劉海映，張秀芹，隋宥珍，李宏俊，邢坤*，姜玉聲，楊貴福，陳雷，張娜

(1.大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116023; 2.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧 大連 116023; 3.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

口蝦蛄高血糖激素基因全長cDNA的克隆及表達(dá)分析

劉海映1，張秀芹1，隋宥珍1，李宏俊2，邢坤1*，姜玉聲3，楊貴福1，陳雷1，張娜1

(1.大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116023; 2.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧 大連 116023; 3.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

摘要：本文首次采用RACE技術(shù)獲得口蝦蛄(Oratosquilla oratoria)眼柄部高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone，CHH)基因cDNA全長序列，共2 421 bp，5′UTR長度為180 bp，3′UTR 為1 821 bp，開放閱讀框(ORF)長420 bp，編碼139個(gè)氨基酸。預(yù)測蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋23.74%，延伸鏈占23.02%，無規(guī)則卷曲占53.24%，預(yù)測分子量為15.47 kD，等電點(diǎn)(pI)為7.049。CHH成熟肽包含6個(gè)CHH家族中位置保守的Cys殘基，C端為GK，推斷為ES型CHH基因。聚類分析表明：口蝦蛄CHH和十足目CHH聚為同一個(gè)分支的兩亞群，具有較近的親緣關(guān)系。熒光定量PCR分析結(jié)果表明，CHH基因在腸中表達(dá)量最高，在眼柄、觸角中有較高的表達(dá)量，在肌肉中表達(dá)量相對(duì)較低，在卵巢中表達(dá)最低，而在精巢中不表達(dá)。

關(guān)鍵詞：口蝦蛄；高血糖激素CHH；分子克隆；熒光定量PCR；表達(dá)分析

1引言

高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone，CHH)是甲殼動(dòng)物眼柄中含量豐富且研究最多的激素，由眼柄X器官-竇腺復(fù)合體合成和分泌，在甲殼類動(dòng)物的生長、繁殖和蛻皮等生理過程中具有重要作用[1—2]。與高血糖激素協(xié)同調(diào)控作用的CHH家族神經(jīng)多肽激素還包括蛻皮抑制激素(molt-inhibiting hormone，MIH)、性腺抑制激素(gonad-inhibiting hormone，GIH)和大顎器抑制激素(mandibular organ-inhibiting hormone，MOIH)等，這些神經(jīng)多肽激素氨基酸序列具有較高的相似性。CHH基因不僅對(duì)甲殼類動(dòng)物蛻皮和生殖起重要作用，同時(shí)還參與了調(diào)控甲殼動(dòng)物的能量代謝、血糖調(diào)節(jié)和滲透壓調(diào)節(jié)等重要生理活動(dòng)[3—7]。甲殼動(dòng)物高血糖激素神經(jīng)肽由信號(hào)肽，相關(guān)肽(precursor-related peptide，CPRP)，二鹽基切割位點(diǎn)(KR或RR)，成熟肽72-74氨基酸和C端酰氨化封阻位點(diǎn)組成[6，8]。根據(jù)相關(guān)肽基因序列(CPRP)的有無可以將CHH家族神經(jīng)肽分為CHH與MIH/GIH/MOIH兩個(gè)亞族，即CHH Ⅰ族與CHH Ⅱ族。目前，CHH基因已相繼在日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)[9]、美洲螯龍蝦(Homarusamericanus)[10]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[11]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)[12]、刀額新對(duì)蝦(Metapenaeusensis)[13]、紅斑青蟹(Callinectessapidus)[14]等多種甲殼類動(dòng)物中克隆，同時(shí)CHH基因的分子結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)等方面也被深入地研究[9，14]。然而，這些工作在蝦蟹的研究多以十足目物種為研究對(duì)象，且CHH基因在甲殼動(dòng)物中的進(jìn)化關(guān)系至今尚不清楚。因此，有必要對(duì)包括口足目在內(nèi)的甲殼動(dòng)物CHH基因序列特性進(jìn)行研究，為探甲殼動(dòng)物生長、繁殖相關(guān)基因的功能演化提供重要依據(jù)。

口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)俗稱蝦爬子，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、軟甲亞綱(Eumalacostraca)、口足目(Stomatopoda)、蝦蛄科(Squillidae)、口蝦蛄屬(Oratosquilla)?？谖r蛄作為我國沿海地區(qū)重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)甲殼類漁業(yè)資源，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。國內(nèi)外關(guān)于口蝦蛄分子生物學(xué)的研究主要集中在遺傳多樣性分析等方面[15—17]，對(duì)口蝦蛄功能基因的報(bào)道很少[18]，而口蝦蛄CHH基因的功能性研究目前尚未見報(bào)道。本文以口蝦蛄為實(shí)驗(yàn)材料，采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)方法克隆CHH基因全長cDNA序列，對(duì)CHH基因在口蝦蛄不同組織中表達(dá)規(guī)律進(jìn)行熒光定量分析，旨在為口蝦蛄蛻皮等相關(guān)功能研究和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為其他甲殼類動(dòng)物CHH家族基因的功能研究提及進(jìn)化機(jī)制提供參考。

