徐小峰，　曹學(xué)書，　陳　奇△，　吳　巍，　張志堅，　陳平波，　吳康健，　江　潮

1江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，鎮(zhèn)江　2120002華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院骨科，武漢　4300303江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江　212001

Toll樣受體-3和 -4對干細胞成軟骨分化的影響及機制*

徐小峰1，曹學(xué)書1，陳奇1△，吳巍2，張志堅3，陳平波1，吳康健1，江潮1

1江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，鎮(zhèn)江2120002華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院骨科，武漢4300303江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江212001

摘要：目的探索Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)-3和-4在骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成軟骨分化過程中對蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白形成的影響及機制。方法用Ficoll密度梯度離心法分離SD大鼠BMSCs，并進行傳代擴增。流式細胞術(shù)檢測細胞表面標(biāo)志物CD34、CD44、CD54、CD90的表達進行細胞鑒定。以Western blot法檢測第3代細胞的蛋白多糖和Ⅱ型膠原的表達。再隨機分為空白組、TLR-3激活組、TLR-4激活組，分別以PBS、TLR-3激動劑、TLR-4激動劑處理后，進行成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)第14天，以阿利新藍染色檢測蛋白多糖，以免疫熒光及Western blot法檢測Ⅱ型膠原的表達，以實時熒光定量PCR檢測Sox-9的表達。結(jié)果Ficoll密度梯度離心法分離所得細胞，其表面標(biāo)志物表達為CD34(-)、CD44(+)、CD54(+)、CD90(+)，符合BMSCs特點。分組處理前，BMSCs不表達蛋白多糖及Ⅱ型膠原。經(jīng)過2周成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，空白組、TLR-3激活組和TLR-4激活組阿利新藍染色均為陽性，且3組間無明顯差異。免疫熒光及Western blot結(jié)果顯示，3組均表達Ⅱ型膠原，但空白組表達明顯低于TLR-3激活組和TLR-4激活組，且TLR組間無明顯差異。PCR結(jié)果顯示，TLR-3和TLR-4激活組Sox-9相對表達量較空白組增高1倍，而TLR組之間無明顯差異。結(jié)論經(jīng)過成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，BMSCs能夠形成基質(zhì)蛋白多糖及Ⅱ型膠原，初步具有軟骨細胞特性。TLR-3和-4對基質(zhì)蛋白多糖的形成無明顯作用，卻能夠促進Ⅱ型膠原的形成，其機制可能與TLR-3和-4對Sox-9的上調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：Toll樣受體；干細胞；成軟骨分化；蛋白多糖；Ⅱ型膠原

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓內(nèi)存在的一類非造血干細胞，不僅自我更新能力強，而且具有多向分化潛能，一定條件下，能夠向成骨細胞、成纖維細胞、成脂細胞和內(nèi)皮細胞等方向分化。由于具有來源豐富、取材方便、不涉及倫理學(xué)等優(yōu)點，其作為組織工程與再生醫(yī)學(xué)的重要種子細胞，在醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)是細胞表面廣泛表達的一類模式調(diào)節(jié)受體，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，在天然免疫的啟動和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TLR還能夠調(diào)節(jié)干細胞功能，包括增殖、遷徙、成骨分化等[2-5]?？紤]到TLR-3和-4在骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)模型中表達增高[6-7]，且促進軟骨細胞的凋亡及分解代謝，我們推測，TLR-3和-4對干細胞向軟骨細胞分化過程也具有調(diào)節(jié)作用，從而促進或負反饋調(diào)節(jié)OA的發(fā)病。本研究旨在探索TLR-3和-4在BMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化過程中的作用及可能機制。

1材料與方法

1.1主要實驗材料

1.1.1實驗動物清潔的健康成年SD大鼠15只，雌雄不限，體質(zhì)量100～125 g，均由江蘇大學(xué)動物實驗中心提供[SCXK(蘇)2013-0011]。

