何培青， Dewi Seswita Zilda， 李江， 張學(xué)雷， 崔菁菁， 白亞之， Gintung Patantis， Ekowati Chasanah

(1.國家海洋局第一海洋研究所 海洋生態(tài)研究中心， 山東 青島 266061; 2. 海洋與漁業(yè)局 海洋與漁業(yè)研究與發(fā)展司 海洋和漁業(yè)產(chǎn)品加工和生物技術(shù)研究中心，印度尼西亞 雅加達(dá) 40115; 3. 國家海洋局第一海洋研究所 海洋沉積與環(huán)境地質(zhì)國家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061)

印度尼西亞卡利安達(dá)島近岸熱泉微生物和氫酶基因的多樣性

何培青1， Dewi Seswita Zilda2， 李江1， 張學(xué)雷1， 崔菁菁3， 白亞之3， Gintung Patantis2， Ekowati Chasanah2

(1.國家海洋局第一海洋研究所 海洋生態(tài)研究中心， 山東 青島 266061; 2. 海洋與漁業(yè)局 海洋與漁業(yè)研究與發(fā)展司 海洋和漁業(yè)產(chǎn)品加工和生物技術(shù)研究中心，印度尼西亞 雅加達(dá) 40115; 3. 國家海洋局第一海洋研究所 海洋沉積與環(huán)境地質(zhì)國家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061)

摘要：研究對2011年7月采自印度尼西亞卡利安達(dá)島近岸熱泉的樣品，進(jìn)行了細(xì)菌和古菌16S rRNA基因和細(xì)菌氫酶基因克隆文庫的構(gòu)建、序列測定和多樣性分析。結(jié)果表明：熱泉系統(tǒng)的細(xì)菌和古菌由16個(gè)門組成，Proteobacteria為熱液流體和沉積物的優(yōu)勢類群，豐度分別為59.5%和73.3%，Cyanobacteria為菌苔的優(yōu)勢類群(豐度，56.5%)；具有氨氧化作用的Crenarchaeota為古菌的優(yōu)勢類群。熱泉系統(tǒng)中，70%以上的種類與海洋細(xì)菌的親緣關(guān)系最近，說明該系統(tǒng)具有海洋特性；約20%的種類與陸地?zé)崛惺葻峄蛑械仁葻峒?xì)菌的親緣關(guān)系最近，這些種類可能來源于高溫地層內(nèi)部，并參與了鐵氧化還原、氫氧化、硫氧化和硝酸還原等過程。熱泉系統(tǒng)中，NAD(P)-關(guān)聯(lián)的雙向NiFe-氫酶基因和FeFe-氫酶基因的組成分布也受到溫度和鹽度分布變化的影響。研究為揭示淺海熱液系統(tǒng)提供理論參考。

關(guān)鍵詞：印度尼西亞卡利安達(dá)島；近岸熱泉；16S rRNA；氫酶基因

1引言

深海熱液系統(tǒng)自20世紀(jì)70年代首次發(fā)現(xiàn)以來，一直是國際關(guān)注的焦點(diǎn)，而淺海熱液系統(tǒng)及其微生物的研究在近期才得到重視。淺海熱液系統(tǒng)一般位于近海，水深在0～200 m之間，在地形上屬于深海熱液系統(tǒng)和陸地?zé)崛到y(tǒng)的過渡，陸地和海水中的流體及物質(zhì)都會(huì)對熱液活動(dòng)產(chǎn)生影響。淺海熱液系統(tǒng)常位于火山海面下翼部和海底火山頂部，火山活動(dòng)為其提供熱源并驅(qū)動(dòng)熱液循環(huán)。熱液流體來源于大氣降水、海水、原生水和巖漿水，其不同的組成比例制約著熱液系統(tǒng)的溫度、鹽度、酸堿度、礦物等地球化學(xué)特征[1—3]。由于水深較淺，熱液流體還會(huì)同時(shí)影響到底部至表面水層，從而影響到人類活動(dòng)。由于可以接受到光照，微生物的初級(jí)生產(chǎn)不但可以通過化能自養(yǎng)途徑還可以通過光能營養(yǎng)途徑[1—3]。目前，國際上對微生物的研究主要集中在高鹽度淺海熱液系統(tǒng)[4—9]，其多樣性豐富，在生物礦化、碳、氮、硫等元素循環(huán)中扮演重要的角色；其組成和分布還受到地理位置、溫度、pH和流體組成等物理化學(xué)因子的影響。大氣降水為熱液流體主要來源的低鹽度淺海熱液系統(tǒng)中，微生物還經(jīng)歷了鹽度的變化，而目前對其研究較少[10]。

