劉春影， 叢柏林， 王能飛， 王波， 尹曉斐， 劉峰

(1.山東大學(xué)(威海) 海洋學(xué)院， 山東 威海 264209; 2.國家海洋局第一海洋研究所 生態(tài)研究中心， 山東 青島266061)

南極菲爾德斯半島可培養(yǎng)土壤微生物多樣性及理化性質(zhì)鑒定

劉春影1， 叢柏林2*， 王能飛2， 王波2， 尹曉斐2， 劉峰2

(1.山東大學(xué)(威海) 海洋學(xué)院， 山東 威海 264209; 2.國家海洋局第一海洋研究所 生態(tài)研究中心， 山東 青島266061)

摘要：為了探索南極可培養(yǎng)土壤微生物的多樣性，本研究對中國第31次南極科學(xué)考察采集自南極菲爾德斯半島的5份土壤樣品進(jìn)行了細(xì)菌、真菌的分離培養(yǎng)。選擇形態(tài)差異較大的細(xì)菌和真菌進(jìn)行了16S rDNA和ITS鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析。最終共鑒定得到20個(gè)屬的33株細(xì)菌和6個(gè)屬的8株真菌，其中8株細(xì)菌，10株真菌序列相似性較低，可能是新種。該結(jié)果表明南極菲爾德斯半島地區(qū)具有豐富的微生物多樣性，其中假單胞菌屬的細(xì)菌居多。對分離得到的細(xì)菌和真菌分別進(jìn)行理化性質(zhì)和胞外酶活性鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分離獲得的細(xì)菌和真菌絕大多數(shù)可產(chǎn)生水解酶類并同化多種碳源。初步認(rèn)定這些微生物在參與南極物質(zhì)代謝、適應(yīng)南極極端環(huán)境方面發(fā)揮作用。本研究豐富了對南極菲爾德斯半島可培養(yǎng)土壤微生物多樣性的認(rèn)識，并篩選獲得了一些產(chǎn)低溫酶特性的菌株，這為極地微生物資源的利用研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：菲爾德斯半島；微生物多樣性；系統(tǒng)進(jìn)化分析；生理生化特性

1引言

南極位于地球的最南端，由陸地和海洋兩部分構(gòu)成，終年被冰雪覆蓋，氣候酷寒干燥、強(qiáng)光輻射，是地球上最冷最干的地區(qū)。其獨(dú)特的地理構(gòu)成和極端的氣候環(huán)境，雖然在一定程度上限制了南極動植物、微生物等生物資源的生存及繁衍，但也使得南極地區(qū)的動植物及微生物資源的種類和性質(zhì)有別于世界其他地區(qū)，具有耐低溫、耐高鹽、抗輻射等特點(diǎn)。因此從南極土壤中篩選具有這種特點(diǎn)的微生物，不僅可以為開發(fā)利用微生物資源提供重要的參考依據(jù)[1]，還可以為人類了解低溫微生物在南極自然環(huán)境下的物質(zhì)循環(huán)、生物地球化學(xué)過程等提供重要的線索[2]。

最近許多研究發(fā)現(xiàn)，盡管南極自然條件非常惡劣，但是該地區(qū)土壤中微生物的數(shù)量和種類卻非常豐富[3]。如在南極麥克默多干谷(Dry Valleys)地區(qū)，Cowan等[4]對土壤中的微生物數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)分布著大量細(xì)菌、古菌、真菌和線蟲，其中細(xì)菌有14個(gè)門，數(shù)量最大的是酸桿菌(Acidobacteria)、放線菌(Actinobacteria)和擬桿菌(Bacteroidetes)。Teixeira等[5]對金鐘灣(Admiralty Bay)維管束植物根際土壤細(xì)菌的多樣性做了研究，發(fā)現(xiàn)厚壁菌(Firmicutes)最為豐富，優(yōu)勢菌類為雙歧桿菌(Bifidobacterium)，弓形桿菌(Arcobacter)和柔嫩梭菌(Faecalibacterium)。Aislabie等[6]在維多利亞陸地(Victoria Land) 4個(gè)站點(diǎn)采樣，采用非培養(yǎng)和培養(yǎng)相結(jié)合的方法來評估土壤細(xì)菌群落的多樣性，發(fā)現(xiàn)分裂類桿菌(Bacteroidetes)、放線菌(Actinobacteria)、變形桿菌(Proteobacteria)、紅熱異常球菌(Thermus-Deinococcus)、酸桿菌(Acidobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)和藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)為優(yōu)勢菌類。在南極其他稍微溫暖、潮濕地區(qū)的土壤，如凱勒半島(Keller Peninsula)的無冰區(qū)中，變形菌(Proteobacteria)大量存在。大量研究表明南極土壤中具有較豐富的微生物多樣性，它們在基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用方面都有著廣闊的前景[7]。

