梁　楊，　霍細香，　方　斌，　劉琳琳，　陳盛杰，　劉　準，　陳　丹△

1武漢科技大學醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，武漢　430065　2湖北省疾病預防控制中心，武漢　430079

湖北省2007～2012年H3N2流感病毒HA基因及抗原性分析

梁楊1，2，霍細香2，方斌2，劉琳琳2，陳盛杰1，劉準1，陳丹1△

1武漢科技大學醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，武漢4300652湖北省疾病預防控制中心，武漢430079

摘要：目的研究湖北省2007～2012年H3N2流感病毒HA基因變異及抗原性變化情況。方法選取2007～2012年分離的湖北省各地區(qū)H3N2流感病毒39株，提取病毒RNA，運用RT-PCR技術(shù)擴增HA基因并測定序列，軟件導出其核苷酸、氨基酸序列，采用MEGA5.2構(gòu)建進化樹，用紅細胞凝集抑制實驗檢測病毒的抗原性。結(jié)果14株毒株紅細胞凝集抑制結(jié)果顯示效價與參照抗原有4倍以上的差異，提示H3N2流感病毒存在抗原性變異；核苷酸有較高的同源性，為97%～99%；HA1區(qū)共有50個氨基酸發(fā)生改變，其中37個在抗原位點，受體結(jié)合位點有2個(194、225位)，抗原決定簇A區(qū)4個，B區(qū)6個，C區(qū)2個，D、E區(qū)各1個；糖基化位點有明顯的地域差異，不同地區(qū)糖基化位點的數(shù)量和位置均不相同。結(jié)論湖北省2007～2012年間H3N2流感病毒抗原性和HA基因存在變異。

關鍵詞：H3N2流感病毒；HA基因變異；抗原性分析

流行性感冒是由流感病毒引起的急性上呼吸道傳染病，是第一個實行全球監(jiān)測但目前尚不能有效控制的世界性傳染病[1]。流感病毒中致病率和死亡率最高的是甲型流感病毒，其眾多亞型中，H3N2亞型在豬群、禽類和人群中均有分布，變異最為活躍，研究顯示在全球流感病例中，感染H3N2亞型人流感病毒的患者人數(shù)排名第一[2]。H3N2流感病毒為分節(jié)段單股負鏈RNA，其中第4節(jié)段HA蛋白與疾病發(fā)生和流行最為密切，對病毒的變異、毒力、受體識別和宿主特異性均有決定性作用[3]，其高發(fā)的點突變率和基因重排是流感流行的主要原因之一[4]，同時HA的抗原性是流感監(jiān)測和疫苗選擇的重點和依據(jù)[5]，因此，H3N2流感病毒HA基因和抗原性的研究對防控流感的流行具有重要意義。從近幾年湖北省流感流行狀況分析，H3N2流感病毒表現(xiàn)活躍，我們通過對湖北省2007～2012年H3N2流感病毒HA基因變異和抗原性改變的研究，闡明了H3N2流感病毒變異的特征，為湖北省制訂流感防治策略提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1標本來源

選取2007～2012年分離獲得的39株H3N2流感病毒毒株，毒株經(jīng)湖北省疾病預防控制中心鑒定、中國國家流感中心復核確認，毒株均為MDCK細胞分離株，其中2007年7株、2008年9株、2009年7株、2010年6株、2011年2株、2012年8株；來自哨點醫(yī)院毒株37株，爆發(fā)疫情毒株2株，相同年份毒株選自不同月份、不同年齡段分離株。2011年因全年獲取的毒株數(shù)較少，僅選取2株進行檢測分析。

1.2單向紅細胞凝集抑制實驗

選擇A/福建同安/196/2009(H3N2)作為標準血清，對所選毒株進行單向紅細胞凝集抑制實驗(HI)，選取A/Hubei/Jingzhou/0779/2012(H3N2)為參照抗原，若待測毒株效價與參照抗原效價相比，有4倍或4倍以上的差異，可初步判斷毒株間抗原性存在差異。采用1.5%豚鼠紅細胞，按照《全國流感監(jiān)測技術(shù)指南》(2011版)進行實驗。

