王建秋　范如意　謝其洋　閆風(fēng)琴

(杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，浙江　杭州　310036)

·基礎(chǔ)研究·

乏氧激活人口腔鱗癌細(xì)胞DKKL1的表達(dá)

王建秋范如意謝其洋閆風(fēng)琴1

(杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，浙江杭州310036)

〔摘要〕目的探討常氧和乏氧條件下人口腔鱗癌細(xì)胞Dickkopf樣蛋白-1(DKKL1)的表達(dá)及可能的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。方法取對數(shù)生長期人口腔鱗癌SAS細(xì)胞和OECM-1細(xì)胞，常氧或乏氧(1.0% O2)條件下培養(yǎng)18 h，采用實時熒光定量PCR方法檢測DKKL1 mRNA水平的表達(dá)，采用Western印跡方法檢測其蛋白水平的表達(dá)；進(jìn)一步采用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)方法檢測DKKL1基因啟動子上H3K4乙酰化(H3K4ac)和二甲基化(H3K4me2)水平的變化。結(jié)果與常氧條件下相比，乏氧使DKKL1在SAS和OECM-1兩種口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)均顯著升高，其mRNA水平分別為常氧條件下的(4.0±0.4)倍(P<0.01)和(2.4±0.1)倍(P<0.01)；ChIP結(jié)果顯示，乏氧增加了DKKL1基因啟動子上H3K4ac水平，降低了H3K4me2水平。結(jié)論乏氧可激活口腔鱗癌細(xì)胞DKKL1的表達(dá)，該作用可能與乏氧調(diào)節(jié)DKKL1基因啟動子上組蛋白H3K4的乙?；投谆揎椨嘘P(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕口腔鱗癌；乏氧；Dickkopf樣蛋白-1；組蛋白修飾

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是常見的上皮來源頭頸部惡性腫瘤，目前，其發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不清楚。乏氧是腫瘤微環(huán)境的基本特征之一，通過激活缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程〔1，2〕。Dickkopf樣蛋白-1(DKKL1)基因啟動子上的組蛋白3(H3)化學(xué)修飾受到乏氧調(diào)節(jié)，由此推測，DKKL1的表達(dá)可能受到乏氧的調(diào)節(jié)作用，并可能在乏氧誘導(dǎo)腫瘤EMT過程中發(fā)揮作用。而關(guān)于DKKL1與腫瘤的相關(guān)性，目前鮮有報道。本研究擬檢測DKKL1基因啟動子上組蛋白標(biāo)記H3K4乙?；?H3K4ac)、H3K4二甲基化(H3K4me2)的化學(xué)修飾變化，初步探討乏氧調(diào)節(jié)DKKL1表達(dá)可能的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要材料人口腔鱗癌細(xì)胞系SAS和OECM-1(臺灣陽明大學(xué)生化暨分子生物研究所惠贈)；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(Thermo)；胎牛血清(Gibco)；總RNA提取試劑RNAiso Plus(TaKaRa)；反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(TaKaRa)；Real-time qPCR試劑盒UltraSYBRMixture(CWBIO)；DKKL1兔抗人多克隆抗體(Millipore)；Magna ChIPTM protein A+G magnetic beads(Millipore)；ChIPAb+ acetyl-histone H3(Lys4)set(Millipore，含兔抗人單克隆抗體、陰性對照IgG和GAPDH陽性對照引物)；ChIPAb+ dimethyl-histone H3(Lys4)set(Millipore，含鼠抗人特異性抗體、陰性對照IgG和GAPDH陽性對照引物)。

1.2主要儀器APM-30DR三氣培養(yǎng)箱(ASTEC，日本)；7500型熒光定量PCR儀(ABI，美國)；Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR，美國)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞的常氧培養(yǎng)和乏氧處理取生長狀態(tài)良好的SAS細(xì)胞和OECM-1細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。乏氧處理：取常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞，用含1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基換液，置于三氣培養(yǎng)箱中，將氧濃度調(diào)整為1%后繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

