肖小虎　隋金蕾　戚繼艷　陽(yáng)江華　朱晉恒　唐朝榮

摘 要 以已發(fā)表的PPCK序列為探針，對(duì)橡膠樹(shù)和其他5種植物（木薯、水稻、楊樹(shù)、蓖麻和擬南芥）的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全面搜索，鑒定得到17個(gè)PPCK基因，其中包括3個(gè)橡膠樹(shù)PPCK基因，命名為HbPPCK1-3。序列分析發(fā)現(xiàn)，HbPPCK1-3和其他植物一樣在結(jié)構(gòu)上非常保守，只有一個(gè)內(nèi)含子和一個(gè)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，并且相對(duì)位置也比較一致。在進(jìn)化上，橡膠樹(shù)、木薯和蓖麻3種大戟科植物的PPCK蛋白具有較近的親緣關(guān)系。HbPPCK3在樹(shù)皮中表達(dá)豐度最高，其次是種子和雄花；HbPPCK2在膠乳和根中表達(dá)豐度相對(duì)較高，而HbPPCK1在各組織中的表達(dá)都比較低。另外，大部分家族成員的表達(dá)都受到真菌侵染、低溫和干旱脅迫處理的誘導(dǎo)，而乙烯利處理卻能抑制HbPPCK2的表達(dá)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹(shù)；PPCK；基因家族；結(jié)構(gòu)和進(jìn)化；表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

在植物中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）以Mg2+或Mn2+為輔助因子， 催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和HCO3-生成草酰乙酸（OAA）和無(wú)機(jī)磷酸的不可逆性反應(yīng)。PEPC廣泛存在于光合生物， 如植物、藻類(lèi)、藍(lán)細(xì)菌和光合細(xì)菌中， 還存在于很多非光合細(xì)菌和原生動(dòng)物中。PEPC催化的反應(yīng)為細(xì)胞各種組分的生物合成提供四碳二羧酸， 參與維持檸檬酸循環(huán)，在初級(jí)代謝中有重要的補(bǔ)給作用，在C4植物和CAM植物的光合作用中催化大氣中CO2固定的第一步反應(yīng)，是C4光合作用途徑中最重要的酶之一[1]。PEPC的活性主要是通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶（phosphoenolpyruvate carboxylase kinases，PPCKs）來(lái)調(diào)節(jié)[2]。PPCKs是鈣調(diào)控型蛋白激酶的一員，但卻缺少鈣依賴型蛋白激酶所特有的自抑區(qū)（auto-inhibitory）和EF-hands結(jié)構(gòu)域，所以PPCK是一種非鈣依賴型蛋白激酶[2-3]。在景天酸代謝植物玉吊鐘（Kalanchoe fedtschenkoi）、C4植物玉米已有研究和C3植物擬南芥中已有相關(guān)研究[3-5]，研究認(rèn)為PPCK的表達(dá)主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控。在橡膠樹(shù)中，橡膠的生產(chǎn)通過(guò)割膠來(lái)完成，割膠對(duì)橡膠樹(shù)來(lái)說(shuō)是一種機(jī)械傷害，而作為一種傷害信號(hào)卻推動(dòng)了橡膠的生物合成。人工使用乙烯利進(jìn)行刺激可以顯著提高膠乳的產(chǎn)量，正是應(yīng)用了橡膠樹(shù)樹(shù)皮對(duì)激素刺激的應(yīng)答能力，進(jìn)而使橡膠樹(shù)光合作用產(chǎn)物流向橡膠樹(shù)的生物合成[6-7]。本研究以已發(fā)表PPCK蛋白氨基酸序列為探針[3-5]，對(duì)橡膠樹(shù)、木薯、蓖麻、擬南芥、楊樹(shù)和水稻6種植物的全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行全面搜索，鑒定得到17個(gè)PPCK基因家族成員，其中橡膠樹(shù)中有3個(gè)。筆者利用相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)橡膠樹(shù)PPCK基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和表達(dá)水平進(jìn)行了初步分析。研究結(jié)果將有助于筆者深入了解橡膠樹(shù)PPCK基因在橡膠樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)室Solexa測(cè)序所用的巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）熱研7-33-97材料，除了根來(lái)自于組培苗外，其他組織（包括膠乳、樹(shù)皮、樹(shù)葉、種子、雌花和雄花）均來(lái)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)三隊(duì)的正常割膠橡膠樹(shù)（開(kāi)割2 a以上），根來(lái)自于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所種質(zhì)資源圃華玉偉老師贈(zèng)送的熱研7-33-9組培苗；不同發(fā)育時(shí)期的橡膠樹(shù)葉片來(lái)自于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠所種質(zhì)資源圃，為1年生的熱研7-33-97嫁接苗；乙烯利處理的材料主要來(lái)自于海南省儋州市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)三隊(duì)，品系為熱研7-33-9，正常開(kāi)割樹(shù)（3天1刀，不涂乙烯利刺激），用1.5%乙烯利在不同時(shí)間處理橡膠樹(shù)，相應(yīng)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為0、3、12、24 h，具體實(shí)驗(yàn)參照相關(guān)文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行[8]。

