陳　鋒，　張芙蓉△，　何生松，　龐　然，　許娟娟，　董繼華

1武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心(武漢市兒童醫(yī)院)重癥醫(yī)學(xué)科，武漢　430016　華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 2感染科 3消化內(nèi)科 4中心實(shí)驗(yàn)室，武漢　430022

shRNA沉默TRAF6基因?qū)毙愿螕p傷小鼠炎癥反應(yīng)的影響

陳鋒1，張芙蓉1△，何生松2，龐然2，許娟娟3，董繼華4

1武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心(武漢市兒童醫(yī)院)重癥醫(yī)學(xué)科，武漢430016華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院2感染科3消化內(nèi)科4中心實(shí)驗(yàn)室，武漢430022

摘要：目的通過shRNA沉默腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumour necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)基因表達(dá)，研究TRAF6沉默基因?qū)?nèi)毒素/D-氨基半乳糖(LPS/D-GalN)誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠炎癥反應(yīng)的影響。方法通過體外實(shí)驗(yàn)篩選針對(duì)TRAF6基因的最有效小干擾RNA(siRNA)序列，采用流體力學(xué)注射法將pTRAF6-shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BALB/c小鼠，24 h后重復(fù)注射1次。第2次注射后24 h，予LPS/D-GalN腹腔注射制備急性肝衰竭內(nèi)毒素炎癥模型。設(shè)正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、空白質(zhì)粒/LPS組及RNAi/LPS組。觀察各組小鼠肝臟病理變化，Real-time PCR檢測(cè)TRAF6、IL-6及COX-2 mRNA的表達(dá)，ELISA檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平變化，Western blot檢測(cè)肝細(xì)胞TRAF6、NF-κB p65的表達(dá)。結(jié)果Real-time PCR及Western blot檢測(cè)顯示，pTRAF6-shRNA1能有效沉默TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)，其中TRAF6 mRNA表達(dá)較正常小鼠下降約60.13%，TRAF6蛋白表達(dá)降低約52.08%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。ELISA檢測(cè)顯示各組小鼠TNF-α、IL-1β均于造模后8 h達(dá)到峰值，TGF-β1于16 h達(dá)到峰值；RNAi/LPS組小鼠血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平明顯低于同時(shí)間點(diǎn)模型對(duì)照組。Real-time PCR結(jié)果顯示RNAi/LPS組小鼠IL-6、COX-2及TRAF6 mRNA表達(dá)下降，與模型對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示RNAi/LPS組小鼠肝組織總蛋白NF-κB p65表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，與模型對(duì)照組無(wú)差異，而胞核NF-κB p65明顯低于模型對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論pTRAF6-shRNA可能通過下調(diào)NF-κB p65水平，抑制炎癥相關(guān)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)表達(dá)水平，從而減輕內(nèi)毒素/半乳糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷。

關(guān)鍵詞：TRAF6；RNA干擾；TLR4信號(hào)通路；NF-κB；急性肝衰竭

急性肝功能衰竭(acute liver failure，ALF)是臨床危重疾患之一，目前的內(nèi)科綜合治療效果不理想，病死率高達(dá)80%。目前普遍認(rèn)為，由內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的以腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor，TNF)為核心的炎癥反應(yīng)在肝衰竭中扮演著重要的角色[1-2]，上調(diào)這些細(xì)胞因子是機(jī)體防御細(xì)菌感染的主要機(jī)制，但是過度表達(dá)可以加劇肝臟炎性損傷，導(dǎo)致病情惡化。因此，理論上有效阻斷LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)防治過度炎癥反應(yīng)有重要價(jià)值。TRAF6[Tumor necrosis factor(TNF)receptor-associated factor-6]作為介導(dǎo)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)關(guān)鍵銜接蛋白，在LPS/Toll樣受體4(Toll-like receptor，TLR4)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，可介導(dǎo)多條信號(hào)通路(TNF-α、IL-1和RANKL通路)，最終激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1、PKB/Akt等，介導(dǎo)病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)引起的天然和獲得性免疫及炎癥反應(yīng)[3-4]。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)構(gòu)建重組質(zhì)粒pGCsi-TRAF6-shRNA，利用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，以內(nèi)毒素/半乳糖(LPS/D-GalN)誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠為研究對(duì)象，研究體內(nèi)抑制TRAF6基因表達(dá)對(duì)急性肝衰竭內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)的影響。