由于南極獨(dú)特的地理位置和氣候特點(diǎn)，在這個(gè)區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了一些新的菌種，如Hirsch等[8]從南極麥克默多干谷土壤中分離得到3株抗干旱、抗紫外線的異常球菌新種；Reddy等[9]從南極McMurdo站附近的湖泊中分離到13株橙色產(chǎn)生菌，屬于Planococcuspsychrophilusspp.和Planococcusantarcticusspp.，并利用16S rDNA序列、細(xì)菌形態(tài)、脂肪酸組成等方面證明它們屬于新的種；董寧[10]從格羅夫山土壤中共分離得到 5 株與現(xiàn)有菌種相似度低于 96.5%的菌株，屬于Rhizobiumpseudoryzae、Bacillusmethanolicus、Scopulibacillusdarangshiensis、Bacillusmethanolicus和Deinococcusficus，為潛在的細(xì)菌新種(屬)；丁壯[11]從南極半島的10個(gè)樣品中分離得到真菌136株，并對65株真菌采用ITS序列進(jìn)行分子鑒定，其中有7株菌株其ITS序列與已知序列相似度均較低，屬于Mortierellaparvisporastrain、Mortierellaelongatulastrain、Acremoniumluzulae、Pyriculariasp.、Lecythophorasp.、Helotialessp.、Hyphodiscussp.可能為真菌新種甚至新屬。大量的研究成果表明南極地區(qū)不僅是個(gè)潛在、重要的微生物資源庫，也是一塊有待認(rèn)知的大陸，因此這個(gè)區(qū)域還有很多不為人知的微生物新菌種需要我們?nèi)ヌ綄ぁ?/p>

近年來從低溫微生物中篩選產(chǎn)低溫酶的研究已成為許多專家學(xué)者的研究熱點(diǎn)。在低溫酶中，對蛋白酶和脂肪酶的研究較多[12]。脂肪酶可應(yīng)用于許多方面，如作為食品風(fēng)味改變劑、去污添加劑或立體特異性催化劑等；蛋白酶可應(yīng)用于奶酪成熟、牛奶加工、洗滌劑等[13]，均具有相當(dāng)大的市場潛力。Ray等[14]從南極Schirmacher Oasis 土壤中篩選到1株分泌酸性蛋白酶的耐冷型酵母Candidahumicola，其在低溫條件下具有較高的產(chǎn)酶能力；Vazquez等[15]在南極喬治王島土壤中分離到了3株產(chǎn)胞外蛋白酶的低溫假單胞菌，在20℃時(shí)具有最高的蛋白水解活性。因此合理開發(fā)利用南極的低溫微生物資源，不僅可以豐富人類利用的微生物種類，將其應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日化及環(huán)保等諸多領(lǐng)域，將會給人們的生活帶來巨大的方便[16]。

菲爾德斯半島是南極洲的半島，位于南設(shè)得蘭群島的喬治王島西南端，東南面是馬克斯韋爾灣，長7 km，取名自鄰近的菲爾德斯海峽，具體位置見圖1。菲爾德斯半島屬無冰區(qū)，中國南極長城站就在其附近。本研究以中國第31次南極科學(xué)考察采自南極菲爾德斯半島5個(gè)站位的土壤樣品為研究對象，通過細(xì)菌16S和真菌ITS基因序列擴(kuò)增進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，初步揭示了南極菲爾德斯半島可培養(yǎng)土壤微生物的多樣性。對分離的可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行理化性質(zhì)研究，為進(jìn)一步研究篩選產(chǎn)低溫酶(脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等)特性的極地微生物奠定了基礎(chǔ)。

