謝有科，李雪梅，黃丁平

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萊菔硫烷經(jīng)由miR-124抑制SWO-38膠質(zhì)瘤干細胞的增殖

謝有科，李雪梅，黃丁平

摘要：目的研究萊菔硫烷對SWO-38膠質(zhì)瘤干細胞增殖的影響及其機制。方法細胞增殖實驗檢測萊菔硫烷對SWO-38細胞增殖的影響；克隆形成實驗、腫瘤球形成實驗、蛋白印跡法等檢測并比較萊菔硫烷處理前后SWO-38細胞克隆形成能力、腫瘤球形成能力及干性相關(guān)基因（如β-catenin、Oct4、Sox-2、c-Myc）表達水平等改變，比較萊菔硫烷和（或）miR-124抑制物處理對干性相關(guān)基因表達水平的影響。實時熒光定量PCR檢測萊菔硫烷對miRNA-9、21、221、124、128、181等轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果萊菔硫烷有效抑制SWO-38細胞增殖，其平均半數(shù)抑制濃度為（26.41±2.13）μmol/L。萊菔硫烷呈現(xiàn)劑量依賴性地削弱SWO-38細胞克隆和腫瘤球形成的能力。萊菔硫烷下調(diào)β-catenin、Oct4、Sox-2和c-Myc等干性相關(guān)基因的表達。同時，萊菔硫烷還影響miR-9、21、221、124、128、181 等miRNA的轉(zhuǎn)錄水平，其中miR-124轉(zhuǎn)錄水平增高約5.9倍，miR-128增高約2.6倍。miR-124抑制物組βcatenin、Oct4、Sox-2等基因表達較空白對照組顯著增高，而miR-124抑制物與萊菔硫烷聯(lián)合組上述基因表達水平高于萊菔硫烷組，但低于miR-124抑制物組。結(jié)論萊菔硫烷有效抑制SWO-38膠質(zhì)瘤干細胞的增殖，其機制可能與miR-124/（β-catenin/Sox-2/Oct4）通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)膠質(zhì)瘤；腫瘤干細胞；細胞增殖；微RNAs；萊菔硫烷；miR-124

作者單位：南寧，廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院腫瘤科（郵編530011）

萊菔硫烷（sulforaphane, SFN）是從十字花科蔬菜中提取的主要活性產(chǎn)物，其作為天然的預(yù)防腫瘤食物已有較長的應(yīng)用歷史，并顯示了較強的防癌功效。萊菔硫烷可經(jīng)多種途徑減少腫瘤的發(fā)生，抑制腫瘤細胞增生并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。近來年研究發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷能特異性抑制多種腫瘤干細胞的自我更新和增殖[1]，其臨床應(yīng)用潛力巨大。腦膠質(zhì)瘤因其存在位置的重要性、難以手術(shù)清除和血腦屏障等原因，一直是臨床抗腫瘤治療的難題。膠質(zhì)瘤存在極少部分具有干性特征的細胞亞群，即膠質(zhì)瘤干細胞（glio?ma stem cells,GSCs），而GSCs被認為是膠質(zhì)瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)及放化療耐藥的根源[2-3]。靶向GSCs的藥物可能從根本上阻斷膠質(zhì)瘤的增殖與復(fù)發(fā)。目前已知萊菔硫烷對多種膠質(zhì)瘤細胞株均有較強的抑制作用[4-5]，展現(xiàn)了較強的抗腫瘤活性，而其對GSCs的影響至今尚鮮見報道。本研究采用克隆形成及腫瘤球形成、蛋白印跡、miRNA抑制物等方法分析萊菔硫烷對SWO-38細胞株中GSCs的抑制作用及其潛在分子機制，以期為萊菔硫烷的臨床應(yīng)用提供新的證據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料萊菔硫烷購自Sigma公司，鼠抗人β-catenin、Oct4、Sox-2、c-Myc等單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，過氧化物酶標記的二抗、噻唑藍、DMEM F12等購自北京鼎國生物公司，miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒購于北京博凌科為生物公司，Lipofectamine 2000及B27、EGF、Basic FGF等無血清培養(yǎng)基添加物購于Invitrogen公司，miRNA引物及miR-124抑制物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。ABI 7300型PCR儀（ABI公司），分子成像儀（XRS+）為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2細胞培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細胞SWO-38由暨南大學醫(yī)學院病理教研室鐘雪云教授惠贈，在10%新生牛血清DMEM高糖培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)及備用。實驗用的細胞均處于對數(shù)生長期。