2材料與方法

2.1材料

2.1.1實(shí)驗(yàn)蝦蛄

口蝦蛄來自大連近岸水域，取性腺發(fā)育成熟的雌雄個(gè)體，體長范圍為10.5～16.0 cm，在實(shí)驗(yàn)室控溫循環(huán)水槽中暫養(yǎng)1周，水溫維持在25℃，pH 8.2，持續(xù)充氣，每天投喂新鮮菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)兩次。

2.1.2試劑和儀器

3′-Full RACE Core Setwith PrimeScriptTMRTases試劑盒、5′-Full RACE Core Setwith PrimeScriptTMRTases試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)均購自Takara；pEASY-T1載體、感受態(tài)細(xì)胞Trans5αChemically Competent Cell(TransGen Biotech)；動(dòng)物總RNA快速抽提試劑盒、全血總RNA快速抽提試劑盒、AXYGEN 柱式凝膠回收試劑盒、去RNA酶離心管等均來自Sangon Biotech；PCR引物由Sangon Biotech合成。實(shí)驗(yàn)所用儀器包括微型離心機(jī)(日本TOMY)，紫外分光光度計(jì)(Eppendorf BioPhotometer)，梯度PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf Autherized Thermal Cycler)，凝膠成像系統(tǒng)(UVPEC3 Imaging System)；熒光定量PCR儀(TaKaRa Code TP700)。

2.2方法

2.2.1總RNA提取與cDNA的合成

口蝦蛄總RNA的提取，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣本，每個(gè)樣本挑選3只活力好的成體口蝦蛄，分別提取血淋巴、眼柄、觸角、肌肉、精巢、卵巢、腦和腸道8個(gè)組織的總RNA。抽取血液3 mL，采用全血總RNA快速抽提試劑盒提取總RNA；取眼柄6只(約25 mg)，剝離色素組織后迅速溶入液氮，按照動(dòng)物總RNA快速抽提試劑盒提取總RNA，其他組織總RNA的提取同眼柄。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測各組織總RNA的完整性，并通過紫外分光光度計(jì)測定OD260和OD280值，檢驗(yàn)總RNA純度及濃度。眼柄總RNA按照Full RACE Core Setwith PrimeScriptTMRTases試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，-20℃保存，用于后續(xù)CHH基因cDNA全長序列的克隆；按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，-20℃保存，以備于不同組織的表達(dá)熒光定量PCR檢測。反轉(zhuǎn)錄體系為：總RNA為10 μL、5×PrimeScript buffer 2 (for Real Time) 4 μL、PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1 μL、RT Primer mix 1 μL、RT Primer mix 1 μL、RNase Free dH2O 4 μL。反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。

2.2.2口蝦蛄CHH基因全長的克隆

通過Blast搜索，利用口蝦蛄肌肉組織轉(zhuǎn)錄組文庫篩選出的CHH基因部分序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)3′RACE特異性引物(CHH3-1和CHH3-2)并合成(表1)。根據(jù)3′-Full RACE試劑盒說明書，以口蝦蛄眼柄cDNA為模板擴(kuò)增CHH基因cDNA的3′端序列。Outer PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，20個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10 min；反應(yīng)體系25 μL。Inner PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10 min；反應(yīng)體系50 μL。Inner PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收DNA后，與pEASY-T1載體連接，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，37℃孵育1 h后接種LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取陽性單克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床中培養(yǎng)9 h，取3個(gè)平行菌液各1 mL，送往北京六合華大基因科技股份有限公司測序，并采用NCBI中Blastx軟件對(duì)3′端cDNA序列進(jìn)行同源性分析。

根據(jù)已得CHH基因3′端cDNA序列結(jié)合口蝦蛄肌肉組織轉(zhuǎn)錄組文庫，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)5′RACE特異性引物(CHH-5)(表1)，并根據(jù)5′-Full RACE試劑盒說明書擴(kuò)增CHH基因cDNA的5′端序列。反應(yīng)循環(huán)數(shù)為25，其他條件同上。

2.2.3序列拼接和分析。

應(yīng)用ContigExpress軟件將3′端和5′端序列進(jìn)行拼接后得到口蝦蛄CHH基因全長cDNA序列。在NCBI中ORF尋找開放閱讀框并翻譯出相應(yīng)的氨基酸序列，通過GOR方法在線預(yù)測對(duì)CHH蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析；利用SignaP 4.0軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測；使用ClustalX軟件及DNAStar軟件包中的MegAlign軟件對(duì)蛋白序列作比對(duì)及同源性分析，并用MAGE4.0軟件對(duì)甲殼動(dòng)物CHH氨基酸序列進(jìn)行NJ(Neighbour-Joining法)系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建[19—20]。