1.1.2實驗試劑和儀器DMEM/F12 培養(yǎng)液、胎牛血清(Sigma公司)，胰蛋白酶(Amersco公司)，雙抗(1∶1的青霉素和鏈霉素)(華北制藥公司)，F(xiàn)icol分層液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、TLR-3激動劑(聚肌胞苷酸)、TLR-4激動劑(脂多糖)(Sigma公司)，羊抗大鼠抗體(FITC標(biāo)記)(Santa Cruz公司)，成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(CDM)(深圳百恩維公司)，阿利新藍(武漢博士德公司)，Ⅱ型膠原抗體、蛋白多糖抗體、內(nèi)參抗體(Abcam公司)?？俁NA快速提取試劑盒(上海捷瑞公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司)，qPCR試劑盒(TIANGEN公司)。倒置相差熒光顯微鏡(DMI4000B)(Leica公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司)，流式細胞儀(FACS Calibur)(BD公司)，酶標(biāo)儀(Biotek公司)，高精度分光光度計SMA4000(Merinton公司)，熒光定量PCR儀(StepOne Plus公司)。

1.2BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定

頸椎脫位法處死SD大鼠，浸泡于75%乙醇中15 min。在無菌超凈臺中解剖SD大鼠并取出雙側(cè)股骨。用5 mL注射器吸取DMEM/F12培養(yǎng)液(10%胎牛血清)，反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨髓腔透亮。將細胞懸液沿管壁緩緩加入含F(xiàn)icoll分離液(1.077 g/mL)的離心管中，體積比為1∶1，1 500 r/min離心30 min。吸取中層白色細胞帶的細胞至另一離心管中，再以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞密度至2×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中，放置37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育。每2～3天換液，直至細胞長滿瓶底80%時傳代。

取第3代細胞消化后制成細胞懸液(1×107/mL)。PBS洗滌后(3次×1 min)，轉(zhuǎn)移至EP管。EP管中加入異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的羊抗大鼠CD34、CD44、CD54和CD90，同型對照管中加入等量羊抗大鼠FITC-IgG。冰上避光孵育30 min，PBS洗滌(2次×1 min)后于室溫下離心5 min(1 000 r/min)。棄上清，加入500 μL PBS重懸(1×107/mL)。將細胞懸液放置到流式細胞儀中進行檢測。

1.3成軟骨誘導(dǎo)前蛋白多糖和Ⅱ型膠原的檢測

取第3代細胞，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗(3次×1 min)。加入上樣緩沖液，勻漿1 min，4℃下離心5 min(13 000 r/min)，取上清作為蛋白樣本與SDS-PAGE勻漿緩沖液混勻(1∶1)。沸水中煮3 min，混勻，上樣20 μL電泳。直流電(1 mA/cm2)轉(zhuǎn)膜90 min，染色50 s，以50%的甲醛脫色，雙蒸水漂洗并風(fēng)干。PBS漂洗待測NC膜(3次×5 min)。加入封閉緩沖液，室溫下振蕩2 h。棄緩沖液，PBS漂洗(3次×5 min)。加入一抗(大鼠Ⅱ型膠原抗體或大鼠抗蛋白多糖抗體)4℃下反應(yīng)12 h。棄一抗，PBS漂洗(4次×5 min)。加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，室溫下振蕩2 h。棄二抗，PBS漂洗(4次×5 min)。避光加入DAB顯色液直至出現(xiàn)條帶，雙蒸水中終止反應(yīng)。

1.4實驗分組處理及成軟骨誘導(dǎo)

取第3代細胞接種于6孔板，隨機分為3組(每組6孔)，分別為：TLR-3激活組，以聚肌胞苷酸(Poly inosine-cytidine，Poly[I：C])激活(1 μmL)；TLR-4激活組以脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)激活(1 μmL)；空白組加入等量PBS作為對照。各組處理后加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，置于37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5成軟骨誘導(dǎo)后蛋白多糖和Ⅱ型膠原的檢測