印度洋卡利安達(dá)島位于印度尼西亞，是受到喀拉喀托火山影響的區(qū)域之一，東海岸分布著一組近岸熱泉(5°44′46″N， 105°35′12″E)，距離陸地?cái)?shù)十米。泉眼以單個(gè)或成雙分布于相距數(shù)米的礁石上，在高潮時(shí)沒于海水中，低潮露出海面，熱泉池直徑約1 m，池外周可見綠色菌苔。泉眼水溫在58.5～68.5℃之間，鹽度接近于淡水，氣泡伴隨熱液流體溢出。本研究選取其中一個(gè)熱泉，通過PCR擴(kuò)增熱液流體、熱泉池沉積物和菌苔的細(xì)菌和古菌16S rRNA基因、NAD(P)-關(guān)聯(lián)的雙向NiFe-氫酶基因和FeFe-氫酶基因的部分序列并構(gòu)建克隆文庫，進(jìn)一步測定基因序列并分析其多樣性。研究為揭示淺海熱液系統(tǒng)微生物的生態(tài)功能及其與環(huán)境的相互關(guān)系提供理論參考。

2材料與方法

2.1樣品采集

2011年7月，在印度尼西亞卡利安達(dá)島東海沿岸，在低潮期采集一個(gè)熱泉的熱液流體、表層沉積物和表層菌苔樣品，于冰上低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。1 L熱液流體經(jīng)醋酸纖維濾膜(0.22 μm)過濾后，與沉積物和菌苔于-80℃保存，用于DNA提取。現(xiàn)場泉眼水溫為65℃，pH為6.0～6.5，鹽度約為4，周圍海水鹽度約為30。沉積物中常量金屬元素、總有機(jī)碳(TOC)、總氮(TN)和總碳(TC)的含量由國家海洋局第一海洋研究所海洋地質(zhì)綜合實(shí)驗(yàn)室完成測試。

2.2基因擴(kuò)增和基因文庫的構(gòu)建

稱取沉積物和菌苔樣品各0.5 g，取1 L 熱液流體的過濾菌膜，采用FastDNA?土壤DNA提取試劑盒(MPbio公司，美國)提取基因組。細(xì)菌16S rRNA基因引物采用Bac27F/Uni1492R[11]，古菌16S rRNA基因引物采用Arch20F/Arch958R[12]，NAD(P)-關(guān)聯(lián)的雙向NiFe-氫酶基因引物采用HoxH-F/HoxH-R[13]；FeFe-氫酶基因引物采用FeFe-272F/FeFe-427R[14]。PCR反應(yīng)采用TransStartTMTaq DNA聚合酶(全式金，北京)，PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括：2 μL DNA(約10 ng)，各1 μL 引物(0.2 μmol/L 終濃度)，5 μL 緩沖液，4 μL dNTP，1 μL DNA 聚合酶(2.5 U)，36 μL H2O。細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增條件：94℃ 5 min；94℃ 10 s，55℃退火10 s，72℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。古菌16S rRNA基因、NAD(P)-關(guān)聯(lián)的雙向NiFe-氫酶基因和FeFe-氫酶基因的退火溫度分別為55℃、48℃和52℃，延伸時(shí)間為1 min，40個(gè)循環(huán)，其他條件同細(xì)菌16S rRNA基因。