2.2.4實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析

根據(jù)獲得的CHH基因全長cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量特異引物CHH-F和CHH-R，由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)合成內(nèi)參引物Actb-F和Actb-R(表1)。分別將3個(gè)平行樣本反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA混合作為模板。RT-PCR反應(yīng)體系為25 μL：上下游引物各1 μL，12.5 μL的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)(2×)，8.5 μL的dH2O模板cDNA 2 μL(總量50 ng)。PCR反應(yīng)條件(兩步法)：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。對(duì)各樣品的目的基因和管家基因(Actb)分別做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)做3個(gè)不加cDNA模板的陰性對(duì)照重復(fù)，反應(yīng)條件同上。

應(yīng)用SYBR Green Ⅰ熒光染料嵌合法，將管家基因作為內(nèi)參基因，分別對(duì)各樣品的管家基因和目的基因進(jìn)行定量，將眼柄CHH基因mRNA的表達(dá)量設(shè)定為1，用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。

表1　口蝦蛄CHH基因克隆和熒光定量PCR所用的引物及其序列

圖1　口蝦蛄CHH cDNA序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1　Nucleotide and deduced amino acid sequences of Oratosquilla oratoria CHH cDNAs陰影部分表示信號(hào)肽;下劃線表示CHH前體相關(guān)肽;二鹽基切割位點(diǎn)用豎線(|)表示;潛在的酰胺化位點(diǎn)(Gly138)用斜體表示;“*”表示終止密碼子Signal peptide is shaded;CHH-precursor related peptide is underlined;the vertical line(|)indicates the dibasic cleavage site(KR);the putative amidation site(Gly138)is italic;the asterisk indicates stop codon

3結(jié)果和分析

3.1CHH基因全長cDNA的克隆

采用3′RACE和5′RACE獲得1 969 bp的3′端片段以及751 bp的5′端片段，兩端重疊部分的堿基包含292 bp。經(jīng)ContigExpress軟件拼接后得到2 421 bp CHH基因cDNA序列全長，包括180 bp 5′UTR，420 bp的ORF和終止密碼子，1 821 bp的3′UTR，3′端非編碼區(qū)沒有加尾信號(hào)，但具有典型的Poly(A)尾(圖1)。

3.2CHH基因序列生物信息學(xué)分析

開放閱讀框編碼129個(gè)氨基酸，用DNAMAN軟件分析得到該CHH蛋白分子量為15.47 kD，理論等電點(diǎn)pI為7.049，堿性氨基酸15個(gè)，酸性氨基酸15個(gè)，疏水性氨基酸46個(gè)，極性氨基酸44個(gè)。GOR方法在線預(yù)測CHH蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，該蛋白由α-螺旋23.74%，延伸鏈23.02%，無規(guī)則卷曲53.24%組成。

Signal 4.0 Server在線預(yù)測，口蝦蛄CHH前體信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在Ser24和Arg25之間，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CHH前體相關(guān)肽(CPRP)和成熟肽連接位點(diǎn)即二鹽基切割位點(diǎn)是“K64R65”。由此可知，CHH前體包含信號(hào)肽(24個(gè)Aa)、CPRP(39個(gè)Aa)、二鹽基切割位點(diǎn)KR和成熟肽(74個(gè)Aa)，且在成熟肽部分第12個(gè)氨基酸位上沒有CHH家族Ⅱ型肽所特有的Gly殘基。成熟肽包含在CHH家族中6個(gè)半胱氨酸Cys殘基(Cys72，Cys88，Cys91，Cys104，Cys108，Cys117)和5個(gè)保守的氨基酸殘基(Arg78，Asp90，Asn93，Arg96，和Phe114)，N末端沒有焦谷氨酸殘基封阻，但C端具有潛在的酰氨化封阻位點(diǎn)Gly138(圖2)。

圖2　口蝦蛄CHH前體與其他十足目甲殼動(dòng)物CHH前體的氨基酸序列比對(duì)Fig.2　Alignment of precursor amino acide sequence of Oratosquilla oratoria CHH with other decapod crustacean prepro-CHHs豎線“┃”表示信號(hào)肽和二鹽基的切割位點(diǎn)；灰色部分為保守氨基酸The single peptide and dibasic cleavage sites are indicated by the vertical line “┃”；signal with grey is conservative amino acids

圖3　口蝦蛄CHH成熟肽與其他甲殼動(dòng)物MIH前體的氨基酸序列比Fig.3　Multiple alignments of Oratosquilla oratoria CHH with MIHs from other crustaceans灰色部分為保守氨基酸;綠色部分是MIH基因特有的氨基酸Signal with grey is conservative amino acid and green is the specific amino acids of MIH