1.3病毒核酸提取

采用磁珠法提核酸，以Qiagen公司EZ1型自動核酸儀提取病毒RNA。

1.4RT-PCR擴增病毒HA基因

引物選擇：根據(jù)H3N2亞型流感病毒HA基因長度選定4對引物，分別為HA-F-1BM13：TGTAAAACGACGGCCAGTAGCARAAGCAGGGGA，HA-R-850M13：CAGGAAACAGCTATGACCTAACCYCGAGGAGCRATTAG；HA-F-391M13：T-GTAAAACGACGGCCAGTTATGCCTCCCTTA-GGTCACTAG，HA-R-949M13：CAGGAAACA-GCTATGACCTCATTGGRAATGCTTCCATTT-GG；HA-F-872M13：TGTAAAACGACGGCCAGTAAGCTCRATAATGAGRTCAGAT，HA-R-1425M13：CAGGAAACAGCTATGACCAGTCAGTYAGATSA-ATTGTATGTTG；HA-F-1255M13：TGTAAA-ACGACGGCCAGTTCCATCARATYGAAAARG-AATTC，HA-R-1778BM13：CA-GGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGGTGTTTT。

擴增試劑盒采用Promega Access，PCR反應條件為逆轉(zhuǎn)錄45℃ 45 min，酶滅活94℃ 2 min，變性94℃ 30 s，退火58℃ 1 min，延伸68℃ 2 min，變性、退火、延伸共45個循環(huán)，最后68℃ 7 min收獲。擴增儀為美國MJ Research公司的PTC-200型PCR儀。

1.5擴增產(chǎn)物序列鑒定與測定分析

擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，選取清晰且無雜帶的目的條帶，交由華大基因武漢分公司完成測序。

1.6序列分析

采用DNA Star進行序列拼接，使用Bioedit對核苷酸與氨基酸進行比對分析，糖基化位點用NetNGlyc 1.0 server分析，采用MEGA5.2軟件以N-J法(Bootstrap replicates：1000)構(gòu)建進化樹。

2結(jié)果

2.1HA抗原性分析

39株病毒中有3株病毒血凝結(jié)果為陰性，分別為A/Jingzhou/0088/2007(H3N2)、A/Jingzhou/0087/2008(H3N2)和A/Jingzhou/0294/2007(H3N2)，但基因測序可獲得序列。其余36株毒株的HI結(jié)果如表1所示。有14株毒株抗原性發(fā)生改變，主要集中在2007、2008年，2009年以后毒株抗原性并未有較大的改變。2012年有1株發(fā)生變異，說明相同年份毒株也有差異。

2.2HA基因分析

2.2.1核酸同源性此次所測的流感病毒毒株HA基因長度為1 753 bp，編碼567個氨基酸。利用軟件將測得毒株的核苷酸序列與同時期(2007～2012年)的標準疫苗株進行比對，將結(jié)果在NCBI進行BLAST分析得到較高的同源性，其同源性范圍在97%～99%之間，不同年代的毒株與同年推薦的標準疫苗株同源性最高，達99%。

2.2.2氨基酸變異①糖基化位點：湖北地區(qū)H3N2流感病毒的糖基化位點有明顯的地域差別。硚口和江岸地區(qū)毒株有9個保守的糖基化位點，分別是39、53、94、157、164、196、277、316、514位，2010年在309位增加了1個糖基化位點但很快消失，此后在69、76位增加了2個潛在的糖基化位點，并一直保留至2012年的毒株中，但2012年的毒株中A/Jiangan/1361/2012(H3N2)和A/Jiangan/1361/2012(H3N2)在157位缺失。荊州和當陽地區(qū)毒株也是有9個保守的糖基化位點，分別是40、54、95、158、165、197、278、317、515位，除2012年的3株毒株增加了70、77這2個糖基化位點外其他基本無變化。而湖北宜都的毒株糖基化位點則為36、50、66、73、91、154、161、172、193、274、313、511位，共12個糖基化位點，與本研究湖北其他地區(qū)毒株在數(shù)量和位置上都不相同。總之，2012年湖北地區(qū)所選取毒株的糖基化位點都發(fā)生了變化，增加和缺失的糖鏈可能對蛋白質(zhì)的抗原性和對宿主的識別產(chǎn)生影響，應密切關注毒株的變異趨勢。