1.3.2實時熒光定量PCR檢測mRNA水平用Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real-time PCR 的引物合成在上海捷瑞生物工程有限公司完成，引物設(shè)計：DKKL1上游：5′-GGGATGGAGTTCTGTGTGGA-3′，下游：5′-AGCTTCGAGGGTGATTTGAA-3′，18S rRNA上游：5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′，下游：5′-CCATCCAATCGGTAG TAGCG-3′。采用SYBR-Green染料法進(jìn)行定量PCR，循環(huán)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。根據(jù)熔解曲線評估引物特異性。以18S RNA為內(nèi)參，采用2-△△CT法進(jìn)行相對定量分析，每次試驗設(shè)三復(fù)孔，行三次獨(dú)立重復(fù)試驗。

1.3.3Western印跡檢測蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，取60 μg蛋白樣品作十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%積層膠，10%分離膠)。將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF 膜與DKKL1抗體(1∶1 000)在4℃搖床下孵育過夜后，再與結(jié)合有熒光染料的二抗孵育。應(yīng)用Odyssey紅外掃描系統(tǒng)對 PVDF 膜進(jìn)行掃描成像。以β-actin(抗體稀釋比例為1∶1 000)作為內(nèi)參照。

1.3.4染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗1%甲醛固定細(xì)胞10 min，依次裂解細(xì)胞膜和細(xì)胞核。超聲破碎染色質(zhì)DNA，使其片段長度分布在200～1 000 bp。以稀釋緩沖液將染色質(zhì)懸液稀釋5倍，取2%作為對照，剩余部分五等分，分別加入抗H3K4ac、抗H3K4me2抗體和兔正常IgG、小鼠正常IgG，4℃搖床孵育過夜。應(yīng)用磁性A/G瓊脂糖株收集免疫沉淀復(fù)合物，充分洗滌后65℃水浴過夜。應(yīng)用PCR產(chǎn)物提取試劑盒提取DNA，以此為模板，應(yīng)用合成的DKKL1啟動子特異性引物(上游5′-CCCCGTTCTCAGCTTGATGT-3′，下游5′-TTCTTCCCTGGTGTCCATGC-3′)，SYBR green染色法進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2結(jié)果

2.1乏氧激活DKKL1在口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，乏氧顯著激活了兩種口腔鱗癌細(xì)胞系中DKKL1的轉(zhuǎn)錄(SAS細(xì)胞，常氧條件DKKL1 mRNA 0.075±0.001，乏氧條件0.300±0.027；OECM-1細(xì)胞：常氧條件DKKL1 mRNA 0.355±0.027，乏氧條件0.853±0.040)。乏氧處理18 h后，DKKL1在SAS細(xì)胞中的mRNA相對表達(dá)量是常氧條件下的(4.0±0.4)倍，而在OECM-1細(xì)胞中則是常氧條件下的(2.4±0.1)倍。與常氧條件相比，乏氧處理后SAS和OECM-1細(xì)胞DKKL1的蛋白表達(dá)均顯著增高。見圖1。

圖1　Western印跡檢測SAS、OECM-1細(xì)胞中DKKL1蛋白的表達(dá)

2.2乏氧調(diào)節(jié)DKKL1啟動子上的組蛋白修飾與常氧條件相比，乏氧處理可使OECM-1細(xì)胞DKKL1基因啟動子上的H3K4乙?；斤@著升高(H3K4ac抗體：常氧條件H3K4乙?；?.237±0.024，乏氧條件1.156±0.079;兔正常IgG：常氧條件H3K4乙酰化水平0.039±0.004,乏氧條件0.038±0.004)，達(dá)常氧條件下的(4.9±0.3)倍；而其二甲基化水平則明顯降低(H3K4 me2抗體：常氧條件下H3K4二甲基化水平4.042±0.399,乏氧條件0.383±0.039；小鼠正常IgG：常氧條件下H3K4二甲基化水平0.163±0.015,乏氧條件0.323±0.027)。