1材料與方法

1.1材料

LPS(EscherichiacoliO111：B4)及D-氨基半乳糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；脂質(zhì)體Trans Fectin購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司；TRIzol、MTT、DMSO購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Real-time PCR試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司；ELISA試劑盒(TNF-α、IL-1β、TGF-β1)購(gòu)自美國(guó)Cusabio公司；TRAF6、NF-kB p65多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

重組質(zhì)粒pGCsi-TRAF6-shRNA由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[5]。以GenBank已公布的小鼠TRAF6 mRNA序列(NM009424)為參考序列，用美國(guó)Invitrogen公司的在線設(shè)計(jì)軟件BLOCK-iTTMRNAi Designer，篩選出4條理論上最佳siRNA序列：shRNA1(900-920)、shRNA2(1303-1323)、shRNA3(2324-2344)、shRNA4(3285-3305)。LOOP結(jié)構(gòu)選用了TCAAGAG，末端以polyT作為RNA聚合酶Ⅲ終止信號(hào)，兩端設(shè)計(jì)有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。shRNA寡核苷酸序列及Negative-shRNA表達(dá)載體由北京毅新興業(yè)科技有限公司合成提供，構(gòu)建的真核表達(dá)載體經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定證明完全正確。

1.2重組質(zhì)粒pGCsi-TRAF6-shRNA篩選

前期實(shí)驗(yàn)中，將pGCsi-TRAF6-shRNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞中，采用Real-time PCR及Western blot法檢測(cè)TRAF6基因及蛋白的表達(dá)情況，篩選出質(zhì)粒pTRAF6-shRNA1具有最佳的沉默效率[6]，且MTT檢測(cè)顯示，TRAF6基因沉默后，其細(xì)胞體外增殖活性無(wú)明顯差異，故將質(zhì)粒pTRAF6-shRNA1用于以下實(shí)驗(yàn)中。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理

SPF級(jí)6～8周齡雄性BALB/c小鼠[動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(鄂)2004-0007]，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按照隨機(jī)對(duì)照原則分組，各組處理如表1所示。本實(shí)驗(yàn)采用流體力學(xué)注射法進(jìn)行肝靶向性基因轉(zhuǎn)染，即將相當(dāng)于小鼠體重9%體積的液體(含質(zhì)粒)于5～7 s內(nèi)經(jīng)鼠尾靜脈均勻快速注入[7-8]。首先，將pTRAF6-shRNA1或空白質(zhì)粒100 μg經(jīng)脂質(zhì)體包埋[質(zhì)粒(g)/脂質(zhì)體(L)按1∶2比例混合]后，溶于林格氏液(Ringer’s Solution)制成混合液。其中，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組僅給予林格氏液尾靜脈注射，RNAi/LPS組、空白質(zhì)粒/LPS組給予含有質(zhì)粒的混合液尾靜脈注射，24 h后重復(fù)注射1次。第3天，除正常對(duì)照組外，各組小鼠均予LPS(20 μg/kg)聯(lián)合D-GalN(600 mg/kg)腹腔注射。

另設(shè)RNAi組、空白質(zhì)粒組(每組8只小鼠)，僅予pTRAF6-shRNA1或空白質(zhì)粒尾靜脈注射，不予LPS/D-GalN注射，用于檢測(cè)質(zhì)粒注射后TRAF6基因沉默效果。