1.3細胞增殖實驗細胞按1×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，細胞貼壁后，換成含有1、5、10、25、40、50、60 μmol/L萊菔硫烷的DMEM培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)72 h后向各培養(yǎng)孔中加入噻唑藍10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在各培養(yǎng)孔中吸出培養(yǎng)液150 μL，回補等體積二甲基亞砜，避光振蕩10 min后在酶標儀上選擇570 nm波長測定各孔光密度（OD）值。每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)實驗3次，然后計算各組細胞存活率。存活率（%）=（處理組OD值-對照組OD值）/對照組OD值×100%，以及平均半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4平板克隆形成實驗貼壁細胞經(jīng)胰酶消化，充分吹打，加入常規(guī)培養(yǎng)液，制備成單細胞懸液，細胞終濃度為40個細胞/mL。細胞分5組，每組3個重復(fù)孔。每孔加入200個細胞約5 mL，并適當震動以使細胞均勻分散。置入恒溫細胞培養(yǎng)箱中，8 h后加入萊菔硫烷，濃度分別為0、2.5、5.0、10、25 μmol/L，每3～4 d換培養(yǎng)液1次，培養(yǎng)2～3周。當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，以多聚甲醛固定細胞，加Giemsa液染色，輕柔洗去染色液后常溫干燥。在低倍鏡下計數(shù)＞50個細胞的克隆數(shù)。克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）× 100%。

1.5腫瘤球形成實驗細胞經(jīng)胰酶消化后，常溫離心，1 000 r/min，2 min，棄上清。加入3 mL無菌磷酸鹽緩沖液，輕柔吹散并洗滌細胞沉淀，再次離心。洗滌3次后，加入無血清的腫瘤球培養(yǎng)基，制備成單細胞懸液。調(diào)整細胞密度為1 500 個/mL，加入超低黏附6孔板，5 mL/孔，加入相應(yīng)濃度萊菔硫烷，置入細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。實驗按藥物濃度分為0、2.5、5.0、10、25 μmol/L等5組。每3～4 d更換培養(yǎng)液1次，7 d后在低倍鏡下觀察并計數(shù)或測量腫瘤球。腫瘤球體積V = (4/ 3)πR3，其中R為腫瘤球半徑。

1.6蛋白印跡實驗萊菔硫烷對干性相關(guān)基因表達影響的實驗分為對照組和處理組。處理組在細胞貼壁后加入含萊菔硫烷培養(yǎng)液（終濃度10 μmol/L）。萊菔硫烷與miR-124相互作用實驗分為對照組、萊菔硫烷組、miR-124抑制物組和聯(lián)合組。細胞按5×105/mL接種于200 mL培養(yǎng)瓶中，貼壁后處理組加入萊菔硫烷（終濃度10 μmol/L）和（或）miR-124抑制物（按說明書使用）。以上實驗的對照組均常規(guī)培養(yǎng)，不作任何處理。72 h后用胰酶消化并收集細胞沉淀。按10×106個細胞加入1 mL預(yù)冷RIPA裂解液，4℃低溫下裂解20 min，于4℃離心12 000 r/min，20 min，收獲上清液，測定蛋白濃度后分裝備用于-80℃冰箱。電泳前取蛋白液解凍，按1∶5加入十二烷基磺酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）上樣緩沖液，96℃恒溫水浴加熱5 min，各組取等量蛋白電泳（12% SDS-PAGE），并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉，加入稀釋的β-catenin、Oct4、Sox-2、c-Myc、GAPDH等單克隆抗體（一抗），37℃下孵育2 h，TBST緩沖液[含10 mmol/L Tris?HCl（pH值7.50）、100 mmol/L NaCl、0.50 g/L Tween-20]洗膜5 min，3次，加入辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgGⅡ（1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST液洗滌5 min，3次，化學發(fā)光法顯影于分子成像儀。