3討論

DKKL1屬于Dickkopf超家族成員，目前對其功能的認(rèn)識相對較為局限，主要集中于其對精母細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用〔3〕。不過最近有研究報道，DKKL1可能參與包括高級別膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤的調(diào)控〔4〕，但具體機(jī)制不清。Dickkopf蛋白家族多個成員(如DKK1、DKK3)是Wnt/β-catenin信號通路的有效拮抗劑，同時又受Wnt/β-catenin的反饋調(diào)節(jié)〔5，6〕，預(yù)示著該家族蛋白功能的復(fù)雜性。如DKK1一方面被報道為腫瘤抑制因子，在結(jié)腸癌和黑色素瘤中表達(dá)下調(diào)〔7〕；另一方面又被報道在乳腺癌、肺癌和肝癌中表達(dá)明顯增高，并促進(jìn)了肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移〔8〕。DKKL1是否也具有類似的腫瘤調(diào)節(jié)作用？本實驗結(jié)果顯示，在常氧條件下培養(yǎng)的口腔鱗癌細(xì)胞，無論是DKKL1的mRNA水平還是蛋白質(zhì)表達(dá)水平，都是非常低的。而之前關(guān)于DKKL1在正常組織中表達(dá)的報道，也僅見表達(dá)于睪丸組織〔4〕。然而，在缺氧誘導(dǎo)口腔鱗癌EMT的表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究中，從高通量測序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)DKKL1基因啟動子上的組蛋白修飾可能受到乏氧的顯著調(diào)控。口腔鱗癌增長迅速，易造成局部乏氧微環(huán)境〔9〕，而乏氧是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT、促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要刺激因子。目前，尚未見乏氧影響腫瘤細(xì)胞DKKL1表達(dá)的相關(guān)報道。而本實驗中，乏氧激活了DKKL1在口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)。

組蛋白修飾調(diào)節(jié)可改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動子或其他順式作用元件的結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)〔10〕。組蛋白H3/H4的位點(diǎn)特異性乙?；ǔ鸹蜣D(zhuǎn)錄激活，去乙?；瘎t導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制〔11〕。組蛋白的甲基化和去甲基化修飾對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)各不相同〔12〕。本實驗采用ChIP方法，發(fā)現(xiàn)與常氧條件相比，乏氧顯著增加DKKL1啟動子上H3K4乙酰化水平，而降低了其二甲基化水平。因此推測乏氧通過對基因啟動子上的組蛋白H3K4位點(diǎn)特異性乙酰化和二甲基化的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)實現(xiàn)了對DKKL1的轉(zhuǎn)錄激活作用,符合染色質(zhì)的“二價域”(bivalent domains)調(diào)節(jié)基因功能的理論〔13〕。

Wnt/β-catenin是EMT過程中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,DKKL1會否像DKK1或DKK3一樣參與Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)節(jié)，并通過該信號通路參與調(diào)節(jié)EMT，有待深入研究。

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〔2016-01-17修回〕

(編輯袁左鳴)

Activation of DKKL1 expression by hypoxia in human OSCC cell lines

WANG Jian-Qiu,FAN Ru-Yi,XIE Qi-Yang,et al.

Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Medicine,Hangzhou Normal University,Hangzhou 310036,Zhejiang,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of tumor hypoxia microenvironment on expression of DKKL1 in oral squamous cell carcinoma(OSCC)cells lines and explore its potential epigenetic mechanism.MethodsTwo kinds of human OSCC cell lines in exponential growth phase,SAS and OECM-1 cells,were cultured in normoxia or hypoxia(1.0% oxygen)conditions for 18 h.Both Real-time PCR and Western blot were applied to detect the change of DKKL1 expression.Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)experiments were performed to detect the changes of histone modification of acetylated or dimethyl H3K4(H3K4ac/H3K4me2)on DKKL1 gene promoter.ResultsCompared to normoxic conditions,hypoxia(1.0%)significantly increased the expression of DKKL1 in both SAS and OECM-1 cells,and the relative mRNA level was (4.0±0.4)folds and(2.4±0.1)folds of that under normoxia in SAS(P<0.01)or OECM-1(P<0.01)cells,respectively.ChIP experiments showed that level of H3K4ac on promoter of DKKL1 gene was increased,while the level of H3K4me2 was reduced significantly.ConclusionsHypoxia activates the expression of DKKL1,which may be related with the regulation of hypoxia on histone modification of H3K4ac and H3K4me2 on the promoter of DKKL1 gene.

【Key words】Oral squamous cell carcinoma; Hypoxia; DKKL1; Histone modification

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(No.81301850)；浙江省教育廳科研項目(No.Y201328812)

通訊作者：閆風(fēng)琴(1978-)，女，主治醫(yī)師，主要從事頭頸癌放射治療的研究。

〔中圖分類號〕R739.8

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2569-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.001

1浙江省腫瘤醫(yī)院放療科十九病區(qū)

第一作者：王建秋(1979-)，男，助理研究員，主要從事腫瘤與衰老的研究。