網(wǎng)上測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)自NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，包括不同組織（PRJNA201084），真菌侵染（Corynespora cassiicola tolerance， PRJNA179126，葉片）、高低溫干旱脅迫（PRJNA182078，葉片）和乙烯利處理（PRJNA182079，膠乳），詳細(xì)信息參見(jiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)說(shuō)明（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）。

1.2 方法

1.2.1 基因家族成員的鑒定與序列分析 為了全面鑒定橡膠樹(shù)、擬南芥、楊樹(shù)、水稻、木薯和蓖麻的PPCK基因家族成員，筆者從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）數(shù)據(jù)庫(kù)下載了6種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。以已發(fā)表的PPCK序列為探針[3-5]，對(duì)6種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行搜索，得到候選PPCK基因家族成員，利用InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）對(duì)候選基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。再利用EMBOSS數(shù)據(jù)庫(kù)的在線軟件Pepstats（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_pepstats/）對(duì)基因的等電點(diǎn)和分子量進(jìn)行分析。

1.2.2 基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析 利用在線軟件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對(duì)橡膠樹(shù)和其他5種植物PPCK基因家族成員的外顯子/內(nèi)含子組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用MEGA 6.0軟件對(duì)橡膠樹(shù)和其他5種植物的PPCK氨基酸序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用Neighbor-Joining方法進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

1.2.3 基因的表達(dá)模式分析 利用本實(shí)驗(yàn)室和NCBI的solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)橡膠樹(shù)PPCK基因家族成員的表達(dá)模式進(jìn)行分析[9]。首先，將NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）中橡膠樹(shù)相關(guān)的solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載到本地服務(wù)器，去除低質(zhì)量序列，利用程序RSEM進(jìn)行表達(dá)分析[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPCK基因家族成員的鑒定與序列分析

利用tblastn搜索橡膠樹(shù)、木薯、蓖麻、擬南芥、楊樹(shù)和水稻6種植物的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，鑒定得到17個(gè)基因家族（表1），其中包括3個(gè)橡膠樹(shù)基因家族，命名為HbPPCK1-3。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹(shù)PPCK蛋白為276～278個(gè)氨基酸，分子量為31～32 ku，等電點(diǎn)在5.6～6.5之間，內(nèi)含子數(shù)目均為1。氨基酸序列多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，橡膠樹(shù)PPCK蛋白都含有蛋白激酶保守結(jié)構(gòu)域（圖1）。

2.2 基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析

基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)（圖2），6種植物基因家族成員在內(nèi)含子數(shù)目和相對(duì)位置，以及結(jié)構(gòu)域的相對(duì)位置上都非常一致，均僅有1個(gè)內(nèi)含子和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。在進(jìn)化上，單子葉植物和雙子葉植物分別聚在一起，而雙子葉植物又分出2個(gè)分支，其中HbPPCK1位于一個(gè)分支，HbPPCK2和HbPPCK3位于一個(gè)分支。有部分物種存在同源蛋白對(duì)，如HbPPCK2和HbPPCK3、AtPPCK1和AtPPCK2、PtPPCK3和 PtPPCK4等，說(shuō)明這些同源對(duì)具有較近的親緣關(guān)系。橡膠樹(shù)基因家族成員主要和木薯、蓖麻2種大戟科植物PPCK聚在一起，這3種植物具有較近的親緣關(guān)系一致。

2.3 橡膠樹(shù)PPCK基因家族成員的表達(dá)分析

利用本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的Solexa測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)3個(gè)橡膠樹(shù)PPCK基因在不同組織、不同葉片發(fā)育時(shí)期和乙烯利處理下的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明：HbPPCK3在樹(shù)皮中表達(dá)豐度最高，其次是種子和雄花；HbPPCK2主要在膠乳和根中表達(dá)，在其他組織中的表達(dá)偏低，隨乙烯利刺激時(shí)間加長(zhǎng)，表達(dá)呈下降趨勢(shì)。HbPPCK1在所檢測(cè)的所有組織中表達(dá)都很低（圖3）。另外，各基因家族成員在葉片中的表達(dá)豐度相對(duì)其他組織都非常低，在葉片發(fā)育過(guò)程中也沒(méi)有明顯變化趨勢(shì)。