分別取2個(gè)重復(fù)的PCR產(chǎn)物(100 μL)，經(jīng)1%的瓊脂糖電泳后，切下與目的基因分子量大小相近的條帶，采用瓊脂糖回收試劑盒(天根，北京)進(jìn)行純化，pBS-T載體連接后，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根，北京)構(gòu)建克隆文庫，挑取單克隆在LB液體培養(yǎng)基(氨芐濃度50 μg/mL)中，于37℃過夜培養(yǎng)，并采用M13通用引物進(jìn)行陽性驗(yàn)證后，由上海桑尼公司完成測序。

2.3基因序列的生物信息學(xué)分析

分別對細(xì)菌的16S rRNA基因擴(kuò)增片段(正向 800 bp)和古菌的16S rRNA基因擴(kuò)增片段采用CodonCode Aligner 軟件 (CodonCode Corporation，Dedham，Massachusetts，USA)[15]進(jìn)行比對，相似度高于97%的序列作為一個(gè)操作分類單元(OTU)。多樣性指數(shù)采用Primer 5軟件[16]計(jì)算。NAD(P)-關(guān)聯(lián)的雙向NiFe-氫酶和FeFe-氫酶的基因序列去除載體和引物序列，并翻譯成氨基酸序列后，采用DOTUR軟件[17]，在大于等于99%相似性水平上進(jìn)行操作分類單元(OTUs)分析，并計(jì)算多樣性指數(shù)。覆蓋率計(jì)算公式為：C=[1-(n/N)]×100%，其中n為總的OTU數(shù)，N為總的序列數(shù)。采用BioEdit[18]軟件中的Clustal W[19]分別對16S rRNA基因序列和氫酶氨基酸序列與GenBank中近緣序列進(jìn)行多重比對，并采用MEGA4.0軟件[20]的相鄰連接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉值設(shè)為1 000。

2.4基因序列

將獲得的基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，細(xì)菌16S rRNA基因序列號(hào)為：KT239166-KT239341；古菌16S rRNA基因序列號(hào)為：KT225015-KT225020；NAD(P)-關(guān)聯(lián)的雙向NiFe-氫酶基因序列號(hào)為：KT225007-KT2250014；FeFe-氫酶基因序列號(hào)為：KT224971-KT225006。

3結(jié)果與分析

3.1沉積物的主要化學(xué)元素組成

熱泉沉積物的化學(xué)元素組成如表1所示，其中Fe和P含量高于大陸地殼，而Al、K、Mg和Ti含量低于大陸地殼數(shù)據(jù)。

表1　印度尼西亞卡利安達(dá)島近岸熱泉沉積物化學(xué)元素組成

注：“-”表示未提供數(shù)據(jù)。

3.2細(xì)菌的α-多樣性

共獲得641個(gè)含有細(xì)菌16S rRNA基因片段的克隆(表2)。熱液流體、沉積物和菌苔分別獲得90、100和52個(gè)OTUs。在沉積物和熱液流體中，細(xì)菌16S rRNA基因的香農(nóng)-韋弗多樣性指數(shù)和辛普森多樣性指數(shù)差別不大，且均高于菌苔。不同生態(tài)類型中的細(xì)菌均勻度和物種豐富度的變化趨勢與多樣性指數(shù)一致。

表2　印度尼西亞卡利安達(dá)島近岸熱泉細(xì)菌16S rRNA基因的α-多樣性

注：OTUs：操作分類單元；J：Pielou 均一度指數(shù)；d：物種豐富度；1-D：辛普森多樣性指數(shù)；H′：香農(nóng)-韋弗多樣性指數(shù)。