②抗原位點、抗原決定簇、受體結(jié)合部位：本次研究結(jié)果顯示HA1區(qū)共有50個氨基酸位點發(fā)生突變，其中已知的抗原位點有37個，占大部分的突變位點，過多的抗原位點發(fā)生基因突變將會產(chǎn)生抗原性變異，常引起流感大流行?？乖瓫Q定簇共有14個位點發(fā)生突變，包括A區(qū)(140、142、144、145)，B區(qū)(157、158、159、189、194、198)，C區(qū)(53、278)，D區(qū)(207)和E區(qū)(81)位點。受體結(jié)合部位有2個位點發(fā)生突變，即194和225位，其中194位于抗原決定簇B區(qū)，225在非抗原區(qū)。

2007～2008年共有15個氨基酸位點發(fā)生突變(表2)，分別是L3F、G50E、D53N、Q57H/K、V112I、S124N、G138A、K140I、G142R、D144N、K158R/N、K173E/N/Q、V182I、A198T/P、I260M，其中有13個突變發(fā)生在抗原位點。2008～2009年有21個氨基酸位點發(fā)生突變，占氨基酸總變異的50%。2009～2010年26個氨基酸位點發(fā)生突變，有9個在抗原決定簇區(qū)，分別為D53N、N278K(C區(qū))，N81D(E區(qū))，S157L、K158N、S159F、N189K、L194P(B區(qū))和Q207K(D區(qū))，其中194號為受體結(jié)合位點。2010～2011年有19個氨基酸位點發(fā)生突變，但在抗原決定簇區(qū)域只有4個位點突變，此次變異并未引起大的流行。2011～2012年共有17個氨基酸位點發(fā)生突變，2011年H3N2病毒在抗原位點N45S、T47S、T48I、H94Y、A/P198S、T280E發(fā)生改變。

2.3進化樹分析

系統(tǒng)進化樹顯示年份越近的毒株進化距離越近，如圖1所示，2007～2012年6年間分離的毒株主要有5個分支，且都與前一個時期或同時期的標準疫苗株相吻合。第1個分支為2007年的一部分毒株，與上一個時期的標準疫苗株A/Wisconsin/67/2005(H3N2)、A/California/7/2004(H3N2)在一個樹枝上。第2個分支為剩下的2007年的毒株和一部分2008年毒株，與標準疫苗株A/Brisbane/10/2007(H3N2)在一個樹枝上。第3個分支為一部分2009和一部分2010年毒株組成，與標準疫苗株A/Perth/16/2009(H3N2)在一個樹枝上。第4個分支為2010和2011年的4個毒株，沒有相應的標準疫苗株與之對應。第5分支為全部2011和全部2012年毒株，與標準疫苗株A/Texas/50/2012(H3N2)在一個樹枝上。在5個分支外仍有幾株游離在外，分別是A/Jingzhou/0139/2008(H3N2)、A/Jingzhou/0149/2008(H3N2)、A/Jiangan/1384/2009(H3N2)、A/Jiangan/0195/2009(H3N2)和A/Jiangan/1124/2009(H3N2)。

表1　2007～2012年湖北省H3N2流感病毒紅細胞凝集抑制實驗結(jié)果

*為參照抗原

表2　湖北省2007～2012年H3N2流感病毒與疫苗株A/Texas/50/2012氨基酸位點變異情況

病毒株氨基酸位點106112121124128138140142144145157158159疫苗株AVNSNAIRNNLNF2007年株TG/AK/IG/R?D/N??S/L?K?2008年株I/VN/ST???S/L?R/K/N?2009年株T?K/N??S/L?KN?S/F2010年株N/ST?K/N????2011年株V/AT?????2012年株S/NA/T/NG/R??S/N???

