmy蛋白的結構和保守基序查找與注釋

香蕉Bmy蛋白家族蛋白的保守基序采用MEME4.0（http：//meme.nbcr.net/meme/）分析，基序的最大數(shù)目設置為10，基序長度設為6～200個氨基酸。對得到的保守基序運用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線工具進行功能注釋，并且參照擬南芥和水稻的命名模式進行命名。

2 結果與分析

2.1 β-淀粉酶全基因組鑒定及基本理化性質分析

通過分析驗證共獲得編碼淀粉酶的基因15個，分別根據(jù)它們在每個物種中的染色體位置命名（MaBmy1-15）。MaBmy均勻的分布在1/2/3/4/5/6/7/8/10號染色體上，其中有一條在染色體上無法定位，命名為MaBmy1。除了3號染色體上有3個MaBmy，2/5/6號染色體上有2個MaBmy，其余的染色體上均為1個，詳見表1。對序列的分析結果顯示，香蕉MaBmy基因的編碼區(qū)域（ORF）長度范圍跨度較大，在 207（MaBmy12）～4362 bp（MaBmy14） 之間，對應編碼蛋白的氨基酸數(shù)目為68～1453個，對應的編碼蛋白分子量在7.8～162.6 ku之間。等電點分析發(fā)現(xiàn)：5個MaBmy蛋白等電點大于8.0顯堿性；10個MaBmy蛋白等電點小于6.5顯酸性，其中MaBmy15最小，為5.08。不穩(wěn)定指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)6個香蕉MaBmy（MaBmy-1，-4，-6，-7，-12，-15）蛋白不穩(wěn)定指數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，9個MaBmy大于40，為不穩(wěn)定蛋白。疏水性分析表明，所有的MaBmy蛋白為親水性蛋白。

對香蕉Bmy的15個蛋白二級結構分析（表2）發(fā)現(xiàn)：MaBmy蛋白二級結構均由α-螺旋、擴展鏈結構、β-轉角和無規(guī)則卷曲4種形式組成，且全部氨基酸序列的二級結構都以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。在MaBmy-2，-4，-7，-8，-9，-11中各組成的百分比為無規(guī)則卷曲>α-螺旋>擴展鏈結構>β-轉角，其余的9個MaBmy-1，-3，-5，-6，-10，-12，-13，-14，-15蛋白組成的百分比均為α-螺旋>無規(guī)則卷曲>擴展鏈結構>β-轉角。用Plant-mPLoc對MaBmy基因家族的蛋白質進行亞細胞定位分析，不同的MaBmy蛋白定位于細胞核、細胞質、細胞膜、細胞壁及線粒體、葉綠體、過氧化物酶體中。

2.2 香蕉Bmy家族基因結構、結構域及系統(tǒng)進化分析

利用GSDS基因結構作圖軟件對香蕉Bym家族基因成員的基因結構進行分析，見圖1所示，香蕉15個Bmy基因均由外顯子和內含子組成。內含子數(shù)目范圍在2～10之間，其中MaBmy-5，-6，-9，-12內含子數(shù)目最少，含有2個內含子；內含子數(shù)目最多的是MaBmy2。利用Pfam工具鑒定MaBmy基因編碼的蛋白均含有保守結構域Glycosyl hydrolase family 14 domain（PF01373），結果見圖2黃色方框所示。

對香蕉Bmy進行的基因結構分析表明，該家族基因間發(fā)生了明顯的分化。為進一步了解香蕉Bmy各基因之間的系統(tǒng)進化關系，本研究利用香蕉15個Bmy基因編碼的蛋白質序列及雙子葉模式植物擬南芥、單子葉模式植物水稻的Bmy蛋白序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果見圖3所示，15個MaBmy分為4個亞家族，且與水稻的親緣關系較近，聚類聚在一起。香蕉Bmy進化關系較近的在基因長度大小，基因結構等方面相似，例如MaBmy-5，-9均含有3個外顯子，氨基酸數(shù)目分別為-531，-547。