3.3細(xì)菌組成

研究共獲得14個(gè)門(表3)。在熱液流體和沉積物中，Proteobacteria的豐度最高，分別為59.5%和73.3%，其中Gammaproteobacteria的豐度分別為43.0%和23.2%。菌苔中Cyanobacteria的豐度最高(56.5%)，其次為Bacteroidetes(19.9%)和Proteobacteria(13.0%)。菌苔中Bacteroidetes、Acidobacteria和Chloroflexi的豐度高于熱液流體和沉積物。沉積物中Deferribacteres的豐度高于熱液流體和菌苔。

表3　印度尼西亞卡利安達(dá)島近岸熱泉的細(xì)菌組成

續(xù)表3

(1) Gammaproteobacteria

獲得Gammaproteobacteria的35個(gè)OTUs。熱液流體中豐度最高的3個(gè)OTUs(總豐度，18.0%)與海洋細(xì)菌Acinetobacter的相似度高于97%。沉積物中，豐度最高1個(gè)OTU(豐度，5.4%)與反硝化海洋細(xì)菌Pseudomonasstutzeri相似度為99.5%[22]。熱液流體中獲得的1個(gè)克隆，與嗜熱細(xì)菌Thermomonashydrothermalis親緣關(guān)系最近(96.2%)，還獲得2個(gè)克隆，與深層地?zé)岘h(huán)境克隆的相似度高于97%。

(2) Betaproteobacteria

獲得Betaproteobacteria的13個(gè)OTUs，其中5個(gè)OTUs(約占Betaproteobacteria總豐度的50.0%)與熱泉環(huán)境中硫氧化、鐵氧化、氫氧化和甲基氧化細(xì)菌的親緣關(guān)系最近。熱液流體中，豐度最高的1個(gè)OTU(豐度，9.5%)與陸地?zé)崛茏责B(yǎng)的鐵氧化細(xì)菌Sideroxydanslithotrophicus的相似度為94.6%[23]，該OTU在沉積物的豐度為3.6%。1個(gè)OTU(豐度，0.9%)與陸地?zé)崛狧ydrogenophilushirschii的相似度為97.6%。沉積物中，1個(gè)OTU(豐度，0.4%)與熱泉中耐熱的甲基營養(yǎng)細(xì)菌Methyloversatilisthermotolerans的相似度為98.5%[24]，2個(gè)OTUs(總豐度，0.3%)與高溫地下水層化能自養(yǎng)的嗜熱硫氧化細(xì)菌Thiobactersubterraneus的相似度高于97%[25]。

(3) Alphaproteobacteria

獲得Alphaproteobacteria的37個(gè)OTUs，其中熱液流體中豐度最高的1個(gè)OTU(22.0%)與海洋細(xì)菌Brevundimonashalotolerans的相似度為99.7%，沉積物中豐度較高的11個(gè)OTUs與不產(chǎn)氧光合細(xì)菌Rhodospirillales目、固氮細(xì)菌Rhizobiales和Brevundimonas屬的親緣關(guān)系最近。熱液流體中還獲得1個(gè)OTU，與陸地?zé)崛械仁葻岬牟划a(chǎn)氧光合細(xì)菌Albidovulumxiamenense的相似度為99.0%。

(4) Deltaproteobacteria

獲得Deltaproteobacteria的10個(gè)OTUs(12個(gè)克隆)。熱液流體中，1個(gè)OTU(1個(gè)克隆)與熱泉環(huán)境克隆的相似度為99.7%；1個(gè)OTU(3個(gè)克隆)與熱泉嗜熱氫氧化細(xì)菌Hydrogenophilusislandicus[26]的相似度為97.0%，沉積物中也獲得該OTU(1個(gè)克隆)。沉積物中，1個(gè)OTU(1個(gè)克隆)與深海熱液口嗜熱鐵還原細(xì)菌Deferrisomacamini的相似度為98.5%，1個(gè)OTU(2個(gè)克隆)與堿性熱泉環(huán)境克隆的相似度為97.0%。