3.3序列比對(duì)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

采用RACE技術(shù)從口蝦蛄眼柄中獲得了CHH基因cDNA全長，將該基因及其編碼的氨基酸序列與已公布的蝦蟹類CHH、MIH和GIH序列(表2)比對(duì)，結(jié)果表明(圖2、圖3b和表3)：推導(dǎo)的前體與寄居蟹(Pagurusbernhardus)CHH的同源性最高，達(dá)到了47%；其次是與日本沼蝦CHH和挪威海螯蝦(Nephropsnorvegicus)CHHA前體相似(44%)；與其他蝦蟹的CHH前體、MIH前體和GIH前體同源性相對(duì)較低(34%～43%、30%～33%和22%～30%)?？谖r蛄CHH成熟肽同樣與寄居蟹CHH的同源性最高(59%)，而與鎧甲蝦(Galatheastrigosa)CHH的相似性達(dá)到58%；與挪威海螯蝦CHHA、挪威海螯蝦CHHB和歐洲鰲龍蝦(Homarusgammarus)CHHA的成熟肽相似性均達(dá)57%，與其他蝦蟹類的同源性為46%～55%。

表2　用于比對(duì)的甲殼動(dòng)物CHH/MIH/GIH

續(xù)表2

表3　口蝦蛄CHH與其他十足目CHH/MIH成熟肽和前體的相似性

圖4　口蝦蛄與其他甲殼動(dòng)物CHH前體的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4　Neighbor-Joining phylogenetic tree analysis of Oratosquilla oratoria and other crustaceans preproCHH

圖5　RT-PCR方法檢測CHH基因在口蝦蛄不同組織內(nèi)的表達(dá)Fig.5　Expressions of CHH mRNA in different tissues of Oratosquilla oratoria by RT-PCR

使用MEGA4.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果表明CHH家族中的MIH、CHH和GIH氨基酸序列聚為2個(gè)不同的亞類，其中GIH和MIH聚為一亞類，CHH單獨(dú)聚為一亞類，這與CHH家族成員的分組相一致。另外，CHH組又聚成2個(gè)分支，其中口蝦蛄CHH為一分支，而十足目蝦蟹類的CHH聚為另一分支。

3.4口蝦蛄CHH基因的組織表達(dá)分析

采用熒光定量 PCR 技術(shù)檢測CHH基因在口蝦蛄體內(nèi)不同組織的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)對(duì)于每個(gè)組織CHH基因及管家基因分別做3個(gè)重復(fù)(圖5)。結(jié)果顯示，口蝦蛄CHH基因除了在在精巢中沒有表達(dá)外，在所檢測的其它組織中均有表達(dá)，其表達(dá)量由高到低依次為腸、眼柄、腦、肌肉和卵巢。若將卵巢表達(dá)量設(shè)為1，腸中含量最高，為卵巢的1 033.67倍；其次眼柄的表達(dá)量為卵巢的531.23倍，觸角組織的表達(dá)量為卵巢的295.07倍；在腦的表達(dá)量為卵巢的115.6倍；在肌肉中的表達(dá)量較低，僅為卵巢的1.67倍。

4討論

4.1口蝦蛄CHH序列特征

甲殼動(dòng)物CHH神經(jīng)肽激素家族的蛋白質(zhì)組成包括72～78個(gè)氨基酸的高度保守序列[21—22]。同源基因序列比對(duì)結(jié)果表明(圖2)，口蝦蛄CHH前體序列與其他甲殼動(dòng)物CHH氨基酸序列結(jié)構(gòu)一致，前體包括信號(hào)肽的24個(gè)氨基酸、成熟肽的74個(gè)氨基酸，還有CHH家族Ⅰ型神經(jīng)肽所特有的CHH前體相關(guān)肽，以及二鹽基切割位點(diǎn)KR。其信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在Ser24和Arg25之間，這與其他蝦蟹類CHH的信號(hào)肽切割位點(diǎn)相對(duì)位置一致[9]。成熟肽具有6個(gè)保守的Cys殘基和5個(gè)保守的氨基酸殘基(Arg78、Asp90、Asn93、Arg96、Phe114)，6個(gè)保守的半胱氨酸殘基間形成3個(gè)二硫鍵，推測這些高度保守的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)可能與其基本生理功能作用密切相關(guān)。從以上的序列結(jié)構(gòu)特征分析可以得出該序列為口蝦蛄的CHH cDNA序列，口蝦蛄CHH成熟肽N末端雖沒有焦谷氨酸殘基封阻，但具有酰氨化封阻位點(diǎn)GK，推導(dǎo)為ES型CHH基因。