2材料與方法

2.1樣品采集站位

研究樣品來自中國第31次南極科學(xué)考察所取得的菲爾德斯半島的部分土壤樣品，樣品采集站位見表1。土壤樣品用無菌鏟取0～5 cm深度植物根莖處的土樣，裝入無菌樣品袋中4℃低溫?zé)o菌保存，回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株的分離培養(yǎng)。

表1　樣品采集站位

續(xù)表1

圖1　菲爾德斯半島地理位置Fig.1　The location of Fildes Peninsula

2.2分離培養(yǎng)基

(1)細(xì)菌培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，瓊脂18 g，陳海水1 000 mL，121℃(98.1 kPa)高壓滅菌20 min，加終濃度為100 μg/mL制霉菌素以抑制真菌生長。

(2)真菌培養(yǎng)基

土豆培養(yǎng)基(PDA)：土豆200 g，葡萄糖10 g，瓊脂17 g，蒸餾水l 000 mL，121℃下高壓濕熱滅菌20 min，加終濃度為100 μg/mL的氨芐以抑制細(xì)菌生長。

(3)產(chǎn)酶培養(yǎng)基

產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基：淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，純化瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL。

產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基：羧酸纖維素鈉10 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，純化瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL。

產(chǎn)酪蛋白酶培養(yǎng)基：酪蛋白4 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，純化瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL。

2.3可培養(yǎng)菌株的篩選純化及保種

將采集的土壤樣品在8℃冰箱中自然晾干后，稱取約1 g置于10 mL無菌水中，振蕩混勻后靜置過夜。將預(yù)處理后的樣品懸液系列稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分別取100 μL涂布2216E和PDA培養(yǎng)基平板，于12℃培養(yǎng)。培養(yǎng)1～2周后，根據(jù)菌落形態(tài)、色素、干燥等特征，挑取形態(tài)差異較大的菌株進(jìn)行劃線純化。挑取純化后的單菌落，分別在4℃下用2216E、PDA培養(yǎng)基斜面和-80℃下用30%甘油保種。

2.4分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4.1細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增

細(xì)菌總DNA的提取按細(xì)菌總DNA提取試劑盒(Tiangen)操作手冊進(jìn)行。采用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′及1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增。50μL PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix(Tiangen) 25 μL，引物各2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

2.4.2真菌ITS基因序列擴(kuò)增

將篩選純化的真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后，刮取約50 mg菌苔，于研缽中液氮研磨，參照Tiangen新型植物基因組DNA提取試劑盒(CB3型離心柱)操作說明提取真菌DNA。采用引物ITSl：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′進(jìn)行ITS基因序列的擴(kuò)增。50 μL PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix (Tiangen) 25 μL，引物各2 μL，模板DNA 3 μL，ddH2O 18 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃DNA雙鏈預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

2.4.3系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

各取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，有特異明亮條帶的PCR產(chǎn)物交由上海桑尼公司測序。將所測定的細(xì)菌的 16S rDNA和真菌ITS rDNA基因序列與 GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)，選取與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系較近的菌株及南極常見菌株用軟件ClustalX進(jìn)行序列比對，采用 MEGA4.0 軟件的鄰接法(neighbor-joining method)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。與模式菌株的基因序列相似性比較利用 EzTaxon-e Database進(jìn)行(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)。

2.5細(xì)菌理化性質(zhì)鑒定

細(xì)菌的理化性質(zhì)采用非苛養(yǎng)非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒API NE20(NE20)。根據(jù)分子鑒定結(jié)果選取細(xì)菌每個(gè)種屬的代表性菌株進(jìn)行測定，培養(yǎng)溫度設(shè)為12℃。具體操作步驟按API 20 NE說明書進(jìn)行。

2.6真菌活性鑒定

篩選產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和酪蛋白酶的菌株參照靳永軒[17]的方法進(jìn)行。

(1)淀粉酶活性測定

用滅菌竹簽點(diǎn)種，每個(gè)平板點(diǎn)7株菌，12℃培養(yǎng)，待菌種生長良好時(shí)，在菌落周圍滴加新鮮配置的碘液數(shù)分鐘后，用清水沖去多余碘液檢測透明圈。如有淀粉酶產(chǎn)生，遇到碘液不變?yōu)樗{(lán)色，形成透明圈，圈的大小表示淀粉酶活性強(qiáng)弱；如不產(chǎn)生淀粉酶，則菌落周圍部位遇到碘液呈藍(lán)色。