(5) Cyanobacteria

Cyanobacteria是菌苔的優(yōu)勢類群(豐度，56.5%)，其中的28.6%與潮間帶Lyngbyaaestuarii的相似度為99.0%，38.5%與淡水環(huán)境中Stanieriacyanosphaera相似度約為91.5%。

(6) Bacteroidetes

獲得Bacteroidetes的21個(gè)OTUs，主要包括Flavobacteriia、Bacteroidia和Sphingobacteria3個(gè)目。

(7) Firmicutes

獲得Firmicutes的24個(gè)OTUs，菌苔和熱液流體中各含有1個(gè)OTU(共5個(gè)克隆)，與深海熱液區(qū)中等嗜熱菌Exiguobacteriumprofundum相似度為99.5%。沉積物中有1個(gè)OTU(1個(gè)克隆)與中等嗜熱Bacillusthermoamylovorans的相似度為99.0%，1個(gè)OTU(1個(gè)克隆)與嗜熱Desulfotomaculumthermobenzoicum的相似度為91.4%。

(8) Deferribacteres

Deferribacteres具有鐵和硝酸鹽還原作用[27]，研究獲得4個(gè)OTUs(共32個(gè)克隆)，均與陸地?zé)崛葻酑alditerrivibrionitroreducens[28]親緣關(guān)系最近。沉積物中獲得3個(gè)OTUs，其中1個(gè)(豐度，10.8%)與Calditerrivibrionitroreducens的相似度為97.8%。

稀有門(豐度小于等于1.0%)中，從熱液流體和沉積物中各獲得Chlorobi的1個(gè)克隆，均與陸地?zé)崛械仁葻岬木G硫細(xì)菌Ignavibacteriumalbum的親緣關(guān)系最近。獲得Chloroflexi的2個(gè)OTUs(共5個(gè)克隆)，分別與高溫深部蓄水層嗜熱細(xì)菌Caldilineatarbellica和淺海熱液區(qū)鐵和硝酸還原細(xì)菌Ardenticatenamaritima的親緣關(guān)系最近。熱液流體中獲得Deinococcus-Thermus的5個(gè)克隆，其中1個(gè)OTU(2個(gè)克隆)與微嗜熱的Meiothermuscerbereus的相似度為97.6%。菌苔中獲得Acidobacteria的3個(gè)克隆，其中1個(gè)OTU(2個(gè)克隆)與熱泉Thermoanaerobaculumaquaticus相似度達(dá)92.3%。主要OTUs的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1所示。

3.4古菌組成

古菌僅在沉積物和菌苔中分別獲得3個(gè)OTUs和5個(gè)OTUs。這些OTUs絕大多數(shù)與陸地?zé)崛蠧renarchaeota氨氧化細(xì)菌的親緣關(guān)系最近(相似度，92.3%～99.1%)。菌苔中還獲得2個(gè)OTUs(豐度，6.1%)，與淺海熱液中參與砷和鐵循環(huán)的Thaumarchaeota的親緣關(guān)系最近(相似度，91.0%和99.2%)。AM3和AM4與CandidatusNitrosocaldusyellowstonii親緣關(guān)系最近。AM4在菌苔(豐度，50.0%)和沉積物中(豐度，60.5%)均為優(yōu)勢類群，AM3在菌苔中的豐度(41.3%)遠(yuǎn)高于在沉積物中的(4.0%)。AS36與CandidatusNitrososphaeragargensis的親緣關(guān)系最近，為沉積物特有類群(豐度，36.0%)。古菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，如圖2所示。

3.5氫酶基因的α-多樣性

如表4所示，NAD(P)-關(guān)聯(lián)的雙向NiFe-氫酶基因和FeFe-氫酶基因僅在沉積物和菌苔中獲得。FeFe-氫酶基因編碼的氨基酸序列的多樣性高于NiFe-氫酶的。菌苔中這兩種氫酶的氨基酸序列的多樣性均高于沉積物的。

