秦彥濤　馬琰　吳佩玲

[摘 要] 目的：分析持續(xù)性根尖周炎（Persistent periapical periodontitis，PRP）根管外菌群特點，明確根管外菌群在PRP發(fā)生、發(fā)展中扮演的角色。方法：我院擬行根尖手術的PRP患者中選取13例13顆患牙及10例10顆正畸拔除牙，使用Brown&Brenn染色進行觀察及細菌培養(yǎng)。結(jié)果：正畸拔除牙染色結(jié)果均未見明顯異常。PRP患牙Brown&Brenn染色可見相互交織、聚集的革蘭陰性菌及革蘭陽性菌。13顆患牙共檢出根管外菌群86個，檢出菌種以兼性厭氧菌、專性厭氧菌、需氧菌為主，其中丙酸菌屬檢出率最高，構(gòu)成比為16.3%，其次為放線菌屬，構(gòu)成比為12.8%。結(jié)論：PRP存在根管外感染，其感染菌群以丙酸均屬、放線菌屬為主，在PRP發(fā)生發(fā)展過程中占據(jù)了重要地位。

[關鍵詞] 持續(xù)性根尖周炎；根管外菌群；細菌培養(yǎng)

中圖分類號：R781.3 文獻標識碼：B 文章編號：2095-5200（2016）03-043-03

DOI：10.11876/mimt201603016

持續(xù)性根尖周炎（Persistent periapical periodontitis，PRP）是指原發(fā)性根尖周炎經(jīng)完善的根管治療后，根尖周病變未愈或出現(xiàn)新的根尖周病變[1]。根管外感染是導致PRP綿延不愈的主要原因，且根管預備、根管消毒及根管充填等前期治療過程往往導致根管外致病微生物群落發(fā)生變化以及局部微生態(tài)環(huán)境復雜度加劇[2]。因此，明確PRP根管外菌群構(gòu)成特點，是了解其作用機制、解釋治療失敗原因、指導根管感染預防和治療的關鍵[3]，目前國內(nèi)關于這一方向文獻較為缺乏。我們以13顆擬行根尖手術的PRP患牙及10顆正畸拔除牙為樣本進行了前瞻性對照分析，具體如下。

1 一般資料

本研究患者均知情同意并簽署知情同意書。PRP患牙選取標準：1）參照文獻標準確診PRP，擬行外科手術或拔除治療[4]；2）根管治療次數(shù)≥2次，距離上次慢性根尖周炎治療時間≥2年；3）X線片可見根充止點距離根尖距離在0～2 mm內(nèi)，根管充填致密但根尖病損未見治愈，且根尖伴有直徑<1 cm的根尖暗影。排除合并根折、根管側(cè)穿或內(nèi)吸收、牙周病損與根尖病變連通以及入組前3個月內(nèi)有抗菌藥物使用史患者。

2 研究方法

2.1 樣本采集

正畸拔除牙樣本采集：將患牙拔除后立即置入含有0.9%滅菌生理鹽水的采樣瓶中，并迅速轉(zhuǎn)移至實驗室超凈工作臺，以0.9%滅菌生理鹽水充分沖洗表面血污。術中操作嚴格遵循無菌原則。

PRP患牙樣本采集：術前囑患者使用0.12%氯己定漱口3 min，而后以2%利多卡因（含1：50000腎上腺素）局麻，使用1%碘酊行術區(qū)消毒。按照術前X線片示病變范圍，術中作弧形切口，將全厚瓣切開，使用滅菌低速手機及球鉆將根尖區(qū)頰側(cè)骨質(zhì)切除，使根尖病損區(qū)域暴露，而后使用無菌挖匙將根尖周圍肉芽組織完全挖除，暴露根尖。使用滅菌高速手機及金剛砂車針，沿牙長軸垂直方向截取根尖樣本，截取長度約為3 mm[5]。手術全程使用無菌生理鹽水降溫，取樣過程中嚴格避免唾液污染，并盡可能減少根尖組織與空氣的接觸[6]。分離樣本后的放置、轉(zhuǎn)移處理同正畸拔除牙樣本采集。

2.2 樣本觀察

細菌Brown&Brenn染色：將獲取的全部樣本使用2%戊二醛于4℃環(huán)境下固定48 h，使用無菌輪型金剛砂車針于超凈工作臺中截取樣本。截取完畢后，使用去離子水洗滌3次，注意洗滌操作需輕柔、緩慢，而后加適量去離子水，于-80℃冰箱中冷凍過夜，取出后置入冷凍干燥機中，48 h后以滅菌10% EDTA脫鈣液持續(xù)脫鈣35～40 d，每隔2～3 d更換一次脫鈣液。脫鈣完畢后，行脫水、石蠟包埋處理，自根尖向牙冠方向制備橫斷面連續(xù)組織切片，厚度為5 μm。使用細菌Brown&Brenn染色處理切片，置于光學顯微鏡下拍照、觀察[7]。