分別于LPS/D-GalN注射后4、8 h，用毛細(xì)玻管由眼眶后靜脈叢采血，離心后取上清凍存。LPS/D-GalN注射16 h后，將小鼠用乙醚麻醉，開腹后腹主動(dòng)脈取血，離心后凍存；并取最大肝葉100～200 mg肝組織，快速凍存于液氮中備用。取同一肝葉5 mm×6 mm肝組織予4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋。切片用于行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。

表1　動(dòng)物分組及處理方法

1.4肝組織切片HE染色

肝組織固定、包埋后，制成4 μm厚的石蠟切片。HE染色后，常規(guī)脫水，透明，封片。鏡下觀察肝組織病理改變。

1.5細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、TGF-β1檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平。按照試劑盒說(shuō)明書步驟操作，應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)定量測(cè)定儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6熒光定量PCR檢測(cè)TRAF6、IL-6、COX-2 mRNA表達(dá)

提取總RNA后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。PCR引物由應(yīng)用軟件Prima5.0設(shè)計(jì)(表2)，由上海生工公司合成。選用ABI 7700HT實(shí)時(shí)定量PCR儀。熒光定量PCR反應(yīng)體系為25 μL，內(nèi)含500 ng cDNA模板，終濃度為250 nmol/L的上下游引物及SYBR Green Realtime PCR Master Mix 12.5 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 60 s；94 ℃ 15 s；退火15 s；70 ℃ 45 s，熒光收集，40個(gè)循環(huán)。以相對(duì)Ct值(即2-ΔΔCt)表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量[9-10]，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

表2　熒光定量PCR引物序列

1.7Western blot檢測(cè)TRAF6、NF-κB p65蛋白表達(dá)

分別取肝組織50 mg，按試劑盒說(shuō)明提取肝組織總蛋白和核蛋白，-70℃保存，考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)樣品蛋白濃度。取20 μg蛋白，上樣于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫孵育45 min，分別加入抗TRAF6多抗(1：200)、NF-κB p65抗體(1：500)和β-actin蛋白抗體，4℃過夜，辣根過氧化物酶二抗(1：3 000)室溫孵育1 h，顯色后以β-actin為內(nèi)參照，用AlphaEaseFC 4.0圖像分析軟件進(jìn)行吸光度分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1TRAF6 mRNA及TRAF6蛋白表達(dá)檢測(cè)

熒光定量PCR檢測(cè)顯示(圖1)，pTRAF6-shRNA1第2次質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后16 h時(shí)，RNAi組小鼠肝組織TRAF6 mRNA表達(dá)比正常小鼠明顯降低，TRAF6 mRNA表達(dá)受到抑制，約下降了60.13%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。空白質(zhì)粒對(duì)TRAF6 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響，空白質(zhì)粒組與正常小鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LPS/D-GalN腹腔注射后16 h，模型對(duì)照組、空白質(zhì)粒/LPS組肝組織TRAF6 mRNA表達(dá)較正常組明顯增高(P<0.01)，模型對(duì)照組與空白質(zhì)粒/LPS組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后，RNAi/LPS組小鼠肝組織TRAF6 mRNA表達(dá)較模型對(duì)照組明顯降低(P<0.01)。

A：正常對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：RNAi/LPS組；D：空白質(zhì)粒/LPS組；E：RNAi組；F：空白質(zhì)粒組；與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組比較，▲▲P<0.01圖1　熒光定量PCR檢測(cè)TRAF6 mRNA表達(dá)變化Fig.1 Fluorescent quantitative PCR assay for detection of relative mRNA expression of TRAF6

Western blot檢測(cè)(圖2)顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后小鼠(RNAi組)的肝組織TRAF6/β-actin 積分吸光度比值為(0.49±0.21)，比正常對(duì)照組小鼠(1.02±0.16)降低了約52.08%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；空白質(zhì)粒對(duì)TRAF6蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響[空白質(zhì)粒組為(1.01±0.09)]，與正常小鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。予小鼠LPS/D-GalN腹腔注射16 h后，模型對(duì)照組(1.73±0.08)、空白質(zhì)粒/LPS組(1.70±0.05)小鼠肝組織TRAF6蛋白表達(dá)較正常小鼠明顯增高(P<0.01)，模型對(duì)照組與空白質(zhì)粒/LPS組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)；RNAi干預(yù)小鼠(RNAi/LPS組)肝組織TRAF6蛋白表達(dá)(1.36±0.03)較模型對(duì)照組降低(P<0.05)。