病毒株氨基酸位點162173182186189194198199204207212213219疫苗株PQVVKLPSVKAVF2007年株KGNA???T??S2008年株E/K/N/QI/VGNA/T/P???T??S2009年株P/QGN/KA??Q/K?T/A?A/V?S2010年株S/PGP/LA?I/V??T/A??S2011年株GA/S/PP/S?????S2012年株GS?????S

病毒株氨基酸位點221223225230260261262269278280312疫苗株PINIIRSRKES2007年株V?N??N2008年株VM/I?N??N2009年株V/ID/NM/IR/SK/R?N?G/E?N2010年株L/PVV/IM/IQ/R?N/K?A/T/E?N2011年株V/IV/I?N/K?T/E?N/S2012年株L/PM/I???

藍色為抗原決定簇A區(qū)；黃色為抗原決定簇B區(qū)；橙色為抗原決定簇C區(qū)；紅色為抗原決定簇D區(qū)；綠色為抗原決定簇E區(qū)

3討論

流感病毒變異頻繁，變異幅度大，病毒的不斷變異導致的抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變對人類防治流感流行和疫苗的配制帶來重大的挑戰(zhàn)[6-7]。流感病毒的主要表面抗原為HA抗原，HA能引起紅細胞凝集，利用流感病毒能與特異性抗血清發(fā)生紅細胞凝集抑制(HI)的原理，了解其抗原性變異的動態(tài)，對流感防治及診斷均具有十分重要的意義。同時，實時監(jiān)測基因和核苷酸多樣性可以為公共衛(wèi)生機構(gòu)間接評估流感流行提供依據(jù)[8]。

湖北省2007～2012年間的H3N2流感病毒雖然與同時期的疫苗株有較高的核苷酸同源性，達97%～99%，但血凝抑制結(jié)果存在4倍以上差異，說明發(fā)生了抗原漂移。2007～2008年毒株氨基酸在F3L、N53D、H/K57Q、I112V、N124S、I182V、T/P198A等位點變異后，2009年又增加了14個新的氨基酸位點突變，包括受體結(jié)合位點N225D，表明HA基因突變的數(shù)量、關鍵突變點的性質(zhì)和位置在抗原漂移中起重要作用[9]。2009年為新甲型H1N1流感大流行年，但湖北省也伴隨有H3N2流感同時流行，多種流感病毒混合感染導致基因重組是產(chǎn)生較多的氨基酸變異的主要原因[10]。2010～2011年流感并未產(chǎn)生大流行，可能與2010年H3N2流感病毒流行后人群產(chǎn)生抵抗力有關[10]。2011年不同于2007～2012年任何一年，雖然突變發(fā)生但并未引起流感流行，說明流感病毒致病性和大流行需要某些特定抗原位點的保守遺傳[11]。湖北地區(qū)2007～2012年間每年流感病毒株的氨基酸有較大程度的變異，抗原性也存在變異，但并不是每次變異都引起流感大的流行，也證實了流感病毒的抗原性與氨基酸某些關鍵位點有關。

圖1　湖北省2007～2012年H3N2流感病毒HA基因進化樹Fig.1 The evolutionary tree of HA gene in H3N2 viruses obtained in Hubei province during 2007-2012