1.5.1阿利新藍染色檢測蛋白多糖培養(yǎng)14 d，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗(3次×5 min)，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS漂洗(3次×5 min)，0.1 mol/L HCl溶液浸洗5 min，pH值降至1.0，阿利新藍染色過夜，0.1 mol/L HCl漂洗(3次×5 min)，去除背景。

1.5.2免疫熒光檢測Ⅱ型膠原培養(yǎng)14 d，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗(3次×1 min)，4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗(3次×5 min)，0.5%Triton X-100透膜處理1 h，PBS漂洗(3次×5min)，0.5%牛血清白蛋白(BSA)室溫濕盒封閉1 h，PBS漂洗(2次×1min)，一抗(1∶100)4℃孵育過夜，PBS漂洗(3次×5 min)，二抗(1∶64)室溫避光孵育1h，PBS漂洗(3次×5 min)，雙蒸水漂洗(3次×5 min)，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.5.3Western blot法檢測Ⅱ型膠原培養(yǎng)14 d，以Western blot法檢測各組Ⅱ型膠原的表達，方法同1.3 項。

1.6實時熒光定量PCR檢測Sox-9基因

培養(yǎng)14 d，離心柱法提取總RNA，測定純度滿足后，順序進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增(具體操作步驟見相應(yīng)試劑盒說明書)。Sox-9和內(nèi)參的引物序列見表1。以2-ΔΔCt法進行相對定量。

表1　引物序列

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定

原代BMSCs生長緩慢，鏡下呈圓球形，24～72 h后才逐漸出現(xiàn)貼壁細胞，細胞貼壁后逐漸顯現(xiàn)出梭形、紡錘形，逐漸形成集落生長區(qū)。7～10 d后基本鋪滿瓶底。

傳代后細胞貼壁較快，2 h即可見貼壁細胞，12～24 h后大部分細胞已貼壁、伸展，3～5 d細胞鋪成單排，呈網(wǎng)狀、漩渦狀、輻射狀(圖1)。傳代后細胞生長速度明顯加快，一般2～4 d即可鋪滿瓶底。傳代至第5、6代時細胞出現(xiàn)老化。

流式細胞技術(shù)檢測顯示(圖2)：表面標(biāo)志物CD34(-)、CD44(+)、CD54(+)、CD90(+)，符合BMSCs特點。

圖1　BMSCs傳代細胞(×20)Fig.1 Passaged BMSCs (×20)

圖2　BMSCs表面標(biāo)志物表達Fig.2 Expression of surface markers of BMSCs

2.2成軟骨誘導(dǎo)前蛋白多糖及Ⅱ型膠原的表達

BMSCs在成軟骨分化誘導(dǎo)前，以Western blot法檢測蛋白多糖及Ⅱ型膠原表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未進行成軟骨分化誘導(dǎo)處理的BMSCs不表達蛋白多糖及Ⅱ型膠原，見圖3。

圖3　成軟骨分化誘導(dǎo)前蛋白多糖及Ⅱ型膠原表達Fig.3 Expression of proteoglycan and type Ⅱ collagen in BMSCs before chondrogenesis induction

2.3成軟骨誘導(dǎo)后蛋白多糖及Ⅱ型膠原的變化

成軟骨誘導(dǎo)14 d后，將細胞進行阿利新藍染色，胞質(zhì)藍色為陽性，說明胞質(zhì)中富含蛋白多糖成分?？瞻捉M、TLR-3激活組和TLR-4激活組均可發(fā)現(xiàn)陽性細胞(圖4)，且陽性細胞數(shù)無明顯差異(F=0.628，P=0.547)。

以免疫熒光檢測Ⅱ型膠原，陽性細胞的胞質(zhì)呈紅色熒光，胞核呈藍色熒光。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)，3組免疫熒光均呈陽性，但空白組熒光強度明顯弱于TLR-3激活組和TLR-4激活組，但TLR-3激活組和TLR-4激活組之間差別不明顯。