1：正常對(duì)照組；2：RNAi組；3：模型對(duì)照組；4：空白質(zhì)粒組；5：RNAi/LPS組；6：空白質(zhì)粒/LPS組圖2　各組小鼠TRAF6蛋白表達(dá)變化Fig.2 Changes of TRAF6 protein expression in mice in each group

2.2各組小鼠肝臟變化

HE染色(圖3)可見，正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝板排列整齊，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。模型對(duì)照組和空白質(zhì)粒/LPS組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞出現(xiàn)彌漫性出血性壞死。RNAi/LPS組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不同程度破壞，肝細(xì)胞內(nèi)可見點(diǎn)片狀壞死，與模型對(duì)照組相比，肝細(xì)胞壞死程度明顯減輕。

2.3小鼠血清細(xì)胞因子表達(dá)變化

ELISA結(jié)果(表3)顯示，造模后，模型對(duì)照組小鼠血清TNF-α、IL-1β表達(dá)水平均于8 h達(dá)到高峰，而TGF-β1水平持續(xù)升高。模型對(duì)照組、空白質(zhì)粒/LPS組小鼠血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1均明顯升高，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。RNAi/LPS組小鼠血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1濃度均顯著低于同時(shí)間點(diǎn)模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

A：正常對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：RNAi/LPS組；D：空白質(zhì)粒/LPS組圖3　小鼠肝組織病理變化(HE染色，×200)Fig.3 Pathological changes of mouse liver tissues(HE staining，× 200)

2.4小鼠肝組織IL-6、COX-2 mRNA的表達(dá)變化

如表4所示，LPS/D-GalN腹腔注射后16 h，模型對(duì)照組、空白質(zhì)粒/LPS組肝組織IL-6、COX-2 mRNA表達(dá)均較正常對(duì)照組明顯增高(均P<0.01)，模型對(duì)照組與空白質(zhì)粒/LPS組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；RNAi/LPS組小鼠肝組織IL-6 mRNA表達(dá)較模型對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RNAi/LPS組COX-2 mRNA表達(dá)較模型對(duì)照組也有所降低(P<0.05)，但較正常對(duì)照組仍有升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5Western blot檢測(cè)NF-κB p65表達(dá)

造模后16 h，提取各組小鼠肝組織總蛋白和核蛋白，并定量。Western blot結(jié)果(圖4、表5)顯示，正常對(duì)照組總蛋白和核蛋白內(nèi)NF-κB p65表達(dá)水平較低；模型對(duì)照組總蛋白和核蛋白NF-κB p65表達(dá)水平明顯增高，且胞核與總蛋白中NF-κB p65比值增加，提示急性肝衰竭小鼠NF-κB活性表達(dá)增加?？瞻踪|(zhì)粒/LPS組小鼠NF-κB p65表達(dá)變化與模型對(duì)照組相似，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)(P>0.05)。RNAi/LPS組小鼠肝組織總蛋白NF-κB p65表達(dá)水平高于正常對(duì)照組小鼠(P<0.05)，與模型對(duì)照組比較兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但其細(xì)胞核NF-κB p65蛋白明顯低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

組別nTNF-α(pg/mL)IL-1β(pg/mL)TGF-β1(pg/mL)模型對(duì)照組造模后4h5671.63±56.1949.00±12.37153.60±18.34造模后8h51290.00±96.66122.20±15.17281.40±23.23造模后16h5550.50±69.1080.80±11.97366.00±30.50空白質(zhì)粒/LPS組造模后4h8603.75±47.8957.00±13.89173.60±32.94造模后8h81185.00±99.43119.20±15.71302.20±33.97造模后16h8649.13±50.8782.80±11.43352.00±38.34RNAi/LPS組造模后4h8 482.50±53.12▲▲ 34.20±8.70▲▲ 123.40±23.76▲▲造模后8h8860.00±63.02▲▲90.00±6.16▲▲210.40±43.57▲▲造模后16h8445.00±51.27▲▲57.80±7.16▲▲239.20±26.14▲▲

