李鳳瓊，穆敏婕，張梅

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RP-HPLC法測定不同產(chǎn)地香青蘭藥材中迷迭香酸的含量

李鳳瓊，穆敏婕，張梅

［摘要］目的：建立香青蘭藥材中迷迭香酸含量測定方法，比較不同產(chǎn)地香青蘭藥材中迷迭香酸含量差異。方法：采用RP-HPLC法進行含量測定，色譜條件：Kromasil C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇- 0.1%磷酸水溶液（40∶60）； 流速1.0 mL.min-1；柱溫35℃；進樣量20 μL；檢測波長330 nm。結(jié)果：迷迭香酸含量在0.0414～0.3726 mg.mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.9999），平均回收率為98.25%，RSD=0.53%（n=6）；不同產(chǎn)地香青蘭藥材中迷迭香酸含量在0.425%～1.01%之間，差異較大。結(jié)論：本文建立了一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟的測量香青蘭藥材中迷迭香酸含量的方法，為香青蘭藥材的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

［關(guān)鍵詞］香青蘭；迷迭香酸；RP-HPLC；含量測定

［作者單位］成 都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

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香青蘭為唇形科植物香青蘭Dracocephalum moldavica L.的干燥地上部分，為我國維吾爾醫(yī)學(xué)及蒙醫(yī)常用藥材，主要分布于我國華北、東北、西北部各省，新疆有人工栽培［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，香青蘭具有降血脂、抗動脈粥樣硬化，抗心肌缺血、免疫抑制等多種藥理作用［2］?，F(xiàn)已從香青蘭中分得黃酮、三萜、甾體、苯丙素、環(huán)烯醚萜及多糖等化學(xué)成分，其中以黃酮類（含量可達1.9%［3］）和苯丙素類成分含量較高［4］。迷迭香酸是一種具有多酚結(jié)構(gòu)的苯丙素類活性天然產(chǎn)物，現(xiàn)代研究證實其具有抗炎、抗氧化、抗菌及調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性［5］，是香青蘭藥材的重要活性成分。因此，本文以迷迭香酸為指標(biāo)性成分，采用RP-HPLC建立了香青蘭藥材中迷迭香酸的含量測定方法，并對不同產(chǎn)地香青蘭藥材中迷迭香酸含量進行了測定，實驗結(jié)果為香青蘭藥材的質(zhì)量評價奠定一定的基礎(chǔ)。

1　儀器與材料

1.1 儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀，安捷倫色譜工作站；KQ3200 超聲波清洗器（ 昆山超聲儀器有限公司，工作頻率40 kHz，超聲功率120 W）；KromasilC18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5μm） ；Mettler AE240（1/10）萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試劑

甲醇（美國Fisher 公司）為色譜純，磷酸為優(yōu)級純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

香青蘭藥材購自不同產(chǎn)地， 經(jīng)四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室何俊博士鑒定為唇形科植物香青蘭（Dracocephalum moldavica L.） 的干燥地上部分；迷迭香酸對照品 （批號：111871-201404，中國食品藥品檢定研究院）。

2　方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（40∶60）；流速1.0 mL.min-1；柱溫35 ℃；進樣量20 μL；檢測波長330 nm。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取迷迭香酸對照品10.35 mg，甲醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的香青蘭藥材粉末0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇30mL，浸泡30 min后，超聲提取30 min（150W/60KHz），過濾，重復(fù)兩次，合并濾液，減壓蒸餾揮干溶劑，殘渣用甲醇溶解并定容至25 mL，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

在上述色譜條件下，取對照品溶液及供試品溶液各20 μL進樣測定，香青蘭藥材中迷迭香酸與其他成分能達到很好的分離，分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品溶液1、2、4、6、8、9 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度。分別精密量取各溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程為A=1.36×107C-4.99×104（r=0.9999），結(jié)果表明，迷迭香酸在0.0414-0.3726 mg.mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度與穩(wěn)定性考察 精密量取迷迭香酸對照品溶液20 μL，連續(xù)進樣測定6次，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果顯示RSD=1.67%，精密度良好。取供試品溶液分別在0、1、2、4、8、12、16、24小時進樣測試并計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果表明供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好，其RSD=2.35%。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批次的藥材粉末，按照“2.3” 項下的方法制備樣品溶液6份，按照“2.1”項下的色譜條件測定，計算峰面積的RSD ，結(jié)果表明該法重復(fù)性良好，RSD=2.14%。