H3N2流感病毒HA1抗原決定簇有5個區(qū)，A區(qū)包括133～137位和140～146位形成的突出的環(huán)上，B區(qū)位于155位上的主環(huán)156～160位及球區(qū)末端圍繞著a螺旋結(jié)構(gòu)的187～198位，C區(qū)位于球區(qū)下方的53、54、275、278位，由52位和277位的形成的膨脹部分所在區(qū)，D區(qū)位于HA三聚體的交界處由207位和174位組成，E區(qū)由63、78、81、83位組成[12]。抗原位點和受體結(jié)合位點均位于HA蛋白的重鏈區(qū)，即HA1區(qū)[13]。在HA1蛋白中，至少有4個以上氨基酸序列發(fā)生替換，且5個抗原決定簇中，至少有3個不同位點發(fā)生改變時，才有可能導致流感流行[14]。本研究顯示每年氨基酸突變主要集中在抗原位點和抗原決定簇A和B區(qū)，同時受體結(jié)合位點也有2個位點發(fā)生變異，說明抗原決定簇A和B以及受體結(jié)合位點在流感病毒的進化中起相對重要的作用[15]。除了抗原決定簇和受體結(jié)合位點的突變對毒株抗原性起決定作用，某些非抗原位點的突變也有重大意義[16]，如106、112、199位。而且某些氨基酸位點如F3L、N53D、H/K57Q、I112V、N124S、I182V、T/P198A在變異后隔年又變回去，證明了H3N2流感氨基酸變異在人群中的循環(huán)特性。湖北地區(qū)流感毒株的糖基化位點存在明顯的地域差別，不同地區(qū)糖基化位點的數(shù)量和位置都有所不同，同地區(qū)2012年的毒株糖基化位點都有1～2個增加，增加的糖基化位點很可能是為了逃避宿主免疫應答的正向選擇，而157位糖基化位點的缺失對抗體識別也可能產(chǎn)生重要影響[17]。進化樹顯示毒株基本上是與當年或頭年推薦的疫苗株在同一分支上，除少數(shù)幾株游離在外，但這幾株毒株并非疫情來源，說明每年的疫苗株對人群有一定的保護作用。進化樹與抗原性變異之間也可以看出，進化距離越大，紅細胞凝集抑制差別越大。湖北省2007～2012年H3N2流感病毒是隔年交替流行的，本研究顯示其流行的主要原因有：①抗原位點的保守遺傳；②多種病毒混合感染；③一定數(shù)量的抗原決定簇和抗原位點的突變；④人群的抵抗力。并不是每次突變都引起大的流行，只有在特定的氨基酸位點發(fā)生突變且有相應數(shù)量的抗原決定簇位點的改變才能引起大的流行，是否會產(chǎn)生使毒力更強的流行株或產(chǎn)生新的毒株還有待進一步研究。分子流行病學資料表明，流感病毒的HAl蛋白編碼區(qū)的變異頻率遠遠高于病毒的其他蛋白，抗原漂移是流感流行的預兆，因此密切監(jiān)測HAl區(qū)基因的變異情況，將對流感預測、預防和疫苗株的篩選有著十分重要的參考價值[18]。

我們通過對湖北省2007～2012年的H3N2流感病毒的研究，對流感變異的趨勢有了一定的了解，為湖北省未來對流感的防控提供了理論依據(jù)，同時也為中國其他地區(qū)流感流行的研究提供了參考。但本次研究毒株數(shù)量有限，毒株來源地區(qū)也不夠廣泛，使得研究有一定的局限性，需要擴大范圍進行深入研究。

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(2015-12-30收稿)

Analysis of HA Gene and Antigenicity of Influenza H3N2 Virus in 2007-2012，Hubei Province

Liang Yang1，2，Huo Xixiang2，F(xiàn)ang Bin2etal

1SchoolofPublicHealth，WuhanUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430065，China2HubeiProvincialCenterforDiseasesControlandPrevention，Wuhan430079，China

AbstractObjectiveTo investigate the variation of HA gene and antigenicity of influenza H3N2 viruses in Hubei province during 2007-2012.MethodsRNA was extracted from 39 strains of influenza H3N2 viruses obtained from different areas in Hubei province during 2007-2012.The HA gene was amplified with RT-PCR and sequenced.The amino acid and nucleotide sequences were obtained by using the software.Then the evolutionary tree was constructed via MEGA 5.2.The antigenicity of the strains was determined by hemagglutination inhibition(HI)test.ResultsHI test results showed that there was a difference of more than 4 times in the antibody titer between the samples and the standard antigen，suggesting the antigenic variation of H3N2 flu viruses.The nucleotide homology was high，and reached 97%-99%.Fifty amino acids changed in the HA1 segment，including 37 in antigen sites，2 in receptor binding sites(194，225)，4 in the antigenic determinant area A，6 in area B，2 in area C and 1 in area D and E each.There were significant differences in the number and position of glycosylation sites between different regions.ConclusionThere were variations in HA gene and antigenicity in H3N2 virus in Hubei province during 2007-2012.

Key wordsinfluenza H3N2 virus；HA genetic variation；antigenicity

中圖分類號：R181.36

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.011

梁楊，女，1988年生，醫(yī)學碩士，E-mail：443757863@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：409175069@qq.com