口蝦蛄CHH和其他十足目蝦蟹MIH的氨基酸序列相比對(duì)(圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：成熟肽氨基酸序列相似性相對(duì)較低，且在成熟肽部分第12個(gè)氨基酸位上沒有CHH家族Ⅱ型神經(jīng)肽(MIH，GIH)所特有的Gly殘基，但其高度保守的氨基酸都集中在6個(gè)半胱氨酸殘基周圍。系統(tǒng)發(fā)育樹中也可以看出，CHH與MIH和GIH距離較遠(yuǎn)，如此表明，它們雖然同處一個(gè)家族中，但氨基酸的組成不同，且在序列長度上也存在很大差異的。目前，在黑背陸地蟹(Gecarcinuslateralis)[23]和利莫斯螯蝦(Orconecteslimosus)[24]的CHH具有抑制蛻皮的作用，由于CHH分子的空間結(jié)構(gòu)與MIH存在一定的相似性，據(jù)此引起CHH與Y器官表面受體發(fā)生特異性結(jié)合，從而抑制了蛻皮活動(dòng)。在日本囊對(duì)蝦MIH基因結(jié)構(gòu)的研究中，Katayama等曾指出，成熟肽第72位點(diǎn)上的氨基酸(Ile)對(duì)于MIH的活性至關(guān)重要[25]，但是在口蝦蛄以及十足目蝦蟹的CHH成熟肽中第72位點(diǎn)上的氨基酸是Val。經(jīng)分析可知，Val與Ile都屬于非極性氨基酸，因此推測口蝦蛄CHH成熟肽72位點(diǎn)上氨基酸(Val)很可能是行使抑制蛻皮功能的重要位點(diǎn)[11]。

4.2口蝦蛄 CHH 系統(tǒng)進(jìn)化

系統(tǒng)進(jìn)化顯示整個(gè)CHH系統(tǒng)發(fā)育樹口蝦蛄CHH基因與十足目蝦蟹類的CHH為同一個(gè)分支的2個(gè)亞組，然后與十足目蝦蟹類的MIH、GIH聚為一簇，口蝦蛄CHH與MIH、GIH進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。由圖3可知，十足目蝦蟹類的CHH又分為枝鰓亞目(M.ensis，P.monodon)和腹胚亞目2支，其中腹胚亞目蝦蟹類的CHH分為2個(gè)亞群：螯蝦下目(H.gammarus，H.americanus，O.limosus)、龍蝦下目(N.norvegicus)、真蝦下目(M.lanchesteri，M.nipponense)的CHH屬于一個(gè)亞群，短尾下目(C.maenas，C.productus，S.olivacea，P.pelagicus，G.natalis)的CHH則屬于另一個(gè)亞群，這些物種的CHH基因的進(jìn)化關(guān)系與甲殼動(dòng)物分類系統(tǒng)一致[26]。進(jìn)化分析表明氨基酸序列同源性較高的物種間CHH基因功能類似[6]。此外，大多數(shù)蝦蟹的CHH形成各自下目的分支結(jié)構(gòu)，表明CHH基因序列的演變可能隨著不同門類甲殼動(dòng)物的獨(dú)自進(jìn)化后產(chǎn)生。

在十足目蝦蟹CHH 的進(jìn)化分支中有5處booststrap值低于50%，這可能是由于參考比對(duì)的物種均屬于不同下目分類，如日本沼蝦、羅氏沼蝦、熱液口蝦屬于真蝦下目，而螯龍蝦、利莫斯螯蝦屬螯蝦下目，挪威海螯蝦屬于龍蝦下目。研究發(fā)現(xiàn)，CHH家族神經(jīng)多肽激素CHH的系統(tǒng)演化與口蝦蛄的酚氧化酶(proPO) 氨基酸序列在甲殼動(dòng)物中聚類分析結(jié)果一致[18]。隨著越來越多的甲殼動(dòng)物CHH基因序列全長被克隆，更為全面和準(zhǔn)確的系統(tǒng)發(fā)育分析將成為可能。