(2)纖維素酶活性測定

用滅菌竹簽點(diǎn)種，每個(gè)平板點(diǎn)7株菌，12℃培養(yǎng)，待菌種生長良好時(shí)，在長出菌落的培養(yǎng)基上，覆蓋 1 mg/mL 的剛果紅溶液，10～15 min 后，倒去剛果紅溶液，加入 1 mol/L的 NaCl 溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈者為陽性。

(3)酪蛋白酶活性測定

用滅菌竹簽點(diǎn)種，每個(gè)平板點(diǎn)7株菌，12℃培養(yǎng)培養(yǎng) 1 至 2 周。在長出菌落的培養(yǎng)基上，覆蓋 40%的三氯乙酸 10～15 min 后，倒去三氯乙酸溶液，菌落周圍出現(xiàn)透明圈者為陽性。

3結(jié)果

3.1可培養(yǎng)菌株的分子鑒定

從南極菲爾德斯半島采集的5份土壤樣品中分離的微生物，根據(jù)菌落大小、顏色、形態(tài)等特征的不同共分離獲得83株細(xì)菌和29株真菌。分別進(jìn)行16S和ITS鑒定，共鑒定得到4個(gè)門20個(gè)屬的33株細(xì)菌和4個(gè)綱6個(gè)屬的8株真菌，具體見表2和表3。33 株細(xì)菌中變形菌門 (Proteobacteria) 23株，厚壁菌門(Firmicutes) 1株，放線菌門(Actinobacteria) 5株，擬桿菌門(Bacteroidetes) 4株。變形菌門中屬假單胞菌屬(Pseudomonas)最多，有7株。5份土壤樣品中細(xì)菌種屬的分布也有差別，分布較廣的為變形菌門(Proteobacteria)中的假單胞菌屬(Pseudomonas)和Massilia以及放線菌門(Actinobacteria)中的節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)。其中假單胞菌屬(Pseudomonas)和Massilia在樣品F1-1、K1-1、M1-1和Q2-1中均有分布，節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)在樣品B1-1、F1-1、K1-1和M1-1中均有分布。一般16S rDNA序列相似性小于98%則可認(rèn)為屬于潛在新種[18]，33株細(xì)菌中1EF2、2M1lan、2PK12、2PK1、2PK6、2PK8、2PM12和2PM7的16S rDNA序列最高相似性均小于98%，推測這8株菌可能為6個(gè)潛在細(xì)菌新種(表4)。所有菌種序列均已提交至Gene Bank，Accession No.為 KT991031-KT991142。

真菌鑒定結(jié)果表明篩選得到的真菌屬于4個(gè)綱6個(gè)屬:Mortierellomycotina的被孢霉屬(Mortierella)，錘舌菌綱(Leotiomycetes)中的地絲菌屬(Geomyces)、假散囊菌屬(Pseudeurotium)及Hymenoscyphus，糞殼菌綱(Sordariomycetes)中的油瓶霉屬(Lecythophora)，微球黑粉菌綱(Microbotryomycetes)的紅酵母屬(Rhodotorula)，其優(yōu)勢真菌為地絲菌屬菌株。其中菌株2PQ42、W2-1、2PM2、1PM5、1EK4-8、1PM4、2EB6、2EK5、2PK2和2PK13的ITS序列最高相似性均小于97%，一般ITS序列相似性小于97%則可認(rèn)為屬于不同種，序列相似性小于95%則可認(rèn)為屬于不同屬[19]，因此推測這10株菌可能為3個(gè)新種，2個(gè)新屬(表4)。由以上結(jié)果可以看出，南極菲爾德斯半島土壤中的微生物具有較豐富的多樣性，這為以后篩選具有特殊功能的菌株和發(fā)現(xiàn)新菌種提供了基礎(chǔ)。

表2　菲爾德斯半島土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離鑒定

表3　菲爾德斯半島土壤中可培養(yǎng)真菌的分離鑒定

表4　所有疑似新種菌株序列相似性比較結(jié)果

圖3　真菌ITS基因序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3　The Antarctica fungus Phylogenetic trees based on ITS sequences

3.2可培養(yǎng)土壤微生物系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS基因序列，使用NJ法建樹，各分支上的數(shù)值為經(jīng)l 000次bootstrap后的置信度值，構(gòu)建的菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹分別如圖2、圖3所示。

