李小彬，王海蓉，楊楸楠，肖昌彬，萬麗

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UPLC-MS/MS方法研究pongachin在肝微粒體中的代謝特征

李小彬，王海蓉，楊楸楠，肖昌彬，萬麗

［摘要］目的：采用不同種屬肝微粒體，研究黃酮類化合物pongachin的體外代謝特性，明確參與pongachin代謝的CYP酶亞型。方法：選擇UPLC-MS/MS測(cè)定方法，通過測(cè)定pongachin的剩余濃度，考察pongachin在人、大鼠和猴3個(gè)種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性，以及在大鼠肝微粒體中的代謝表型。結(jié)果：pongachin在人、大鼠和猴肝微粒體中t1/2分別為36.86、30.13和20.50 min；其清除率為人＜大鼠＜猴。在大鼠肝微粒體中，CYP2E1、CYP2C、CYP1A2 對(duì)pongachin的代謝有較強(qiáng)抑制作用。結(jié)論：pongachin在人和大鼠肝微粒體中代謝穩(wěn)定性較好（＞30 min），且在人和大鼠肝微粒體中代謝相似，在臨床上與其他抑制CYP2E1、CYP2C、CYP1A2代謝的藥物合用時(shí)應(yīng)注意藥物間的相互作用。

［關(guān)鍵詞］pongachin；肝微粒體；代謝穩(wěn)定性；代謝表型；UPLC-MS/MS

［作者單位］成 都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

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黃酮類化合物是自然界中分布最廣、數(shù)量最多的酚類化合物，具有顯著的抗腫瘤、抗菌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等活性［1～5］。Pongachin（圖1）是從水黃皮（Pongamia pinnata （L.）、灰毛豆（Tephrosia Purpurea）等藥用植物中提取分離出的二氫黃酮類成分，可通過誘導(dǎo)腫瘤壞死因子和細(xì)胞毒性作用而達(dá)到抗腫瘤效果［6-7］，并具有抗瘧原蟲［8］和廣譜殺蟲［9］等活性。

肝臟是藥物代謝的最重要器官，而藥物的代謝主要通過其中的細(xì)胞色素P450（CYP450）來完成［10］。所以目前在藥物研發(fā)過程中，研究主要CYP酶介導(dǎo)的代謝特性已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)和篩選有效、安全的新化合物實(shí)體的必備環(huán)節(jié)［11］。由于目前國內(nèi)外未有pongachin體外代謝的相關(guān)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）方法測(cè)定pongachin在人、大鼠和猴肝微粒體中的濃度，考察pongachin在肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性，以及在大鼠肝微粒體中代謝的CYP表型，為深入了解pongachin的代謝特性和臨床安全、合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 pongachin的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1　儀器與試藥

三重四極桿質(zhì)譜儀、超高效液相色譜儀（美國Waters）；Thermo Heraeus Fresco 17低溫冷凍離心機(jī)，Thermo Scientific公司；DF-101S恒溫水浴鍋，鄭州匯成科工貿(mào)有限公司。pongachin（由四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離得到，純度達(dá)99.7%）；內(nèi)標(biāo)（IS）刺芒柄花素（批號(hào)：01112916），INDOFINE chemical公司；人肝微粒體（HLM）、大鼠肝微粒體（RLM）、猴肝微粒體（MLM），蛋白濃度均為20 mg.mL-1，NADPH發(fā)生系統(tǒng)（A液、B液），均購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，于-80°C冷凍保存；α-萘黃酮（CYP1A2抑制劑，東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；鹽酸噻氯匹定（CYP2C19抑制劑，中國藥品生物制品檢定所）；奎尼?。–YP2D6抑制劑，TCI上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；二乙基二硫代氨基甲酸鈉（CYP2E1抑制劑）（美國Sigma）；酮康唑（CYP3A4抑制劑，Dr Ehrenstorfer公司）；甲醇（色譜純）；純化水由實(shí)驗(yàn)室自制；其余試劑為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1 LC-MS/MS方法