4.3CHH基因組織表達(dá)差異

CHH是甲殼動(dòng)物眼柄器官中含量豐富且研究最多神經(jīng)肽激素。在斑節(jié)對(duì)蝦[12]和羅氏沼蝦[27]的眼柄中均檢測到大量的CHH神經(jīng)肽，而在紅斑青蟹眼柄神經(jīng)節(jié)中也檢測出很高的CHH基因表達(dá)量[14]，在其它甲殼動(dòng)物以眼柄為中心的中樞系統(tǒng)中CHH基因表達(dá)量均較高。其他組織中CHH基因的表達(dá)情況因物種不同存在差異，如擬穴青蟹和日本蟳腸、肝胰腺組織中CHH基因均有較高表達(dá)，而日本沼蝦腸、肝胰腺組織中CHH基因表達(dá)量均較低[9，28—29]。在對(duì)日本沼蝦CHH基因表達(dá)熒光定量檢測中發(fā)現(xiàn)，CHH基因在眼柄中的表達(dá)量最高，精巢次之，在卵巢中的表達(dá)量最低，作者推測CHH基因可能與雄性生殖過程相關(guān)[9]；在日本蟳CHH基因表達(dá)熒光定量檢測中，CHH基因在精巢中也有較高表達(dá)，作者同樣認(rèn)為CHH可能與甲殼動(dòng)物雄性發(fā)育密切相關(guān)[29]。本文研究結(jié)果表明，CHH基因在口蝦蛄精巢中不表達(dá)，分析可能原因有二：一方面與物種本身存在差異有關(guān)，如通過半定量檢測CHH基因在三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)各組織中表達(dá)情況，結(jié)果表明，在CHH基因在XO-SG、胸神經(jīng)節(jié)、腹神經(jīng)節(jié)、Y 器和腸中表達(dá)，而在視網(wǎng)膜、心、精巢、卵巢、肌肉、腦、腮和肝胰腺等組織中不表達(dá)[30]。另一方面與CHH存在多種構(gòu)型現(xiàn)象有關(guān)，如羅氏沼蝦眼柄中存在兩種CHH cDNA構(gòu)型，分別為CHH與CHH-Ⅰ。CHH構(gòu)型含有3個(gè)外顯子(Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ)，只在眼柄當(dāng)中表達(dá)；而CHH-Ⅰ構(gòu)型則含有全部4個(gè)外顯子，并且可以在心臟、腮、觸角腺和胸神經(jīng)節(jié)當(dāng)中檢測到。這一結(jié)果表明，CHH基因在轉(zhuǎn)錄過程中不同的剪接方式可以導(dǎo)致產(chǎn)生不同的CHH構(gòu)型，進(jìn)而翻譯成不同構(gòu)型的CHH多肽，在不同組織發(fā)揮多種生理功能[31]，比如Choi等[14]克隆了紅斑青蟹眼柄的CHH-1基因及類CHH激素源前體基因，發(fā)現(xiàn)CHH-1基因僅在眼柄神經(jīng)中樞中表達(dá)，而類CHH激素源前體基因在胸神經(jīng)節(jié)、腹神經(jīng)節(jié)、腦中表達(dá)，而在眼柄神經(jīng)中樞中不表達(dá)。在以后的研究中，可對(duì)不同繁殖時(shí)期口蝦蛄CHH基因組進(jìn)行研究，以分析CHH cDNA不同構(gòu)型，從而探討該基因不同組織表達(dá)特異性機(jī)制。

5結(jié)論

本研究首次克隆得到口蝦蛄CHH基因全長cDNA序列，并對(duì)其氨基酸結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了同源分析和探討，結(jié)果表明CHH序列相對(duì)保守，與其他十足目動(dòng)物氨基酸序列結(jié)構(gòu)一致。研究結(jié)果為口蝦蛄CHH多肽相關(guān)功能性研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他甲殼類動(dòng)物CHH基因的研究及系統(tǒng)演化提供借鑒。

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu Lei，Laufer H，Wang Yajun，et al. A neurohormone regulating both methyl farnesoate synthesis and glucose metabolism in a crustacean[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1997，237(3): 694-701.

[2]Tang Chenhui，Lu Weiqun，Wainwright G，et al. Molecular characterization and expression of mandibular organ-inhibiting hormone，a recently discovered neuropeptide involved in the regulation of growth and reproduction in the crab Cancer pagurus[J]. Biochemical Journal，1999，343(2): 355-360.

[3]Keller R. Crustacean neuropeptides: structures，functions and comparative aspects[J]. Experientia，1992，48(5): 439-448.

[4]蔡生力. 甲殼動(dòng)物內(nèi)分泌學(xué)研究與展望[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1998，22(2): 154-161.

Cai Shengli. A review of crustacean endocrinology[J]. Journal of Fisheries of China，1998，22(2): 154-161.

[5]De Kleijn D P V，Van Herp F. Molecular biology of neurohormone precursors in the eyestalk of Crustacea[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology，1995，112(4): 573-579.

[6]Lacombe C，Grève P，Martin G. Overview on the sub-grouping of the crustacean hyperglycemic hormone family[J]. Neuropeptides，1999，33(1): 71-80.

[7]楊濟(jì)芬，朱冬發(fā)，沈建明，等. 甲殼動(dòng)物高血糖激素家族生理功能研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志，2009，44(1): 151-158.

Yang Jifen，Zhu Dongfa，Shen Jianming，et al. Physiological significance of crustacean hyperglycemic hormone family[J]. Chinese Journal of Zoology，2009，44(1): 151-158.

[8]Keller R. Crustacean neuropeptides: structures， functions and comparative aspects[J]. Experientia， 1992， 48(5): 439-448．

[9]金舒博，王寧，喬慧，等. 青蝦高血糖激素基因全長cDNA序列的克隆及表達(dá)分析[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2013，20(1): 82-92.

Jin Shubo，Wang Ning，Qiao Hui，et al. Molecular cloning and expression of a full length cDNA encoding crustacean hyperglycemic hormone (CHH) in oriental river pawn (Macrobrachiumnipponense)[J]. Journal of Fishery Sciences of China，2013，20(1): 82-92.

[10]De Kleijn D P V，De Leeuw E P H，Van den Berg M C，et al. Cloning and expression of two mRNAs encoding structurally different crustacean hyperglycemic hormone precursors in the lobsterHomarusamericanus[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression，1995，1260(1): 62-66.