3.3可培養(yǎng)細(xì)菌的理化性質(zhì)測定

從第31次南極科考樣品中分離到的細(xì)菌中選取不同種屬的代表性菌株各1株，采用非苛養(yǎng)非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒API NE20測定其理化性質(zhì)(表5)。結(jié)果表明測定的33株菌中，90.91%的菌株可產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶，69.70%的菌株可以產(chǎn)生蛋白酶，72.73%的菌株可產(chǎn)生脲酶，8株產(chǎn)β-半乳糖苷酶。實(shí)驗(yàn)菌株具有代謝各種有機(jī)物和轉(zhuǎn)化硝酸鹽的能力，如菌株2EK2能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽和氮?dú)?，能產(chǎn)生精氨酸雙水解酶、脲酶、α-葡萄糖苷酶和蛋白酶，同化葡萄糖、甘露醇、葡萄糖酸鉀、羊蠟酸、己二酸、蘋果酸和枸櫞酸鈉；菌株2PM3lan能將硝酸鹽還原成氮?dú)?，產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶和蛋白酶，全部同化測定的12種物質(zhì)；菌株2PF3lan能產(chǎn)生精氨酸雙水解酶、脲酶、α-葡萄糖苷酶、蛋白酶和β-半乳糖苷酶，同化葡萄糖、甘露糖、甘露醇、乙酰葡萄糖胺、麥芽糖、葡萄糖酸鉀、蘋果酸、枸櫞酸鈉和苯乙酸。

表5　可培養(yǎng)細(xì)菌API生理生化測定結(jié)果

續(xù)表5

注：(1) 傳統(tǒng)生化及酶反應(yīng)指標(biāo)N03、TRP、GLU、ADH、URE、ESC、GEL、PNG分別代表硝酸鹽還原、吲哚產(chǎn)生、葡萄糖發(fā)酵、精氨酸雙水解、脲酶、水解α-葡萄糖苷酶、水解(蛋白酶)和β-半乳糖苷酶反應(yīng);

(2) 同化作用指標(biāo)GLU、ARA、MNE、MAN、NAG、MAL、GNT、CAP、ADI、MLT、CIT、PAC分別代表葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、乙酰葡萄糖胺、麥芽糖、葡萄糖酸鉀、羊蠟酸、己二酸、蘋果酸、枸櫞酸鈉、苯乙酸;

(3)+為陽性反應(yīng)，-為陰性反應(yīng)，±為弱生長。

3.4可培養(yǎng)真菌產(chǎn)胞外酶活性測定

根據(jù)分子鑒定結(jié)果選取可培養(yǎng)真菌每個(gè)種屬的代表性菌株和疑似新種屬的菌株進(jìn)行胞外酶活性測定，結(jié)果表明：13株真菌中，有7株產(chǎn)生淀粉酶，6株產(chǎn)纖維素酶，10株產(chǎn)酪蛋白酶；6株菌同時(shí)產(chǎn)3種酶，具體見表6。淀粉酶、纖維素酶和酪蛋白酶產(chǎn)生菌分別占供試菌株的53.85%、46.15%、76.92%。

表6　可培養(yǎng)真菌產(chǎn)胞外酶活性測定結(jié)果

續(xù)表6

注：“+”代表具有產(chǎn)酶活性；“-”代表物產(chǎn)酶活性；“±”代表產(chǎn)酶活性較弱。

4討論

為更加深入了解南極土壤微生物的多樣性和評價(jià)微生物資源，本研究對南極菲爾德斯半島土壤中的細(xì)菌和真菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。并對可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行理化性質(zhì)鑒定和真菌產(chǎn)胞外低溫酶活性初步測定，獲得了較豐富的可培養(yǎng)極地微生物資源，為篩選產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)和低溫酶等提供潛在種源庫。