表4　印度尼西亞卡利安達(dá)島沿海熱泉NAD(P)-關(guān)聯(lián)的NiFe-氫酶基因和FeFe-氫酶基因編碼的氨基酸序列的α-多樣性

注：OTUs：操作分類單元；ACE：ACE豐富度指數(shù)；Chao1：Chao1豐富度指數(shù)；1-D：辛普森多樣性指數(shù)；H′：香農(nóng)-韋弗多樣性指數(shù)。

圖1　印度尼西亞卡利安達(dá)島近岸熱泉細(xì)菌16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1　 Phylogenetic tree of Bacterial 16S rRNA genes sequences from a coastal hot spring of Kalianda， Indonesia

圖2　印度尼西亞卡利安達(dá)島近岸熱泉古菌16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2　 Phylogenetic tree of archaea 16S rRNA gene sequences from a coastal hot spring of Kalianda， Indonesia

圖3　印度尼西亞卡利安達(dá)島近岸熱泉NAD(P)-關(guān)聯(lián)的雙向NiFe-氫酶基因編碼的氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3　 Phylogenetic tree of deduced amino acid sequences of NAD(P)-linked NiFe-hydrogease genes from a coastal hot spring of Kalianda， Indonesia

3.6NAD(P)-關(guān)聯(lián)的雙向NiFe-氫酶基因的組成

NAD(P)-關(guān)聯(lián)的雙向NiFe-氫酶基因編碼的氨基酸序列包括8個(gè)OTUs，其中沉積物中僅含有1個(gè)OTU，且與菌苔中的NiFeM12的相似度為99.2%。NiFe-氫酶均屬于Cyanobacteria(相似度，80.3%～90.2%)，其中5個(gè)OTUs(總豐度，77.5%)與Stigonematales的相似度最高；3個(gè)OTUs(總豐度，22.5%)與Oscillatoriophycideae的相似度最高。NiFe-氫酶氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3所示。

3.7FeFe-氫酶基因的組成

沉積物中，F(xiàn)eFe-氫酶基因編碼的氨基酸序列包括4個(gè)門，10個(gè)OTUs。其中Firmicutes的1個(gè)OTU，以及所有的Spirochaetes(3個(gè)OTUs)，Ignavibacteriae(2個(gè)OTUs)和Thermotogae(1個(gè)OTUs)的OTUs均與熱泉、油田等高溫環(huán)境中FeFe-氫酶氨基酸序列的相似度最高。FeS10(豐度，40.0%)與熱泉中FervidobacteriumpennivoransFeFe-氫酶氨基酸序列的相似度達(dá)97.0%，F(xiàn)eS3(豐度，20.1%)與嗜熱SpirochaetathermophilaFeFe-氫酶氨基酸序列相似度達(dá)71.2%。這說明熱泉中沉積物的產(chǎn)氫菌群具有嗜熱特性。

菌苔FeFe-氫酶氨基酸序列與沉積物的完全不同，包括25個(gè)OTUs，屬于Caldithrix、Spirochaetes、Bacteroidetes、Ignavibacteriae、Firmicute、Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria。其中Bacteroidetes的FeFe-氫酶豐度最高，包括9個(gè)OTUs，與海洋或淡水環(huán)境的Draconibacteriumorientale(相似度，85.2%～91.5%)，Marinilabiliasalmonicolor(相似度，71.0%)和Spirochaetasmaragdinae(相似度，72.0%)的親緣關(guān)系最近。還有一些FeFe-氫酶氨基酸序列與熱泉等高溫環(huán)境的Caldithrix(豐度2.9%)、Ignavibacteriae(豐度11.6%)和Thioclavapacifica(豐度1.5%)的氫酶氨基酸序列相似度最高。FeFe-氫酶氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖4所示。

圖4　印度尼西亞卡利安達(dá)島近岸熱泉FeFe-氫酶基因編碼的氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4　 Phylogenetic tree of deduced amino acid sequences of FeFe-hydrogease from a coastal hot spring of Kalianda， Indonesia