與模型對(duì)照組比較，▲▲P<0.01

表4　鼠肝組織TRAF6、IL-6、COX-2 mRNA表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05**P<0.01；與模型對(duì)照組比較，▲P<0.05▲▲P<0.01

A：總蛋白NF-κB p65；B：核蛋白NF-κB p65；C:β-actin圖4　各組小鼠NF-κB p65蛋白表達(dá)變化Fig.4 Changes of NF-κB p65 protein expression in mice in each group

組別n總蛋白NF-κBp65/β-actin核蛋白NF-κB/β-actin正常對(duì)照組50.82±0.040.37±0.05模型對(duì)照組81.33±0.03**1.05±0.03**RNAi/LPS組81.15±0.03*0.73±0.04*▲空白質(zhì)粒/LPS組81.44±0.05**1.12±0.04**

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05**P<0.01；與模型對(duì)照組比較，▲P<0.05

3討論

急性肝衰竭時(shí)常導(dǎo)致血漿內(nèi)毒素水平升高，出現(xiàn)腸源性內(nèi)毒素血癥，即所謂“二次打擊”。D-GalN與LPS聯(lián)合應(yīng)用引起肝損傷同時(shí)伴有腸源性內(nèi)毒素血癥的形成，但不損傷其他主要臟器，出現(xiàn)的肝損害表現(xiàn)與臨床肝衰竭較相近，而且是可重復(fù)的，是一種較為理想的肝衰竭動(dòng)物模型。采用D-GalN與LPS聯(lián)合給藥建立模型是目前學(xué)術(shù)界十分常用的方法[11-12]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇D-GalN與LPS聯(lián)合用藥制造急性肝衰竭動(dòng)物模型。

流體力學(xué)注射法(hydrodynamics-based procedure)是一種快速大容量的裸質(zhì)粒溶液的體內(nèi)注射方法。借助該方法，目的或治療基因可經(jīng)鼠尾靜脈轉(zhuǎn)染動(dòng)物活體器官，并在靶器官內(nèi)高效表達(dá)[7]。該法具有一定的“肝靶向性”，因此特別適用于肝臟疾病相關(guān)研究。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，應(yīng)用流體力學(xué)注射脂質(zhì)體/質(zhì)粒DNA復(fù)合物，目的基因可在小鼠肝臟高效表達(dá)，對(duì)肝組織病理無(wú)明顯影響[8]。而且我們還發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體包裹質(zhì)?？擅黠@提高裸質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率，但由于脂質(zhì)體價(jià)格較高，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要量大的原因，在本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用100 μg裸質(zhì)粒重復(fù)2次尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，以提高質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率。本實(shí)驗(yàn)中，第2次pTRAF6-shRNA1轉(zhuǎn)染后16 h，小鼠肝組織TRAF6 mRNA表達(dá)受到抑制，Western blot檢測(cè)結(jié)果也顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后小鼠的肝組織TRAF6蛋白表達(dá)也明顯受到抑制。