Tanner 等曾報(bào)道在南極分離到144株低溫菌中，主要為弧菌屬(占55%)、氣單胞菌屬(占22%)和產(chǎn)堿菌屬(占4%)，也有一些假單胞菌屬(占2%)和黃桿菌屬(占2%)。董寧[10]從東南極格羅夫山土壤中分離得到細(xì)菌歸屬于厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、藍(lán)細(xì)菌、Candidate division TM7等類群，且以厚壁菌門(Firmicutes)所占比例最高。而本實(shí)驗(yàn)從菲爾德斯半島4份土壤樣品中分離得到的細(xì)菌為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和厚壁菌門4大類群，其中主要為假單胞菌屬，其次是節(jié)桿菌屬。與Tanner和董寧的研究相比，在細(xì)菌門類水平和優(yōu)勢菌種方面均有差別，這可能是由取樣地點(diǎn)、季節(jié)等因素造成菌類的不同。但我們的結(jié)果與Aislabie等[21]報(bào)道的從南極維多利亞公主地4 個(gè)位點(diǎn)的土壤樣品中分離得到放線菌門、擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門4大類群菌株和以假單胞菌屬為主的現(xiàn)象相一致。Fan等[22]對南極菲爾德斯半島和長城站地區(qū)的土壤微生物種類進(jìn)行過調(diào)查研究，初步鑒定細(xì)菌有7個(gè)屬:微球菌屬、葡萄球菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、黃桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬。我們的結(jié)果與之相比在細(xì)菌屬種上有較大的差別，本實(shí)驗(yàn)分離到較多的細(xì)菌屬(20個(gè))，其中紫色桿菌屬、嗜冷桿菌屬、土桿菌屬、吉莉斯氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、亞硫酸鹽桿菌屬、動性微菌屬、伯克氏菌屬、杜檊氏菌屬、Luteibacter、Massilia和Mucilaginibacter在之前的研究中未被發(fā)現(xiàn)過。這可能與采樣時(shí)間、地點(diǎn)和樣品處理方法等不同有關(guān)，但細(xì)菌優(yōu)勢屬均為假單胞菌屬。

我國極地微生物學(xué)家對南極不同地域不同時(shí)段真菌多樣性的研究也取得了一定的成果。陳皓文等[23]系統(tǒng)研究了菲爾德斯半島地區(qū)微生物主要類別，分離到真菌有5個(gè)屬:青霉菌屬、金孢霉菌屬、枝孢霉菌屬、曲霉菌屬、散子囊菌屬；孔華忠和齊祖國[24]在喬治王島采集的樣品中分離到8 個(gè)屬的真菌，包括青霉、曲霉、枝孢霉、散囊菌、布魯?shù)现忝?、梅林瓶霉、金孢霉和大毛霉。而本?shí)驗(yàn)從4份土壤樣品中分離到的真菌有6個(gè)屬：地絲霉屬、假散囊菌屬、Hymenoscyphus、被孢霉屬、油瓶霉屬和紅酵母屬，其優(yōu)勢屬為地絲菌屬菌株。由于陳皓文和孔華忠等人僅采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定，因而與本研究所得到的結(jié)果并不一致；另外由于采樣的季節(jié)特征、樣品處理和培養(yǎng)方法等都有所不同，因而有可能導(dǎo)致真菌多樣性存在一定差異。我們鑒定得到的6個(gè)屬的真菌歸屬于子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和門地位未定的被孢毛霉亞門 (Mortierellomycotina)，這與董寧[10]報(bào)道的從格羅夫山土壤中分離到的真菌主要?dú)w屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)兩大類群有相同之處。綜上所述，南極菲爾德斯半島地區(qū)廣泛存在著各種類型的低溫微生物，且分布很廣、數(shù)量也大，這無疑為進(jìn)一步探討它們在該地區(qū)自然環(huán)境以及物質(zhì)循環(huán)過程中所起的作用提供了有效的科學(xué)依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)了6株細(xì)菌，5株真菌與其他菌種的16S rDNA和ITS相似性較低，Devereux等[25]和Fry等[26]認(rèn)為16S rDNA和ITS序列相似性分別低于98%、97%可以認(rèn)為是新種。本研究發(fā)現(xiàn)的這11種南極微生物是否為新種還需要進(jìn)一步鑒定，這也將豐富對南極微生物多樣性認(rèn)知。Hirsch等[8]在南極麥克默多干谷土壤中分離到的3株新菌種屬于異常球菌，具有抗干旱、抗紫外的特性；Reddy等[9]從南極McMurdo站附近的湖泊中分離到13株新種，屬于Planococcuspsychrophilusspp.和Planococcusantarcticusspp.的橙色產(chǎn)生菌；董寧[10]從格羅夫山土壤中共分離到的5 株潛在的細(xì)菌新種(屬)，其中菌株G3-6-20最顯著的特征為對干燥、紫外和 γ-輻射等極端環(huán)境具有一定的耐受能力。本實(shí)驗(yàn)分離的6株細(xì)菌新種屬于Neptunomonasnaphthovorans、Duganellaphyllosphaerae、Mucilaginibactersoli、Luteibacterrhizovicinus、Pedobacterpanaciterrae、Mucilaginibacterdorajii，這與Hirsch、Reddy和董寧分離的細(xì)菌新種不同，且在之前的研究中尚未被發(fā)現(xiàn)過。丁壯[11]從南極半島10個(gè)樣品中分離得到7株真菌新種(屬)，屬于Mortierellaparvispora、Mortierellaelongatula、Acremoniumluzulae、Lecythophorasp.、Helotialessp.、Hyphodiscussp.。本實(shí)驗(yàn)分離到的5株真菌新種與丁壯的有所不同，都有Lecythophorasp.和Mortierellaelongatula，此外還有以前未被發(fā)現(xiàn)過的Pseudeurotiumdesertorum、Rhizoscyphusmonotropae和Rhodotorularosulata。由此看來，南極地區(qū)不僅是微生物新種的資源庫，還可能是篩選產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)和酶、抗生素等菌株的潛在種源地，目前南極微生物還有很多未知的區(qū)域，需要我們進(jìn)一步去探索。

