肖發(fā)菊　黃愛華

[摘 要] 目的：探討Fas及FasL在滋養(yǎng)細胞、正常葡萄胎、侵襲性葡萄胎、絨癌中的表達及意義。方法：利用免疫組織化學(xué)方法檢測Fas及FasL蛋白在正常滋養(yǎng)細胞（40例）、完全性葡萄胎（36例）、侵襲性葡萄胎（20例）、絨癌（20例）中的表達；用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測 Fas、FasL基因在4組組織中的表達。結(jié)果：免疫組織化學(xué)方法顯示Fas蛋白在正常滋養(yǎng)細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌組的陽性表達率分別為90%（36例）、86.1%（31例）、40%（8例）、30%（6例），F(xiàn)asL蛋白在正常滋養(yǎng)細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌組的陽性表達率分別為17.5%（7例），27.8%（10例）、55%（11例）、75%（15例）。在侵蝕性葡萄胎和絨癌中Fas蛋白低表達、FasL蛋白高表達；PCR結(jié)果顯示 Fas基因在正常滋養(yǎng)細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組、絨癌組中表達量逐漸降低，而FasL基因表達量逐漸升高。結(jié)論：在侵蝕性葡萄胎及絨癌中Fas低表達及FasL高表達，這與侵蝕性葡萄胎及絨癌的凋亡機制密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 侵襲性葡萄胎；絨癌；Fas；FasL

中圖分類號：R737.3 文獻標(biāo)識碼：B 文章編號：2095-5200（2016）03-097-03

DOI：10.11876/mimt201603036

侵襲性葡萄胎與絨毛膜上皮癌（簡稱絨癌）是妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中常見惡性腫瘤[1-3]。滋養(yǎng)細胞來源于胚胎外胚層[4]，當(dāng)其異常增生，間質(zhì)水腫，終末絨毛發(fā)生轉(zhuǎn)變，形成大小不一水泡，形成葡萄胎。葡萄胎組織侵入子宮肌層或者轉(zhuǎn)移到宮外時，具有惡性潛能即為侵襲性葡萄胎[5]。絨癌也多繼發(fā)于葡萄胎[6-8]，其惡性程度更高，更易發(fā)生全身轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者死亡。

1989年Yonehara等 [9]發(fā)現(xiàn)一種因子可以識別表達于髓樣細胞、T淋巴細胞和成纖維細胞表面的未知分子，誘導(dǎo)多種人細胞系發(fā)生凋亡，于是將這種因子命名為Fas。隨后進一步研究發(fā)現(xiàn)Fas、FasL是重要細胞凋亡調(diào)控因子，并在多種腫瘤存在異常表達[10-12]。本實驗研究Fas、FasL在正常滋養(yǎng)細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌組表達情況，以RT-PCR檢測Fas、FasL基因在正常滋養(yǎng)細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌組表達情況，為揭示侵蝕性葡萄胎組和絨癌凋亡機制提供資料。

1 材料和方法

1.1 材料

Fas、FasL抗體（福州邁新生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物公司）； RNeasy FFPE Tissue Kit試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司）；HiFi-MMLV Two Step RT-PCR Kit （北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；Golden view（莊盟國際生物基因科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本來源 收集本院2013年 3月至 2015年 9月期間臨床資料完整、病理檢查診斷明確的116例樣本（正常滋養(yǎng)細胞40例、完全性葡萄胎36例、侵襲性葡萄胎20例、絨癌20例）。在上述4組石蠟標(biāo)本中每種隨機選取5例，對每組5例石蠟標(biāo)本分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，用RT-PCR檢測Fas、FasL基因在組織中表達。