[11]王艷華，張亦陳，孫妍，等. 中華絨螯蟹高血糖激素基因的克隆和分子結(jié)構(gòu)解析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2013，37(7): 987-993.

Wang Yanhua，Zhang Yichen，Sun Yan，et al. Cloning and molecular structure analysis of crustacean hyperglycemic hormone (Ers-CHH) inEriocheirsinensis[J]. Journal of Fisheries of China，2013，37(7): 987-993.

[12]Wiwegweaw A，Udomkit A，Panyim S. Molecular structure and organization of crustacean hyperglycemic hormone genes ofPenaeusmonodon[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2004，37(2): 177-184.

[13]Gu Peili，Yu Keili，Chan S M. Molecular characterization of an additional shrimp hyperglycemic hormone: cDNA cloning，gene organization，expression and biological assay of recombinant proteins[J]. FEBS Letters，2000，472(1): 122-128.

[14]Choi C Y，Zheng Junying，Watson R D. Molecular cloning of a cDNA encoding a crustacean hyperglycemic hormone from eyestalk ganglia of the blue crab，Callinectessapidus[J]. General and Comparative Endocrinology，2006，148(3): 383-387.

[15]王春琳，母昌考，丁愛俠，等. 口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)同工酶的組織特異性及生化遺傳分析[J]. 海洋與湖沼，2004，35(3): 258-263.

Wang Chunlin，Mu Changkao，Ding Aixia，et al. Tissue specificity and biochemical genetic analysis of isozyme on crustaceanOratosquillaoratoria[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica，2004，35(3): 258-263.

[16]宋微微，王春琳，母昌考. 用同工酶和RAPD技術(shù)分析黑斑口蝦蛄的遺傳多樣性[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2006，25(4): 189-193.

Song Weiwei，Wang Chunlin，Mu Changkao. Genetic diversity in mantis shrimpOratosquillakempiby isozyme and RAPD analysis[J]. Fisheries Science，2006，25(4): 189-193.

[17]黃映萍，王瑩，苗素英. 粵東海域口蝦蛄遺傳多樣性[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志，2011，46(2): 82-89.

Huang Yingping，Wang Ying，Miao Suying. Genetic diversity analysis of mantis shrimps (Oratosquillaoratoria) from the eastern coast of Guangdong province[J]. Chinese Journal of Zoology，2011，46(2): 82-89.

[18]劉海映，劉連為，姜玉聲，等. 口蝦蛄proPO基因全長cDNA的克隆與組織表達(dá)[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，33(6): 1713-1720.

Liu Haiying，Liu Lianwei，Jiang Yusheng，et al. Full length cDNA cloning and tissue expression of prophenoloxidase fromOratosquillaoratoria[J]. Acta Ecologica Sinica，2013，33(6): 1713-1720.

[19]Tamura K，Dudley J，Nei M，et al. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2007，24(8): 1596-1599.

[20]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research，1997，25(24): 4876-4882.

[21]Davey M， Duve H， Thorpe A， et al. Characterisation of the helicostatin peptide precursor gene fromHelicoverpaarmigera(Lepidoptera: Noctuidae)[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 1999， 29(12): 1119-1127．

[22]B?cking D，Dircksen H，Keller R. The crustacean neuropeptides of the CHH/MIH/GIH family: structures and biological activities[M]//Wiese K. The Crustacean Nervous System. Berlin Heidelberg: Springer，2002: 84-97.

[23]Lee K J，Doran R M，Mykles D L. Crustacean hyperglycemic hormone from the tropical land crab，Gecarcinuslateralis: Cloning，isoforms，and tissue expression[J]. General and Comparative Endocrinology，2007，154(1/3): 174-183.

[24]Kegel G，Reichwein B，Tensen C P，et al. Amino acid sequence of crustacean hyperglycemic hormone (CHH) from the crayfish，Orconecteslimousus: emergence of a novel neuropeptide family[J]. Peptides，1991，12(5): 909-913.

[25]Katayama H，Ohira T，Nagata S，et al. Structure-activity relationship of crustacean molt-inhibiting hormone from the Kuruma prawnMarsupenaeusjaponicus[J]. Biochemistry，2004，43(30): 9629-9635.

[26]劉瑞玉. 《現(xiàn)生甲殼動(dòng)物(CRUSTACEAN)最新分類系統(tǒng)》簡介[C]//中國甲殼動(dòng)物學(xué)會(huì). 甲殼動(dòng)物學(xué)論文集(第四輯). 北京: 科學(xué)出版社，2003: 76-86.

Liu Ruiyu. Introduction of 《An updated classification of the recent CRUSTACEAN》[C]//The Chinese Society of Crustaceans. Transactions of the Chinese Crustacean Society(Ⅳ). Beijing: Science Press，2003: 76-86.