液相方法：色譜柱（Waters Acquity UPLCTMBEH C182.1×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）梯度洗脫（0～2 min 80%～90% A，2～4min 90%～80% A）。流速為0.2 mL.min-1，進(jìn)樣時(shí)間為4 min；柱溫30 ℃；樣品室溫度為10 ℃；進(jìn)樣體積5 μL。質(zhì)譜方法：本實(shí)驗(yàn)采用Quattro Premier XETM串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀的電噴霧離子源（ESI+），多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）模式，pongachin及IS刺芒柄花素的離子對(duì)和碰撞能量分別為m/z 337.15→m/z 203.20 （32 eV）和 m/z 269.20→m/z 197.20（28 eV）。毛細(xì)管電壓為2.8 kV，離子源溫度110 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，錐孔電壓 35 V，萃取錐孔氣40 L/Hr，脫溶劑氣600 L/Hr。

2.2 Pongachin測(cè)定方法的建立與驗(yàn)證

2.2.1 專屬性 將無pongachin和內(nèi)標(biāo)的空白肝微粒體溶液、只加內(nèi)標(biāo)的肝微粒體溶液，按“2.3”項(xiàng)下后續(xù)處理方法處理，得到空白對(duì)照樣品和內(nèi)標(biāo)對(duì)照樣品，將pongachin按“2.3”項(xiàng)下的孵育系統(tǒng)進(jìn)行孵育得實(shí)驗(yàn)肝微粒體溫孵液樣品。將三組樣品進(jìn)行LC-MS/MS分析，在相同保留時(shí)間處，孵育體系和內(nèi)標(biāo)中的雜質(zhì)對(duì)pongachin的測(cè)定均無干擾（圖2），說明內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾pongachin的測(cè)定，該方法專屬性良好。

圖2 空白對(duì)照樣品 （A）、內(nèi)標(biāo)對(duì)照樣品 （B）、pongachin肝微粒體溫孵樣品（C） 色譜圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用0.1M的PBS溶液與肝微粒體、NADPH溶液配制理論濃度為5、10、50、100、500、1000、2000 ng.mL-1pongachin的系列對(duì)照樣品溶液，進(jìn)行LC-MS/MS分析測(cè)定。以pongachin與內(nèi)標(biāo)的峰面積比（y）和pongachin濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算得回歸方程為y=0.0045x+0.0434，其相關(guān)系數(shù)大于0.99，在5 ～2000 ng.mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 準(zhǔn)確度與精密度 按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法配制濃度15、500、1600 ng.mL-1低、中、高三個(gè)濃度質(zhì)控樣品各5份，進(jìn)樣分析，計(jì)算各濃度質(zhì)控樣品的回收率表示準(zhǔn)確度。連續(xù)3d測(cè)定該法制備的質(zhì)控樣品，計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）為日內(nèi)、日間精密度（表1）。由表1可知精密度與準(zhǔn)確度的偏差均在15%內(nèi)，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度，儀器精密度良好。

表1 pongachin測(cè)定的準(zhǔn)確度與精密度（n=5）

2.2.4 基質(zhì)效應(yīng) 將質(zhì)控溶液與含相同濃度的pongachin對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣分析，測(cè)得的峰面積分別為A和B，基質(zhì)效應(yīng)表示為=A/B×100%，基質(zhì)抑制率為=（1-A/B）×100%。測(cè)得其基質(zhì)抑制率為3.02%～4.43%，小于5%，表明該提取方法基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計(jì)。