4討論

印度洋卡利安達(dá)島近岸熱泉發(fā)育多樣性豐富的微生物，與已知淺海熱液系統(tǒng)硫氧化還原細(xì)菌占優(yōu)勢不同[4-9]，該系統(tǒng)在鐵元素和氮元素循環(huán)中具有重要作用。如沉積物中與鐵還原相關(guān)的嗜熱細(xì)菌的豐度高于10%，這可能與沉積物中鐵含量高(約為大陸地殼含量的12倍)有關(guān)。古菌包括6個(gè)種類，基本由具有氨氧化作用的Crenarchaeota組成。古菌的這種組成特征與阿爾比斯山地下熱泉古菌的組成相似[29]。根據(jù)親緣關(guān)系最近的種類的生態(tài)功能還可以推斷，該系統(tǒng)在氫氧化、甲基營養(yǎng)、硫氧化等生態(tài)過程也具有重要作用。與16s rRNA結(jié)果一致，熱泉FeFe-氫酶氨基酸序列也與Firmicutes、Bacteroidetes、Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria相關(guān)；但占優(yōu)勢的FeFe-氫酶序列與嗜熱的Thermotogae、Spirochaetes和Ignavibacteriae相關(guān)，說明熱泉中通過FeFe-氫酶產(chǎn)氫的菌群為豐度較小的類群。這些產(chǎn)氫菌群可能為鐵還原和硝酸還原等過程提供電子供體和能量。熱泉系統(tǒng)中的雙向NiFe-氫酶均屬于Cyanobacteria，這些Cyanobacteria種類在白天進(jìn)行光合作用時(shí)，通過雙向NiFe-氫酶吸收氫氣并釋放過剩的電子[30—31]，在夜晚則通過該酶的可逆反應(yīng)厭氧產(chǎn)氫，從而使菌體保持穩(wěn)定的氧化還原態(tài)[32]。

溫度和鹽度是熱泉系統(tǒng)微生物組成和分布的控制因素。研究中，豐度高的細(xì)菌種類主要與海洋細(xì)菌的親緣關(guān)系最近，包括Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria和Bacteroidetes等[33]。這些種類可能來源于海洋環(huán)境，在地層內(nèi)部的熱液流體上行時(shí)隨海水混入熱泉系統(tǒng)。古菌、Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria和Firmicutes中豐度高的種類，所有Deferribacteres種類，以及Chlorobi、Chloroflexi、Deinococcus-Thermus和Acidobacteria等稀有門的大部分種類，與高溫環(huán)境微生物的親緣關(guān)系最近，這些種類可能來源于地層內(nèi)部。這種主要由海洋微生物組成且含有少量嗜熱微生物的沿海熱泉，不同于Hobel等[10]報(bào)道的，溫度相對高的潮間帶熱泉(大于80℃)主要由陸地嗜熱細(xì)菌組成；溫度相對低的熱泉(小于等于70℃)主要由中等嗜熱的細(xì)菌組成，同時(shí)存在中溫海洋和陸地細(xì)菌。這種差異可能由于熱泉系統(tǒng)分布于潮下帶，且溫度相對較低所造成的(65℃)。此外，與嗜熱相關(guān)的種類主要來源于陸地?zé)崛约案邷氐叵滤畬樱倭縼碓从谏詈嵋簠^(qū)，這可能與熱泉鹽度為4有關(guān)。結(jié)合淡水屬性的潮間帶熱泉種類與陸地嗜熱微生物或陸地?zé)崛⑸锏挠H緣關(guān)系最近[10]，而鹽度接近海水的淺海熱液系統(tǒng)，其種類與深海熱液微生物的親緣關(guān)系最近[4—9]的結(jié)果，本研究結(jié)果也支持了鹽度對淺海熱液系統(tǒng)微生物組成影響的結(jié)論。