Western blot法檢測Ⅱ型膠原的表達，結(jié)果顯示(圖6)，Ⅱ 型膠原的表達在TLR-4激活組(1.058±0.152)和TLR-3激活組(0.945±0.256)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.934，P=0.372)，但均強于空白組(0.500±0.095)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

A：空白組；B：TLR-3激活組；C：TLR-4激活組圖4　成軟骨誘導(dǎo)后阿利新藍染色(×100)Fig.4 Alician blut staining of BMSCs after chondrogenesis induction(×100)

A：空白組；B：TLR-3激活組；C：TLR-4激活組圖5　免疫熒光檢測成軟骨細胞中Ⅱ型膠原(×100)Fig.5 Immunofluorescence of type Ⅱ collagen in chondroblasts(×100)

圖6　Western blot檢測Ⅱ型膠原的表達Fig.6 Western blot analysis of type Ⅱ collagen

2.4TLR對Sox-9基因表達的影響

TLR-3和TLR-4的激活上調(diào)了Sox-9的基因表達。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，在TLR-3和TLR-4激活組，Sox-9的相對表達量較空白組明顯增高，分別為對照組的2.20倍和2.14倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。而TLR-3激活組和TLR-4激活組之間，Sox-9的相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.12，P=0.27)。見圖7。

圖7　各組Sox-9的相對表達量Fig.7 Relative expression of Sox-9 in each group

3討論

軟骨組織由軟骨細胞、基質(zhì)和纖維共同組成?；|(zhì)的主要成分是大分子蛋白多糖，構(gòu)成分子篩樣立體結(jié)構(gòu)，一方面，限制大分子的細菌通過，起到防御屏障的作用，另一方面，對營養(yǎng)物質(zhì)具有很強的通透性，使缺乏血管結(jié)構(gòu)的軟骨組織能夠通過滲透作用獲得所需的營養(yǎng)物質(zhì)，對軟骨的代謝、自我修復(fù)及動態(tài)平衡的維持具有重要意義[8-9]。纖維構(gòu)成了軟骨組織的骨架結(jié)構(gòu)，是軟骨組織的重要組成成分，不同類型的軟骨組織含有的纖維不同，構(gòu)成關(guān)節(jié)面的透明軟骨，含有豐富的膠原原纖維，其中90%屬于Ⅱ型膠原。成熟軟骨細胞分泌的Ⅱ型膠原，平行聚合，進一步形成具有周期性橫紋的膠原原纖維，是軟骨具有抗壓性的重要因素。骨性關(guān)節(jié)炎及創(chuàng)傷的關(guān)節(jié)軟骨中，Ⅱ型膠原的表達明顯下降[10-11]，以Ⅱ型膠原刺激，能夠促進軟骨細胞的再分化[12]。因此，蛋白多糖和Ⅱ型膠原是軟骨組織形成和趨向成熟的重要標(biāo)志[13]。

本研究中，在未進行成軟骨誘導(dǎo)的第3代BMSCs中，蛋白多糖和Ⅱ型膠原并無明顯表達，此時的BMSCs還保持干細胞的特性，不具備任一個定向成熟細胞系的生物學(xué)功能。細胞經(jīng)過成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，胞質(zhì)內(nèi)檢測出蛋白多糖成分，具備分泌蛋白多糖的能力。但空白組、TLR-3激活組和TLR-4激活組之間并無明顯差異。這說明，TLR——無論是-3亞型還是-4亞型——在干細胞成軟骨分化過程中，對軟骨基質(zhì)蛋白多糖的形成并無明顯影響。