2.3 肝微粒體代謝穩(wěn)定性

用0.1 mol.L-1PBS溶液（pH 7.4）配制含蛋白0.5 mg.mL-1的各種屬肝微粒體孵育液，孵育體系總體積為200 μL。將pongachin（終濃度為1μmol.L-1）與上述孵育液混合，在37℃預(yù)孵育5 min后加入NADPH發(fā)生系統(tǒng)啟動(dòng)反應(yīng)。分別于反應(yīng)0、5、10、15、20、30、60 min后，立即加入含IS 刺芒柄花素（100 ng.mL-1）的冰甲醇溶液400 μL終止反應(yīng)，渦旋3 min，離心（4℃，13000 r.min-1）10 min，取上清液至LC-MS/MS檢測(cè)，定量分析pongachin的剩余量。以底物剩余百分?jǐn)?shù)的自然對(duì)數(shù)與孵育時(shí)間經(jīng)線性回歸可知，pongachin在HLM、RLM、MLM中0～20min呈良好的線性關(guān)系，其相應(yīng)的線性回歸方程分別為y=-0.0188x+4.6232，R2=0.9803；y=-0.023x+4.6093，R2=0.9910；y=-0.0338x+4.6122，R2=0.9731，并求得斜率（k）。參考文獻(xiàn)［14-15］采用well-stirred模型求得pongachin的體外代謝穩(wěn)定性參數(shù)，包括消除半衰期t1/2、肝微粒體中固有清除率CLint、體內(nèi)固有清除率CL′int、肝清除率CLH和肝提取率ER。結(jié)果見圖3和表2。

圖3 pongachin（1μmol.L-1）在人、大鼠、猴肝微粒體中的代謝消除情況

表2 pongachin在各種屬肝微粒體中代謝穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

2.4 代謝表型確定

用K2HPO4緩沖液（pH 7.4）配制蛋白含量為0.5 mg.mL-1（線性代謝范圍內(nèi)）大鼠肝微粒體孵育液，加入pongachin（1μmol.L-1，濃度小于其Km）和各選擇性抑制劑：α-萘黃酮（1 μmol.L-1）、鹽酸噻氯匹定 （25 μmol.L-1）、奎尼丁 （10 μmol.L-1）、二乙基二硫代氨基甲酸鈉 （50 μmol.L-1）、酮康唑 （1μmol.L-1）［12-13］，37℃預(yù)孵育5min后，加入NADPH發(fā)生液啟動(dòng)反應(yīng)，在反應(yīng)0 min和5min時(shí)立即加含IS刺芒柄花素（100ng.mL-1）的冰甲醇溶液400 μL終止反應(yīng)，渦旋3 min，離心（4 ℃，13000 r.min-1）15 min，取上清液5μL進(jìn)樣。平行設(shè)置的空白對(duì)照組不加抑制劑同法孵育。樣品平行設(shè)置3份。由蛋白濃度和底物濃度（pongachin）分別與反應(yīng)速率作圖（圖4A、4B）可知，在0.1～0.7 mg.mL-1蛋白濃度范圍內(nèi)和0.1～1μmol .L-1底物濃度范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)底物pongachin的代謝呈線性消除關(guān)系。由于孵育時(shí)間需在代謝量的20%以內(nèi)［16］及為了減少蛋白結(jié)合率，本實(shí)驗(yàn)最終選擇pongachin濃度為1μmol.L-1，RLM蛋白濃度為0.5mg.mL-1，孵育時(shí)間為5min進(jìn)行代謝酶抑制實(shí)驗(yàn)。以Eadie-Hofstee法（V對(duì)V/［S］）作圖（圖5），可見一明顯的“S”圖形，表明pongachin可能由多種酶所催化代謝［17］。由各特異性抑制劑對(duì)pongachin在大鼠肝微粒體中代謝速率的影響圖（圖6）可知：與空白對(duì)照組相比，α-萘黃酮、鹽酸噻氯匹定、二乙基二硫代氨基甲酸鈉組代謝速率為59.74%、34.18%、15.37%，抑制效果明顯（P＜0.01），奎尼丁、酮康唑組對(duì)pongachin代謝沒有明顯抑制作用（P＞0.05）。表明pongachin可能主要由CYP2E1、CYP2C和CYP1A2催化代謝。