2.3 Bmy蛋白的結構和保守基序分析

通過MEME軟件預測擬南芥、水稻、香蕉Bmy蛋白的保守基序， 結果見圖4所示；用SMART軟件對預測的保守基序進行命名，結果見表3所示。結果顯示， 3個物種 Bmy蛋白家族中共有34個Bmy蛋白，其中有16個蛋白擁有9個基序（基序1，3～ 10）；擬南芥中9個Bmy蛋白其中有5個（AtBmy-1，-4，-5，-6，-7）含有9個基序，AtBmy-2，-3含有5個基序，其余2個AtBmy-9，-8蛋白分別含有8和4個基序；水稻中10個Bmy蛋白有6個（OsBmy-3，-5，-6，-7，-9，-10）含有9個基序，其余4個（OsBmy-1，-4，-8，-2）分別含有-8，-6，-5，-4個基序。15個香蕉Bmy蛋白有5個（MaBmy-8，-10，-13，-14，-15）含有9個基序，4個（MaBmy-4，-5，-9，-11）含有8個基序，其余的MaBmy-1，-2，-3，-7，-6，-12分別含有-6，-5，-4，-3，-2，-1個基序。在基序分析中，通過SMART在線工具進行基序命名，詳見表4，基序-1，-2，-3，-6，-7，-8均注釋為為糖苷水解酶家族14（Glyco_hydro_14）。

3 討論與結論

香蕉作為重要的熱帶亞熱帶水果，被世界糧農組織列為第四大作物，淀粉作為采前香蕉果實的主要組成成分，后熟過程中淀粉降解為可溶性糖。淀粉水解酶在淀粉降解過程中發(fā)揮著重要的作用。然而目前為止，關于香蕉全基因鑒定Bmy基因家族尚未見報道。目前，植物全基因組測序的完成加速對植物基因的全面了解，由單個基因研究上升到了基因組學以及功能基因組學的水平[18]。隨著植物基因組研究的深入，利用比較基因組學研究策略，通過廣泛的基因家族分析，奠定基因功能研究的基礎，現(xiàn)已成為基因功能研究的熱點。2012年香蕉的基因組已經(jīng)測序完成，為研究者深入發(fā)掘關鍵基因提供了大量的數(shù)據(jù)。本研究通過對香蕉進行全基因組生物信息學分析，成功鑒定得到15個香蕉Bmy蛋白家族成員，該基因家族均含有糖苷水解酶家族14的保守結構域Glycosyl hydrolase family 14 domain（PF01373），家族基因數(shù)目以及亞家族分類與擬南芥、水稻類似[3-4]，說明Bmy不論是在單子葉植物還是雙子葉植物中是一類植物進化中相對較保守的家族。

基因家族是由祖先基因在基因的復制過程中通過重復和變異產(chǎn)生，研究基因家族的系統(tǒng)進化，分析家族基因的基因結構組成具有重要意義。為了探索MaBmy基因家族的多樣性，筆者使用GSDS在線軟件預測MaBmy基因結構。結果顯示，香蕉Bmy基因家族成員均由外顯子和內含子組成。香蕉Bmy基因家族內含子數(shù)目范圍在2～10之間，而擬南芥家族成員內含子數(shù)目范圍在2～9之間，水稻的內含子數(shù)目范圍在1～10之間[3-4]；進化分析表明，在4個亞家族中，進化關系較近家族成員的聚在一起，其基因結構和氨基酸組成相似，例如：Group I中MaBmy-11，-13，OsBmy1均含有3個內含子，氨基酸組成分別為-542，-561，-566 aa，這類基因在進化過程中保守，這與楊澤峰等對禾本科Bmy基因的研究結果一致[4]。然而，還有一類基因雖然在進化過程中親緣關系較近，但是在基因結構及氨基酸組成差異較大，產(chǎn)生這類分化的原因是基因在進化過程中產(chǎn)生了新的生物學功能。

本研究基于香蕉gene bank database在全基因水平上鑒定分析了MaBmy基因家族，并對其氨基酸序列、基因結構、系統(tǒng)進化、染色體定位以及保守基序進行了全面分析，為今后進一步研究香蕉Bmy基因家族的功能和調控機理奠定基礎。

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