2.4.4 加樣回收試驗 精密稱取香青蘭藥材粉末約0.25 g，共6份，精密稱取迷迭香酸對照品100.26 mg，甲醇溶解定容至50 mL，分別精密量取5 mL加入上述粉末中，按照“2.3”項下的方法制備樣品溶液，并按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果顯示加樣回收率在97.50～98.83%之間，表明本法具有較好的準(zhǔn)確度。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗

2.5 樣品測定

取不同產(chǎn)地的香青蘭藥材粉末按照“2.3”項下方法制備樣品溶液，每批6個平行樣品，精密吸取20 μL按上述色譜條件進樣測定，結(jié)果見表2。

圖1 迷迭香酸對照品（a）和樣品（b）的HPLC圖譜

表2 不同產(chǎn)地香青蘭藥材中迷迭香酸含量（n=6）

3　討論

本文采用RP-HPLC法建立了香青蘭藥材中迷迭香酸含量測定方法，實驗結(jié)果顯示本法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率等方法學(xué)參數(shù)均較為理想，提供了一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟的測定香青蘭藥材中迷迭香酸含量的方法。

迷迭香酸由于結(jié)構(gòu)中含有多酚羥基結(jié)構(gòu)，雖然在甲醇溶液中較為穩(wěn)定，但操作中應(yīng)盡量避光，樣品溶液應(yīng)保存于棕色瓶中，避免變質(zhì)。本文利用該法測定了來源于吉林、內(nèi)蒙古、新疆和甘肅四個省區(qū)的10批藥材，結(jié)果顯示所有批次的藥材中均能檢測出迷迭香酸，但含量差異較為明顯，其中吉林長嶺縣的含量最低，僅為0.425%；新疆洛浦縣最高，含量達1.01%，差異較大，究其原因可能與藥材生長地的緯度、海拔、日照等因素相關(guān)，提示若以迷迭香酸作為指標(biāo)成分制定香青蘭藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量限度范圍時，應(yīng)充分考慮到樣本的廣泛性。

［參考文獻］

［1］中國植物志.第六十五卷. 第二分冊［M］. 北京:科學(xué)出版社，1983: 361.

［2］楊麗娜，邢建國，何承輝，等. 維藥香青蘭的化學(xué)成分與藥理作用評價［J］. 世界臨床藥物，2013，34（4）: 226.

［3］尤努斯江?吐拉洪，吐爾洪?買買提. 超聲提取香青蘭中黃酮及其抗氧化活性［J］. 食品科學(xué)，2012，13（24）:72.

［4］Dastmalchi K，Damien D， Laakso I， et al. Chemical composition and antioxidative activity of moldavian balm（Dracocephalum moldavica L） extracts［J］. LWT-Food Sci Technol， 2007， 40（9）: 1655.

［5］陳立亞.迷迭香酸的研究概況［J］.中國藥事，2007，21（11）:923.

（責(zé)任編輯：李蕓霞）

·炮制制劑·

Determination of the contents of rosmarinic acid in Qinglanxiang from different origins by RP-HPLC

LI Feng-qiong， MU Min-jie， ZHANG Mei//（ School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine； Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education； National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， Sichuan）

［Abstract］Objective: To establish a method for determination of rosmarinic acid content， and to compare the differences of rosmarinic acid content in Qinglanxiang from different producing areas. Method: The quantitative determination of rosmarinic acid was performed by RP-HPLC with a Kromasil C18chromatographic column （250 mm × 4.6 mm，5 μm） . Mobile phase was composed of methanol - 0.1% phosphoric acid solution （40: 60） at the flow rate of 1.0 mL.min-1. The column temperature was 35 ℃ and the UV detection wavelength was set at 330 nm. The injection volume was 20 μL. Result: The linear relationship was good in the range of 0.0414～0.3726 mg.mL-1（r=0.9999）. And the average recovery rate was 98.25% （n=6） with the RSD of 0.53%. The contents of rosmarinic acid in Qinglanxiang from different producing areas were in the range of 0.425% to1.01% with significant difference. Conclusion: A rapid， accurate and economical method was established to determine rosmarinic acid in Qinglanxiang. It lays a foundation for evaluating the quality of Qinglanxiang.

［Keyword］Qinglanxiang； rosmarinic acid； RP- HPLC； content determination.

［中圖分類號］R 284.1

［文獻標(biāo)識碼］A

［文章編號］1674-926X（2016）02-008-02

［基金項目］四 川省衛(wèi)生廳基金項目（120077）

［作者簡介］李 鳳瓊（1990-），女，碩士研究生，藥物分析

［通訊作者］張 梅（1963-），博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥及其復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究工作

［收稿日期］2015-09-18