迄今為止，各國的科學(xué)家從極地土壤、沉積物和水樣等發(fā)現(xiàn)了許多嗜冷、適冷微生物可以產(chǎn)生多種低溫降解酶類。β-半乳糖苷酶在纖維素徹底降解為單糖的過程中占重要地位[29]，本研究的實(shí)驗(yàn)菌株2PK7、2PK8、2PF3lan、2M1lan、2PK3、N1-1-1、2PM7和2PK12能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，國內(nèi)外的研究結(jié)果表明極地其他種屬的菌株也能夠產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，如丁新彪等[30]從南極普里茲灣及鄰近海域沉積物中分離出2株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的細(xì)菌，分別為微桿菌屬(Microbacterium)和需鹽桿菌屬(Salegentibacter)；俞勇等[31]從北極加拿大海盆和格陵蘭海的高緯度海域篩選出2個(gè)屬的菌株能夠產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，分別為黃桿菌屬(Flavobacterium)和冰居桿菌屬(Glaciecola)；Turkiewica等[32]從南極磷蝦消化道內(nèi)分離出一株能夠產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的假交替單胞菌。這些能夠產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株，在工業(yè)發(fā)酵中將可能有潛在的應(yīng)用價(jià)值。α-葡萄糖苷酶通過水解α-1，4糖苷鍵，可以從淀粉和其他有關(guān)多糖的非還原端水解葡萄糖[33]，在生物對淀粉、蔗糖等碳水化合物的吸收利用方面具有重要作用。菌株1PF3、1PQ2、2PK7、1PM2、2PB1lan、2PF3lan、2PM3lan、2PM11和1EB3等能夠產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶，因此在糖類的降解作用中具有重要意義。蛋白酶是可水解蛋白質(zhì)的一系列工業(yè)用生物催化劑，篩選出的絕大多數(shù)菌株都能夠產(chǎn)生蛋白酶，這為蛋白質(zhì)的降解提供潛在利用資源。一些實(shí)驗(yàn)菌株具有碳源利用的廣譜性，能夠同化利用多種碳源，如菌株N1-1-1能夠同化葡萄糖、甘露糖、甘露醇、乙酰葡萄糖胺、麥芽糖、葡萄糖酸鉀、羊蠟酸、蘋果酸、枸櫞酸鈉、苯乙酸10種碳源；1PQ2、2PM3lan和2PK12能夠同化測定的所有碳源(12種)。以上結(jié)果表明篩選得到的極地微生物在低溫酶處理和碳源轉(zhuǎn)化中有著廣闊的應(yīng)用潛力。此外，本研究還對篩選得到的部分可培養(yǎng)的真菌進(jìn)行胞外酶活性測定，其中53.85%的菌株產(chǎn)生淀粉酶，46.15%的菌株產(chǎn)纖維素酶，76.92%的菌株產(chǎn)酪蛋白酶；6株菌同時(shí)產(chǎn)3種酶。對這些酶活檢測時(shí)溫度為12℃，說明供試的菌株具有低溫酶活性，這為南極資源的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