研究中不同氫酶氨基酸序列的組成和分布特征，也證實(shí)了溫度和鹽度對功能微生物類群的影響。沉積物中FeFe-氫酶的氨基酸序列主要與嗜熱微生物FeFe-氫酶的氨基酸序列相似度最高，這可能與沉積物溫度較高有關(guān)。Bacteroidetes是近岸優(yōu)勢類群之一[33]，菌苔中Bacteroidetes的16s rRNA 基因和FeFe-氫酶氨基酸序列豐度均為最高，說明菌苔中的這些優(yōu)勢細(xì)菌和產(chǎn)氫類群可能來源于海洋環(huán)境。此外，菌苔中至少有22.5% 的NiFe-氫酶氨基酸序列與海洋或淡水環(huán)境Cyanobacteria的NiFe-氫酶氨基酸序列的相似度最高，也說明這些Cyanobacteria可能來源于海水或陸地環(huán)境。菌苔細(xì)菌的中溫屬性可能與其更易于與海水混合有關(guān)。

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Diversity of microbe and hydrogenase genes from a coastal hot spring of Kalianda， Indonesia

He Peiqing1， Dewi Seswita Zilda2， Li Jiang1， Zhang Xuelei1， Cui Jingjing3，Bai Yazhi3， Gintung Patantis2， Ekowati Chasanah2

(1.MarineEcologyResearchCenter，TheFirstInstituteofOceanography，StateOceanicAdministration，Qingdao266061，China; 2.ResearchCenterforMarineandFisheriesProductProcessingandBiotechnology，AgencyforMarineandFisheriesResearchandDevelopment，MinistryofMarineandFisheriesAffairs，Jakarta40115，Indonesia; 3.KeylaboratoryofStateOceanicAdministrationforMarineSedimentology&EnvironmentalGeology，TheFirstInstituteofOceanography，StateOceanicAdministration，Qingdao266061，China)

Abstract:During July， 2011， samples were collected from a coastal hot spring of Kalianda， Indonesia. Clone libraries of 16S rRNA genes of bacteria and archaea， and hydrogenase genes were constructed. The sequences were determined， and the diversity were also analyzed. The results demonstrated that the coastal hot spring hosted 16 phyla. Proteobacteria was dominant in hydrothermal fluid and sediment， accounting for 59.5% and 73.3%， respectively. Cyanobacteria was the most abundant in mat with abundance of 56.5%. Ammonia oxidizing Crenarchaeota was predominant in archaea. More than 70% of the species were most related to marine microbes， indicating the marine property of this system. About 20% of the species were most related to the thermophilic or moderate thermophilic microbes from terrestrial hot springs. These species might originate from the hyperthermal subfloor and involve in the process of iron oxidation and reduction， hydrogen oxidation， sulfur oxidation and nitrate reduction. The composition and distribution of NAD(P)-linked bidirectional NiFe-hydrogenase and FeFe-hydrogenase genes were also shaped by temperature and salinity. Our research provided an insight into the shallow-sea hydrothermal system．

Key words:Kalianda Indonesia；coastal hot spring；16S rRNA genes；hydrogenase；diversity

收稿日期：2015-07-07；

修訂日期：2016-03-24。

基金項(xiàng)目：中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2011T04)；國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(MBSMAT-2015-06，MBSMAT-2011-03，MBSMAT-2012-2)。

作者簡介：何培青(1972-)，女，山東省濟(jì)南市人，博士，從事海洋微生物研究。E-mail:hepeiqing@fio.org.cn

中圖分類號(hào):Q938

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0253-4193(2016)06-0119-11

何培青， Dewi Seswita Zilda， 李江，等. 印度尼西亞卡利安達(dá)島近岸熱泉微生物和氫酶基因的多樣性[J].海洋學(xué)報(bào)，2016，38(6)：119—129， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.06.013

He Peiqing， Dewi Seswita Zilda， Li Jiang， et al. Diversity of microbe and hydrogenase genes from a coastal hot spring of Kalianda， Indonesia[J]. Haiyang Xuebao，2016，38(6)：119—129， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.06.013