筆者還利用NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)橡膠樹(shù)PPCK的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。分析結(jié)果表明，HbPPCK3同樣在樹(shù)皮中表達(dá)豐度最高，C. cassiicola侵染、干旱、低溫和乙烯利刺激都會(huì)不同程度的誘導(dǎo)HbPPCK3表達(dá)；HbPPCK2主要在膠乳中表達(dá)，低溫處理后其表達(dá)豐度都會(huì)升高，而乙烯利刺激后表達(dá)豐度降低與本實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)結(jié)果一致；HbPPCK1在各組織中表達(dá)都很低，C. cassiicola侵染和低溫處理會(huì)誘導(dǎo)其表達(dá)。

從以上兩部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的結(jié)果來(lái)看，一個(gè)明顯的特征就是HbPPCK3在樹(shù)皮中高豐度表達(dá)，并且表達(dá)豐度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他基因或其他組織，并且各種脅迫處理都會(huì)不同程度的誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。這說(shuō)明HbPPCK3可能在橡膠樹(shù)響應(yīng)逆境脅迫應(yīng)答方面具有重要功能。另外，NCBI和本實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)結(jié)果的一致性，說(shuō)明了本實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 討論

PEPC是C4光合作用途徑中最重要的酶之一，PPCK通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)PEPC活性。本研究充分利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)資源，從橡膠樹(shù)、木薯、水稻、楊樹(shù)、蓖麻和擬南芥6種植物的全基因組數(shù)據(jù)中鑒定出17個(gè)PPCK基因家族成員，并從基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和表達(dá)水平等方面進(jìn)行了系統(tǒng)分析。在基因結(jié)構(gòu)方面，和CDPK-SnRK超家族的其他成員相比，PPCK較為簡(jiǎn)單，僅有一個(gè)蛋白酶結(jié)構(gòu)域（圖2），除去激酶結(jié)構(gòu)域以外的編碼區(qū)很短。相對(duì)CDPK等其他CDPK-SnRK成員，PPCK缺少鈣依賴型蛋白激酶所特有的自抑區(qū)（auto-inhibitory）和EF-hands 結(jié)構(gòu)域，所以PPCK是一種非鈣依賴型蛋白激酶[2-3]。在進(jìn)化方面，PPCK主要分為2個(gè)較大的分支，單子葉植物和雙子葉植物分別聚在一起，雙子葉植物又分出2個(gè)分支，其中HbPPCK2和 HbPPCK3位于一個(gè)分支，HbPPCK1位于一個(gè)分支，結(jié)合表達(dá)分析的結(jié)果可以看出，HbPPCK1在各組織中表達(dá)豐度都比較低，而HbPPCK2和HbPPCK3分別在不同組中高豐度表達(dá)，另外擬南芥的2個(gè)PPCK成員也和HbPPCK2、HbPPCK3位于同一分支，因而可以初步推測(cè)HbPPCK2和HbPPCK3所處的分支為PPCK進(jìn)化的主要方向。已有研究認(rèn)為，PPCK基因的表達(dá)主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控[3-5]，在本研究中HbPPCK1在各組織中表達(dá)豐度都比較低或不表達(dá)，HbPPCK2和HbPPCK3的表達(dá)具有一定的組織特異性，并且受不同脅迫處理的調(diào)控，如HbPPCK3主要在樹(shù)皮和種子中表達(dá)，真菌侵染、干旱、低溫和乙烯利刺激都會(huì)不同程度的誘導(dǎo)其表達(dá)，HbPPCK2主要在膠乳中表達(dá)，低溫處理可以誘導(dǎo)其在葉片中的表達(dá)，而乙烯利處理會(huì)降低其在膠乳中的表達(dá)，由此推測(cè)逆境條件能誘導(dǎo)PPCK基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)室的高通量數(shù)據(jù)已成功應(yīng)用于橡膠樹(shù)基因組數(shù)據(jù)分析以及橡膠樹(shù)蔗糖合成酶基因家族相關(guān)分析，相關(guān)結(jié)果已發(fā)表在Nature Plants[11]和 Febs Journal[9]，這進(jìn)一步證實(shí)了本文數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性。本研究利用相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)橡膠樹(shù)和其他植物PPCK基因家族成員的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和表達(dá)進(jìn)行了初步分析，研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究PPCK基因在橡膠樹(shù)光合作用和逆境脅迫應(yīng)答等方面的功能奠定基礎(chǔ)。

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