急性肝衰竭內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵因素是炎癥因子的即時(shí)產(chǎn)生，特別是TNF-α。TNF-α是一種多效應(yīng)的生物活性分子，在肝衰竭的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。TNF-α既可以直接引起細(xì)胞損傷，也能通過激活NF-κB刺激其它促炎癥介質(zhì)(如IL-1β、IL-6和NO)釋放擴(kuò)大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是內(nèi)毒素血癥介導(dǎo)組織器官損害的主要介質(zhì)之一[13-14]。以往研究顯示，TNF-α基因敲除小鼠或抗TNF-α抗體可完全對(duì)抗LPS產(chǎn)生的毒性[15]。雖然，上調(diào)這些細(xì)胞因子是機(jī)體防御細(xì)菌感染的主要機(jī)制，但其過度表達(dá)可以造成機(jī)體免疫紊亂和炎癥損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模后，模型對(duì)照組小鼠血清TNF-α和IL-1β濃度明顯升高，于8 h達(dá)高峰，TRAF6基因沉默后小鼠TNF-α和IL-1β濃度均顯著降低，8 h時(shí)，RNAi/LPS組TNF-α和IL-1β表達(dá)水平分別是模型對(duì)照組小鼠的67%和71%。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組小鼠肝組織IL-6 mRNA表達(dá)較正常組明顯增高(P<0.01)，RNAi/LPS組IL-6 mRNA表達(dá)較模型對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，可見TRAF6基因沉默對(duì)TNF-α、IL-1β和IL-6有抑制作用。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，能抑制巨噬細(xì)胞激活，近年來(lái)，因其在組織發(fā)生、發(fā)育及損傷后修復(fù)、免疫抑制的重要作用，已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[16-17]。Dambach等[18]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB(P50)的活性喪失與TNF-α、IL-10表達(dá)下降和IL-4、TGF-β1表達(dá)增多有關(guān)，表明NF-κB能通過炎癥因子和抗炎因子表達(dá)增多或減少調(diào)控肝臟炎癥損傷。因此，為了證實(shí)阻斷TRAF6具有對(duì)致炎和抗炎細(xì)胞因子的雙重調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)選擇同時(shí)檢測(cè)TGF-β1水平。研究發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組小鼠血清TGF-β1表達(dá)水平持續(xù)增高，RNAi/LPS組小鼠血清TGF-β1濃度顯著低于同時(shí)間點(diǎn)模型組(P<0.01)。16 h時(shí)RNAi/LPS組TGF-β1表達(dá)水平是模型組的64%。結(jié)果表明，動(dòng)物體內(nèi)TRAF6基因沉默不僅能抑制促炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)增長(zhǎng)，也能抑制抗炎癥細(xì)胞因子(TGF-β1)的分泌。

環(huán)加氧酶-2(COX-2)又稱前列腺素過氧化物合成酶(prosta glandin hyperoxide synthase，PGHS)，是一種誘導(dǎo)型表達(dá)蛋白，被認(rèn)為是“快速反應(yīng)基因”，在生理狀態(tài)下存在于細(xì)胞內(nèi)，多數(shù)組織內(nèi)檢測(cè)不到，在細(xì)胞受到炎癥刺激物質(zhì)如細(xì)菌脂多糖或細(xì)胞因子如IL-1等刺激后則大量產(chǎn)生，因此，COX-2是病理狀態(tài)下過度炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)酶類，與炎癥程度相關(guān)，在炎癥發(fā)展中具有重要作用[19]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織COX-2 mRNA表達(dá)較正常組明顯增高，RNAi/LPS組COX-2 mRNA表達(dá)較模型組明顯降低(P<0.05)，表明TRAF6基因沉默可明顯抑制急性肝衰竭小鼠肝組織COX-2 mRNA表達(dá)。

NF-κB是二聚體形式的核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞質(zhì)中NF-κB與其抑制蛋白IκB-α結(jié)合，呈無(wú)活性狀態(tài)，TNF-α等刺激后，經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活I(lǐng)KK-α、IKK-β，引起NF-κB向核內(nèi)移位，激活相應(yīng)的靶基因，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α)、粘附分子、趨化因子(如IL-8、補(bǔ)體C3)、免疫識(shí)別受體和急性期反應(yīng)蛋白的基因表達(dá)，正反饋放大炎癥反應(yīng)[20-24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，pTRAF6-shRNA1可有效地控制急性肝衰竭模型炎癥反應(yīng)，減輕肝組織總蛋白和核蛋白內(nèi)NF-κB p65表達(dá)，并能明顯抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位，說(shuō)明pTRAF6-shRNA1可能通過下調(diào)NF-κB p65水平，抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，抑制炎癥相關(guān)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)表達(dá)水平，從而減輕內(nèi)毒素/半乳糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷，同時(shí)提示在急性肝衰竭內(nèi)毒素炎癥中應(yīng)用RNA干擾技術(shù)體內(nèi)轉(zhuǎn)染干預(yù)治療是可行的。