近年來對環(huán)境樣品中的微生物調(diào)查研究大多采用分子生物學(xué)技術(shù)，如高通量測序等，這種方法能夠獲取較為全面的微生物信息，而傳統(tǒng)的人工培養(yǎng)方法因受到培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等限制而較少應(yīng)用[27]。但是開發(fā)南極，利用南極的關(guān)鍵是獲得可培養(yǎng)的功能菌株，所以傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得的微生物不但能夠反映生態(tài)環(huán)境特征的類群，可以更好地了解樣品中處于活體狀態(tài)的優(yōu)勢菌種類群，評估微生物與環(huán)境的關(guān)系[28]，還可以為開發(fā)利用南極微生物資源奠定基礎(chǔ)。因此，本實(shí)驗(yàn)對南極菲爾德斯半島土壤樣品中可培養(yǎng)微生物的多樣性、理化性質(zhì)和初步活性進(jìn)行研究，結(jié)果說明南極菲爾德斯半島土壤中可培養(yǎng)微生物具有極好的多樣性和豐富性，并可能存在我們還未發(fā)現(xiàn)過的菌種。這為南極微生物資源的利用和低溫酶的開發(fā)積累了資源、打下了基礎(chǔ)。

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Biodiversity， physiological and biochemical identification of culturable microorganisms from the soil of Fildes Peninsula，Antarctica

Liu Chunying1， Cong Bailin2， Wang Nengfei2， Wang Bo2， Yin Xiaofei2， Liu Feng2

(1.OceanCollege，ShangdongUniversity(Weihai)，Weihai264209，China; 2.EcologicalResearchCenter，F(xiàn)irstInstituteofOceanography，StateOceanicAdministration，Qingdao266061，China)

Abstract:In order to explore culturable microbial diversity，we separated bacteria and fungi from 5 different soil samples collected from the Fildes Peninsula during Chinese 31thAntarctic Scientific Expedition. The bacteria and fungi with great morphological differences were chosen to identify by 16S rDNA and ITS sequence. A total of 33 strains of bacteria belong to 20 genera and 8 strains of fungi belong to 6 genera. Among them，there are 8 strains of bacteria and 10 strains of fungi with low similarity. So we suspected that they were potential novel species. The results suggested that there is a relatively rich microbial diversity in Fildes Peninsula of Antarcticand， the majority of bacteria was Pseudomonas sp. Biochemical identification and enzymatic activity of culturable bacteria and fungi demonstrated that most of microorganism can produce hydrolytic enzymes and assimilate multiple carbon sources， which also proved that they could participate in substance metabolism and play a role to adapt to extreme environment of the Antarctic. This study enriched the soil culturable microbial diversity of Fildes Peninsula and some producing low temperature enzyme strains were screened，which may lay the foundation for resources utilization of polar microorganism．

Key words:Fildes Peninsula；microbial diversity；phylogenetic analysis；physiological-biochemical characteristic

收稿日期：2015-11-27；

修訂日期：2016-01-29。

基金項(xiàng)目：中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2011G25，0215P07)；極地專項(xiàng)(CHINARE2015-01-06，CHINARE2015-01-04)。

作者簡介：劉春影(1991-)，山東省菏澤市人，主要從事魚類免疫和極地微生物學(xué)研究。E-mail: liuchunying521@126.com * 通信作者：叢柏林，助理研究員，主要從事海洋微生物及經(jīng)濟(jì)魚類免疫研究。E-mail:biolin@fio.org.cn

中圖分類號:S154.36

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0253-4193(2016)06-0069-13

劉春影， 叢柏林， 王能飛，等. 南極菲爾德斯半島可培養(yǎng)土壤微生物多樣性及理化性質(zhì)鑒定[J].海洋學(xué)報(bào)，2016，38(6)：69—81， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.06.008

Liu Chunying， Cong Bailin， Wang Nengfei， et al. Biodiversity， physiological and biochemical identification of culturable microorganisms from the soil of Fildes Peninsula， Antarctica[J]. Haiyang Xuebao，2016，38(6)：69—81， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.06.008