細菌培養(yǎng)：將樣本置于轉(zhuǎn)運液中，加入滅菌玻璃珠（直徑3 mm），漩渦振蕩5 min，分離根管外微生物，以12000 r/min離心5 min，取沉淀物，使用細菌DNA提取試劑盒，利用16S rDNA克隆測序法對菌群特點進行分析[8]。

3 結(jié)果

3.1 細菌染色結(jié)果

染色結(jié)果顯示PRP患牙根尖區(qū)外表面可見明顯染色陽性的根管外生物膜包繞，并存在紅染革蘭陰性菌、紫染革蘭陽性菌相互交織或積聚成團，周圍包繞大量基質(zhì)樣物質(zhì)，形態(tài)包括球菌、桿菌、放線菌及螺旋菌等，根管外生物膜厚度17～31 μm；部分PRP患牙根面可見牙骨質(zhì)吸收區(qū)，且吸收陷窩中積聚大量細菌，細菌侵入牙本質(zhì)但未累及牙髓腔。正畸拔除牙樣本染色僅見牙本質(zhì)及牙骨質(zhì)，顯黃染，未見紅染或紫染區(qū)域。

3.2 細菌培養(yǎng)結(jié)果

13顆患牙共檢出根管外菌群86個，檢出菌種以兼性厭氧菌、專性厭氧菌、需氧菌為主，其中丙酸菌屬（丙酸桿菌屬、丙酸丙酸鹽桿菌）檢出率最高，構(gòu)成比為16.3%，其次為放線菌屬，構(gòu)成比為12.8%，見表1。

4 討論

臨床上約有10%～20%的根尖周炎患者在接受規(guī)范的根管治療方案后，影像學仍可見持續(xù)性或進行性擴大的根尖周暗影，并伴有咬合痛等各類主觀不適癥狀，經(jīng)反復治療仍無法得到有效緩解[9]。根管系統(tǒng)內(nèi)和根尖孔外存在的微生物定植及感染是導致根管治療效果受限的主要原因[10]，定植于根管內(nèi)的細菌可自根尖孔侵入根管外，并于牙骨質(zhì)上形成生物膜結(jié)構(gòu)，影響常規(guī)機械和藥物性牙髓治療效果。

有研究應用掃描電鏡[11]對PRP患牙進行觀察，結(jié)果顯示，PRP患牙掃描電鏡可見明顯病變狀態(tài)及大量細菌定植。掃描電鏡可獲取準確、清晰的形態(tài)學信息，能夠有效顯示生物膜表面結(jié)構(gòu)，但對生物膜內(nèi)細菌形態(tài)和分布的觀察作用十分有限，這主要與細菌在成熟生物膜結(jié)構(gòu)中常被大量基質(zhì)樣成分包繞有關[12]。因此，需采用其他方案進一步判斷生物膜是否存在、明確生物膜結(jié)構(gòu)狀態(tài)[13]。本研究以細菌Brown&Brenn染色、DNA測序方法進行對照研究。

細菌Brown&Brenn染色結(jié)果表明，正畸拔除牙樣本未見膠原纖維吸收、牙骨質(zhì)破壞等病損狀態(tài)，且未見紅染或紫染區(qū)域，與Wang等[14]研究結(jié)果相同，表明正畸拔除牙根管外無生物膜形成，亦不存在細菌感染。PRP患牙根管外可見大量革蘭陽性菌、革蘭陰性菌定植，并在生物膜的包繞下附著于根尖區(qū)外表面，且伴隨著根尖骨質(zhì)吸收、膠原纖維破壞甚至牙骨質(zhì)的暴露與吸收。Murad等[15]指出，生物膜的特殊結(jié)構(gòu)可將細菌包裹于胞外基質(zhì)中，將細菌與機體免疫防御因子及液體沖刷隔離開來，對細菌的繁殖、生長起到保護作用，且根管外生物膜常處于隱蔽位置，常規(guī)根管治療往往無法涉及這些部位，導致治療效果受限。此外，Tennert等[16]發(fā)現(xiàn)，處于胞外基質(zhì)的細菌可結(jié)合抗菌因子，在阻止抗菌因子向胞內(nèi)擴散的同時增強生物膜的耐藥性，進一步影響抗菌藥物發(fā)揮作用。上述機制可能是導致PRP綿延難愈的主要原因，Segura-Egea等[17]亦發(fā)現(xiàn)，病程越長、生物膜中細菌數(shù)量越高、細菌毒性越強及分布范圍越大的PRP患者，治療越困難且預后更差。我們通過擴增細菌16S rDNA序列發(fā)現(xiàn)，PRP根管外菌群以放線菌屬和丙酸菌屬為主，與Van der Waal[18]等研究結(jié)論相仿。