圖4 酶蛋白濃度及底物濃度對(duì)pongachin代謝的影響

圖5 不同底物濃度的Eadie-Hofstee圖

圖6 各選擇性化學(xué)抑制劑對(duì)RLM中pongachin代謝的影響

3　討論

本實(shí)驗(yàn)成功建立了大鼠肝微粒體中pongachin 的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，其專屬性、線性、準(zhǔn)確度和精密度以及基質(zhì)效應(yīng)驗(yàn)證結(jié)果均符合生物樣品的測(cè)定要求。在肝微粒體代謝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，pongachin在人和大鼠屬肝微粒體中半衰期均大于30min，說明其在人和大鼠肝微粒體中代謝穩(wěn)定性較好［18］，其體外代謝參數(shù)結(jié)果亦表明pongachin在人和大鼠肝微粒體中代謝相似，提示該藥的臨床前實(shí)驗(yàn)可能選擇大鼠作為候選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。另外，由于人肝微粒體價(jià)格昂貴，為節(jié)約成本，本實(shí)驗(yàn)暫時(shí)采用大鼠肝微粒體進(jìn)行代謝表型實(shí)驗(yàn)。

代謝表型研究對(duì)分析藥物代謝所屬酶有重要作用，而化學(xué)抑制劑法是研究代謝酶表型的常用手段。肝微粒體表型實(shí)驗(yàn)應(yīng)首先確定藥物線性代謝的條件，所以通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果和蛋白濃度、底物濃度考察等預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定了最佳孵育時(shí)間、蛋白濃度和底物濃度。Eadie-Hofstee作圖法得到一明顯的“S”圖形，表明在大鼠肝微粒體中有多個(gè)CYP酶參與pongachin的代謝。選擇性化學(xué)抑制劑法結(jié)果表明，CYP2E1、CYP2C、CYP1A2可能是pongachin的主要代謝酶，提示在臨床上與其他抑制CYP2E1、CYP2C 和CYP1A2代謝的藥物合用時(shí)應(yīng)注意藥物間的相互作用。鑒于CYP酶存在種屬差異性，本實(shí)驗(yàn)室下一步將采用人肝微粒體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)階段僅對(duì)pongachin進(jìn)行了CYP酶層面的Ⅰ相代謝研究，接下來將進(jìn)行葡萄糖醛酸反應(yīng)的Ⅱ相代謝實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步闡明pongachin的體外代謝特征。

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（責(zé)任編輯：陳思敏）

·本草文獻(xiàn)·

Investigation of metabolism of pongachin in liver microsomes by UPLC-MS/MS

LI Xiao-bin， WANG Hai-rong， YANGQiu-nan， XIAO Chang-bin， WAN Li//（ School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine； Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education； National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， Sichuan）

［Abstract］Objective: By investigating the metabolic characteristics of pongachin in human， rat and monkey liver microsomes to identify CYP isozymes responsible for pongachin metabolism. Method: The metabolic stability and the CYP 450 phenotype of pongachin in liver microsomes were determined by UPLC-MS/MS method. Result: The corresponding t1/2were 36.86， 30.13， 20.50 min for pongachin in human， rat and monkey liver microsomes， respectively， which indicated that the extent of metabolic rates in liver microsomes were in the order of human＜ in rat＜ in monkey. CYP2E1， CYP2C and CYP1A2 strong inhibited pongachin metabolism in rat microsomes. Conclusion: Pongachin showed good metabolic stability in human and rat liver microsomes （more than 30 min）. Meanwhile its metabolism in human was similar with that in rat. Potential drug-drug interaction should be vigilant when pongachin is co-administered with the medicines which can inhibit CYP2E1， CYP2C and CYP1A2.

［Key words］Pongachin； liver microsmes； metabolic stability； metabolic phenotype； UPLC-MS/MS

［中圖分類號(hào)］R285.5

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1674-926X（2016）02-019-04

［基金項(xiàng)目］十 二五重大新藥創(chuàng)制（2012ZX09103101-066）

［作者簡介］李 小彬，女，在讀碩士研究生，主要從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

［通訊作者］萬 麗，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

［收稿日期］2016-02-16