[27]Sithigorngul P，Panchan N，Vilaivan T，et al. Immunochemical analysis and immunocytochemical localization of crustacean hyperglycemic hormone from the eyestalk ofMacrobrachiumrosenbergii[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology，1999，124(1): 73-80.

[28]舒妙安，張龍韜，周宇芳，等. 擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)兩種 Ⅰ 型高血糖激素基因全長cDNA的克隆及組織表達(dá)分析[J]. 海洋與湖沼，2012，43(4): 695-701.

Shu Miaoan，Zhang Longtao，Zhou Yufang，et al. Cloning and expression of two genes encoding type Ⅰ crustacean hyperglycemic hormone family from the mud crabScyllaparamamosain[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica，2012，43(4): 695-701.

[29]湯潔，朱冬發(fā)，崔曉雨，等. 日本蟳高血糖激素基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 生物學(xué)雜志，2014，31(4): 10-14.

Tang Jie，Zhu Dongfa，Cui Xiaoyu，et al. Cloning and expression analysis of crustacean hyperglycemic hormone (CHH) inCharybdisjaponica[J]. Journal of Biology，2014，31(4): 10-14.

[30]楊濟(jì)芬. 三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)高血糖激素基因的克隆與分析[D]. 寧波: 寧波大學(xué)，2010.

Yang Jifen. Molecular cloning and expression analysis of Crustacean Hyperglycemic Hormone from swimming crab (Portunustrituberculatus)[D]. Ningbo: Ningbo University，2010.

[31]Chen S H，Lin C Y，Kuo C M. Cloning of two crustacean hyperglycemic hormone isoforms in freshwater giant prawn (Macrobrachiumrosenbergii): evidence of alternative splicing[J]. Marine Biotechnology，2004，6(1): 83-94.

Molecular cloning and expression of a full length cDNA of encoding crustacean hyperglycemic hormone(CHH)in Oratosquilla oratoria

Liu Haiying1，Zhang Xiuqin1，Sui Youzhen1，Li Hongjun2，Xing Kun1，Jiang Yusheng3，Yang Guifu1，Chen Lei1，Zhang Na1

(1.KeyLaboratoryofMarineBio-resourcesRestorationandHabitatReparationinLiaoningProvince，DalianOceanUniversity，Dalian116023，China; 2.NationalMarineEnvironmentalMonitoringCenter，Dalian116023，China; 3.KeyLaboratoryofMariculture&StockEnhancementinNorthChina’sSea，MinistryofAgriculture，DalianOceanUniversity，Dalian116023，China)

Abstract:Total RNA in eyestalk of Oratosquilla oratoria was extracted and cDNA sequence of crustacean hyperglycemic hormone (CHH) were obtained by RACE for the first time. The result showed that the full length of the CHH gene is 2 421 bp，containing an 180 bp 5′-untranslated region (UTR)，and 1 821 bp 3′UTR，and 420 bp open reading flame (ORF) which encoded 139 amino acids. Prediction of protein structure was composed of 23.74% α-helix，23.02% extension chain，53.24% random coil，and its molecular mass is 15 470 Daltons with an estimated pI of 7.049.The mature peptide contained six conserved Cys residues in CHH family. The C-terminus mature peptide was GK which has the same characteristics with ES-CHH. Based on protein similarity comparison，the separated CHH gene was classified into the type I CHH family of peptides. Phylogenetic analysis showed that CHH of O. oratoria and CHH of decapod species formed two subgroups on the same branch of the tree. The relative expression of CHH gene in different organizations was tested by real time fluorescent quantitative PCR，the expression was highest in the intestine，and then the eyestalk，antenna and brain，the expression is negligible in muscle and ovary，and no expression in testis．

Key words:Oratosquilla oratoria; crustacean hyperglycemic hormone; molecular cloning; RT PCR; expression analysis

收稿日期：2015-07-01；

修訂日期：2015-11-30。

基金項(xiàng)目：國家海洋局海洋公益項(xiàng)目(200905019-4); 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41006079)。

作者簡介：劉海映(1957—)，男，遼寧省大連市人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)闈O業(yè)資源增殖。E-mail:hyliu@dlou.edu.cn *通信作者：邢坤(1984—)，副教授，山東省臨沂市人，主要從事海洋生物學(xué)與漁業(yè)資源學(xué)研究。E-mail:xingkun@dlou.edu.cn

中圖分類號(hào):Q71

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0253-4193(2016)06-0098-12

劉海映，張秀芹，隋宥珍，等. 口蝦蛄高血糖激素基因全長cDNA的克隆及表達(dá)分析[J].海洋學(xué)報(bào)，2016，38(6)：98—109，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.06.011

Liu Haiying，Zhang Xiuqin，Sui Youzhen，et al. Molecular cloning and expression of a full length cDNA of encoding crustacean hyperglycemic hormone(CHH)inOratosquillaoratoria[J]. Haiyang Xuebao，2016，38(6)：98—109，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.06.011