本研究在解釋PRP發(fā)生機制的同時，也為PRP治療失敗的原因提出了參考，即根管外菌群的大量定植及生物膜的良好保護作用，由于條件所限，我們未能進一步明確PRP根管外定植的具體菌群?？傮w而言，根管外菌群在PRP的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色，在今后的臨床治療中，可以將清除根管外菌群作為努力方向。

參 考 文 獻

[1] 李紅， 侯本祥. 持續(xù)性根尖周炎根外生物膜的研究進展[J]. 國際口腔醫(yī)學雜志， 2013， 40（6）： 754-757.

[2] WANG J，JIANG Y，CHEN W，et al. Bacterial flora and extraradicular biofilm associated with the apical segment of teeth with post-treatment apical periodontitis[J]. J Endod， 2012， 38（7）： 954-959.

[3] Saber M H， Schwarzberg K， Alonaizan F A， et al. Bacterial flora of dental periradicular lesions analyzed by the 454-pyrosequencing technology[J]. J Endod， 2012， 38（11）： 1484-1488.

[4] 王兢兢， 王娟. 持續(xù)性根尖周炎患牙根管外細菌定植狀態(tài)的觀察[J]. 口腔醫(yī)學， 2015， 35（2）： 85-88.

[5] MARTIN-GONZALEZ J，CARMONA-FERNANDEZ A，PEREZ-PEREZ A，et al. Expression and immunohistochemical localization of leptin in human periapical granulomas[J]. Med Oral， 2014， 20（3）： e334-339.

[6] Leal A S M， de Oliveira A E F， Brito L M O， et al. Association between Chronic Apical Periodontitis and Low-birth-weight Preterm Births[J]. J Endod， 2015， 41（3）： 353-357.

[7] 楊玥， 侯本祥， 張琛. 持續(xù)性根尖周炎中糞腸球菌臨床株的分離與鑒定[J]. 北京口腔醫(yī)學， 2015， 23（2）： 97-100.

[8] Saoud T M A， Huang G T J， Gibbs J L， et al. Management of teeth with persistent apical periodontitis after root canal treatment using regenerative endodontic therapy[J]. J Endod， 2015， 41（10）： 1743-1748.

[9] 王景暉， 石靈萍， 劉志壽. 并發(fā)根尖周炎對根管治療患者持續(xù)性根尖周感染影響的研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志， 2015， 25（16）： 90-93.

[10] Signoretti F G C， Gomes B P F A， Montagner F， et al. Investigation of cultivable bacteria isolated from longstanding retreatment-resistant lesions of teeth with apical periodontitis[J]. J Endod， 2013， 39（10）： 1240-1244.

[11] 王娟， 唐志娟， 李謹， 等. 根管治療后伴或不伴根尖周炎患牙根管內(nèi)微生物群落的比較分析[J]. 中華口腔醫(yī)學雜志， 2014， 49（10）： 607-613.

[12] Arnold M， Ricucci D， Siqueira J F. Infection in a complex network of apical ramifications as the cause of persistent apical periodontitis： a case report[J]. J Endod， 2013， 39（9）： 1179-1184.

[13] 周耀， 王娟. 持續(xù)性根尖周炎根尖區(qū)微生物群落多樣性分析[J]. 口腔生物醫(yī)學， 2014， 5（3）： 120-124.

[14] WANG QQ，ZHANG CF，CHU CH，et al. Prevalence of Enterococcus faecalis in saliva and filled root canals of teeth associated with apical periodontitis[J]. Int J Oral Sci， 2012， 4（1）： 19-23.

[15] Murad C F， Sassone L M， Faveri M， et al. Microbial diversity in persistent root canal infections investigated by checkerboard DNA-DNA hybridization[J]. J Endod， 2014， 40（7）： 899-906.

[16] Tennert C， Fuhrmann M， Wittmer A， et al. New bacterial composition in primary and persistent/secondary endodontic infections with respect to clinical and radiographic findings[J]. J Endod， 2014， 40（5）： 670-677.

[17] Segura-Egea J J， Castellanos-Cosano L， Machuca G， et al. Diabetes mellitus， periapical inflammation and endodontic treatment outcome[J]. Med Oral Patol Oral Cir Bucal， 2012， 17（2）： e356.

[18] VAN DER WAAL SV，LAPPIN DF，CRIELAARD W. Does apical periodontitis have systemic consequences？ The need for well-planned and carefully conducted clinical studies[J]. Br Dent J， 2015， 218（9）： 513-516.