經(jīng)過成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，無論是免疫熒光染色還是Western blot均能檢測出Ⅱ型膠原，但TLR-3和TLR-4激活組Ⅱ型膠原的表達高于空白組，而不同TLR亞型的激活對Ⅱ型膠原的表達影響無差異。這說明，在BMSCs成軟骨分化的過程中，TLR能夠促進Ⅱ型膠原的分泌，但與TLR的亞型無關(guān)。Sox-9是參與軟骨組織發(fā)育的重要基因之一[14]。Sox-9在成熟軟骨細胞中高表達，而在肥大軟骨細胞中無明顯表達，說明Sox-9與軟骨細胞功能密切相關(guān)。研究表明，Ⅱ型膠原特異性增殖基因Col2a1依賴于Sox-9的磷酸化，其在軟骨細胞中的表達與Sox-9的表達成正比[15]。在干細胞成軟骨分化的過程中，Sox-9表達逐漸增多，對Ⅱ型膠原的產(chǎn)生具有重要意義[16]。本研究中，激活TLR-3和TLR-4，Sox-9的表達量較對照組增高1倍，這可能是TLR-3和TLR-4促進Ⅱ型膠原生成的機制。

綜上所述，在BMSCs成軟骨分化的過程中，TLR-3和-4對基質(zhì)蛋白多糖的形成無明顯影響，卻能夠促進Ⅱ型膠原的產(chǎn)生，不同亞型作用相同，其機制可能與TLR-3和-4對Sox-9的上調(diào)有關(guān)。

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(2015-12-20收稿)

Effects of Toll Like Receptor-3 and -4 on Chondrogenic Differentiation of Stem Cells

Xu Xiaofeng，Cao Xueshu，Chen Qi△etal

DepartmentofOrthopedics，AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity，Zhenjiang212000，China

AbstractObjectiveTo explore the effects of Toll like receptor (TLR)-3 and -4 on the expression of proteoglycan and type Ⅱ collagen in bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) during chondrogenesis and the possible mechanisms.MethodsBMSCs in Sprague-Dawley (SD) rats were isolated by Ficoll density gradient centrifugation，cultured and passaged in vitro，and identified by detection of their surface markers (CD34，CD44，CD54 and CD90) by flow cytometry.Western blotting was used to detect the expression of proteoglycan and type Ⅱ collagen in BMSCs at 3rd passage.Cells were then divided randomly into blank group，TLR-3 activated group and TLR-4 activated group，in which PBS，TLR-3 agonist and TLR-4 agonist were added to treat cells，respectively.Fourteen days later，Alcian blue staining was used to detect the expression of proteoglycan，immunofluorescence and Western blotting to detect the expression of type Ⅱ collagen，and real time fluorescent quantitative PCR to detect the expression of Sox-9.ResultsCells were negative for CD34 and positive for CD44，CD54 and CD90，suggesting that the cells were BMSCs.Alcian blue staining revealed positive results in all the groups after 2 weeks of chondrogenesis induction，and no statistical difference was found between groups (P>0.05).Immunofluorescence staining and Western blotting showed that type Ⅱ collagen was expressed in all the three groups，its expression was significantly lower in blank group than that in TLR-3 and TLR-4 activated groups (P<0.05) and no statistical difference was found between the latter two groups (P>0.05).PCR showed that the relative expression level of Sox-9 was a 1-fold increase in TLR-3 and TLR-4 activated groups as compared with blank group.There was no significant difference in Sox-9 expression between TLR-3 and TLR-4 activated groups.ConclusionMatrix proteoglycan and type Ⅱ collagen were found to expresse in BMSCs after chondrogenesis induction，suggesting the differentiation of BMSCs into chondrocytes.TLR-3 and -4 have no significant effects on the formation of matrix proteoglycan，but they can promote the expression of type Ⅱ collagen，which may be related to the up-regulation of Sox-9.

Key wordsToll like receptor；stem cells；chondrogenesis；proteoglycan；type Ⅱ collagen

中圖分類號：R329

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.005

*國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81401762)；江蘇大學(xué)博士創(chuàng)新基金資助項目(No.JDFYRC-2013017)

徐小峰，男，1962年生，主任醫(yī)師，E-mail：13775534791@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：jackiechanoth@163.com