1.2.2 免疫組織化學(xué)實驗方法

1）脫蠟和水化。2）抗原修復(fù)。3）免疫組織化學(xué)染色： 3%H2O2滴加在組織上，室溫靜置10min；PBS洗3次各5min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min；滴加Ⅰ抗50μL， 4℃過夜；PBS洗3次各5min；滴加Ⅱ抗50μL，37℃20min；PBS洗3次各5min；DAB顯色2～3min，在顯微鏡下掌握染色程度；自來水沖洗5min；蘇木精復(fù)染3min，鹽酸酒精分化3秒；自來水沖洗10min；脫水、透明、封片、鏡檢。4）結(jié)果判讀：Fas及FasL 蛋白以胞漿、包膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞，具體判斷標(biāo)準(zhǔn)是按照染色強度和顯色細胞占總細胞百分比結(jié)合進行評分：陽性強度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別記為0、1、2、3分，顯色細胞占總細胞百分比<5%、5%～25%、26%～50%、>50%分別記為0、1、2、3分，兩項積分相乘，>3分記為陽性。

1.2.3 石蠟組織總RNA提取 使用RNeasy FFPT試劑盒，按照說明書提取各組標(biāo)本總RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)體系得到cDNA，用RT-PCR方法檢測Fas、FasL基因表達。RT-PCR對Fas、FasL基因引物進行擴增，條件如下：98℃ 10s，56/57℃ 30s，72℃ 30s，40個循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像儀顯示，以ActinPCR擴增作為內(nèi)參。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS11.0軟件系統(tǒng)，計數(shù)資料進行χ2檢驗或Fishers確切概率法檢驗，相關(guān)比較采用Spearman等級相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測Fas、FasL蛋白表達情況

從表1來看，F(xiàn)as蛋白在正常滋養(yǎng)細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌組陽性表達率下降，F(xiàn)asL蛋白在正常滋養(yǎng)細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌陽性表達率依次升高。

2.2 Fas、FasL 基因表達

從圖1結(jié)果來看，F(xiàn)as基因在正常滋養(yǎng)細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組、絨癌中表達量逐漸降低，F(xiàn)asL基因正常滋養(yǎng)細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組、絨癌中表達量逐漸升高。

3 討論

侵襲性葡萄胎與絨癌[13-14]均起源于葡萄胎。以陰道不規(guī)則出血、子宮復(fù)舊不全或不均勻增大，偶有腹痛，易發(fā)生宮外轉(zhuǎn)移為主要特點?；瘜W(xué)療法是侵襲性葡萄胎與絨癌主要治療手段[15]，通過聯(lián)合用藥抑制癌細胞增殖。但是在治療過程中，患者經(jīng)常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，這種現(xiàn)象與Fas、FasL因子密切相關(guān)。

Fas屬于壞死因子/神經(jīng)生長因子分子受體超家族成員[16]，在細胞凋亡及體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。FasL屬于Ⅱ型跨膜蛋白和腫瘤壞死因子家族成員[17]，能與Fas特異性結(jié)合，誘導(dǎo)細胞發(fā)生程序性凋亡。但是在惡性腫瘤細胞中Fas低表達或者不表達，避開殺傷性T 細胞表面FasL介導(dǎo)的細胞凋亡，使癌細胞在體內(nèi)存活下來。在惡性腫瘤細胞表面FasL表達增加，與激活T 淋巴細胞表面 Fas 結(jié)合，誘導(dǎo)T細胞凋亡，從而破壞機體免疫系統(tǒng)。

本實驗發(fā)現(xiàn)Fas蛋白在正常滋養(yǎng)細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌組陽性表達率逐漸下降，F(xiàn)as蛋白在正常組表達量明顯高于侵蝕性葡萄胎組和絨癌組表達量，F(xiàn)asL蛋白在正常組表達量明顯低于侵蝕性葡萄胎組和絨癌組表達量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。PCR結(jié)果亦顯示 Fas基因、FasL基因表達與免疫組化結(jié)果相符。說明Fas、FasL與細胞凋亡密切相關(guān)。

Fas、FasL 在侵蝕性葡萄胎和絨癌發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，研究表明Fas、FasL參與化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡過程，表現(xiàn)出與多種腫瘤的耐藥性相關(guān)，下一步可針對Fas、FasL基因藥物靶向進行深入研究。

參 考 文 獻

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