我們的實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間和經(jīng)費(fèi)的限制，僅從內(nèi)毒素炎癥的控制角度觀察了RNAi干擾后TRAF6下游炎癥因子及NF-κB的表達(dá)，并未能觀察TRAF6基因沉默后，有關(guān)急性肝衰竭小鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡及其對(duì)肝細(xì)胞再生的影響，這將是我們今后進(jìn)一步研究的方向。

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(2015-12-03收稿)

Effect of Silencing TRAF6 Gene Expression with shRNA on Inflammatory Response in Mice with Acute Liver Injury

Chen Feng1，Zhang Furong1△，He Shengsong2etal

1IntensiveCareUnit，WuhanMedicalandHealthcareCenterforWomenandChildren，Wuhan430016，China2DepartmentofInfectiousDiseases，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

AbstractObjectiveTo examine the effect of silencing tumor necrosis factor(TNF)receptor-associated factor-6(TRAF6)on the inflammatory responses in mice with lipopolysaccharide(LPS)/D-galactosamine(GalN)-induced acute liver failure(ALF).MethodsThe small interfering RNA(siRNA)sequence that could most effectively target TRAF6 was screened out in vitro. The plasmid pTRAF6-shRNA was delivered into BALB/c mice by hydrodynamics-based gene transfection(HGT)twice at an interval of 24 h.Twenty-four h after the second HGT，LPS/D-GalN was intraperitoneally administrated to BALB/c mice to establish the endotoxin-induced inflammatory model of acute liver failure.Animals were divided into four groups：normal control group，model control group，blank plasmid/LPS group and RNAi/LPS group.Blood samples were collected at 4，8 and 16 h after LPS/D-GalN injection.HE staining was used to observe the pathological changes of liver tissues.Meanwhile，TRAF6，interleukin-6(IL-6)and cyclooxygenease(COX)-2 mRNA levels were detected by real-time PCR.Inflammatory cytokines[TNF-α，IL-1β，transforming growth factor(TGF)-β1 and IL-6]were measured by ELISA.Western blot analysis was used to detect TRAF6 and NF-κB p65 expression in the nuclear extracts of hepatocytes.ResultsOur results showed that TRAF6 mRNA and protein expressions were remarkably reduced by 60.13% and 52.08%，respectively，in the mouse liver(P<0.01).ELISA indicated that the secretions of TNF-α，IL-1β and TGF-β1 were markedly increased after LPS/D-GalN injection，with TNF-α，IL-1β peaking at 8 h，and TGF-β1 at 16 h.Furthermore，the levels of TNF-α，IL-1β and TGF-β1 were lower in RNAi/LPS group than in model control group at different detection time points.Real-time PCR showed that IL-6，COX-2 and TRAF6 mRNA levels were obviously lower in RNAi/LPS group than in model control group(P<0.01).Moreover，total NF-κB p65 protein levels were effectively increased in RNAi/LPS group as compared with normal control group(P<0.05).However，NF-κB p65 levels in the nuclear extracts in RNAi/LPS group were significantly lower those in model control group(P<0.05).ConclusionApplication of pTRAF6-shRNA can successfully alleviate LPS/D-GalN-induced acute liver injury in vivo by inhibiting NF-κB activities and decreasing the expression of inflammatory cytokines and inflammatory mediators.

Key wordsTRAF6；RNA interference(RNAi)；TLR4 signaling；NF-κB；acute liver failure

中圖分類號(hào)：R657.3

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.008

陳鋒，女，1978年生，醫(yī)學(xué)博士，E-mail：jmnba@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：792523496@qq.com