1.7實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測實驗分為對照組和萊菔硫烷組。萊菔硫烷組在SWO-38細胞貼壁后更換培養(yǎng)液（萊菔硫烷終濃度10 μmol/L），對照組不作任何處理。常規(guī)培養(yǎng)72 h后使用Trizol試劑提取細胞總RNA。根據(jù)待測miRNA序列設(shè)計合成引物，見表1。利用SYBR Green試劑盒進行qRT-PCR驗證，U6基因為內(nèi)參。擴增程序為97℃3 min；95℃變性30 s，56℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。實驗重復(fù)3次。結(jié)果以2-ΔΔCt表示[6]。

Tab. 1 Oligonucleotide primers in quantitative real-time PCR表1實時定量PCR的寡核苷酸引物

1.8統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標準差（x ±s）表示，miRNA表達結(jié)果采用配對資料t檢驗，多組樣本均數(shù)比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析，多樣本均數(shù)間多重比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1萊菔硫烷對SWO-38細胞增殖的抑制作用萊菔硫烷終濃度分別為1、5、10、25、40、50、60 μmol/L時，作用于SWO-38細胞72 h，細胞存活率分別為95.15%、85.38%、71.66%、53.71%、22.82%、12.39%和8.42%。隨著萊菔硫烷劑量增加，SWO-38細胞的增殖活性逐漸降低，呈明顯的劑量依賴關(guān)系。IC50為26.41 μmol/L。

2.2萊菔硫烷抑制SWO-38細胞的克隆形成和腫瘤球形成萊菔硫烷在較低濃度（2.5 μmol/L）時即能削弱SWO-38細胞克隆形成能力，克隆形成率隨萊菔硫烷濃度增高而降低，在10 μmol/L以上較為明顯，IC50為5.62 μmol/L。同時，在腫瘤球培養(yǎng)實驗中，SWO-38腫瘤球形成的數(shù)量及體積隨萊菔硫烷劑量增高而下降，呈劑量依賴性。腫瘤球形成IC50為5.37 μmol/L。見表2。

Tab. 2 Effects of sulforaphane on the growth of cell cloneand tumor sphere (SWO-38)表2萊菔硫烷對SWO-38細胞克隆及細胞腫瘤球生長的影響?。╪=3，x ±s）

2.3萊菔硫烷抑制SWO-38細胞干性相關(guān)基因的表達蛋白印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，處理組（萊菔硫烷終濃度10 μmol/L）β-catenin、c-Myc、Oct4、Sox-2等基因表達水平顯著下降，見圖1。

2.4萊菔硫烷上調(diào)miR-124的表達qRT-PCR檢測miRNAs發(fā)現(xiàn)，萊菔硫烷處理后miRNAs表達譜發(fā)生不同程度改變，其中miR-124轉(zhuǎn)錄水平較對照組增高（5.9±1.2）倍（t=11.132，P=0.008）；miR-128增高（2.6±0.7）倍（t=3.357，P=0.078）；miR-181增高（0.84±0.71）倍（t=1.173，P=0.341）。而miR-9、21、221等與對照組比較均呈現(xiàn)不同程度地下降，見圖2。

Fig.1 Effects of sulforaphane on the expressions of stem-relative genes in SWO-38 cells圖1萊菔硫烷對干性相關(guān)基因表達的影響（SWO-38細胞）

Fig. 2 Changes of miRNAs after treatment with sulforaphane圖2萊菔硫烷處理后miRNAs轉(zhuǎn)錄水平變化

2.5萊菔硫烷與miR-124抑制物對干性相關(guān)基因的影響蛋白印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，βcatenin、Oct4、Sox-2等基因的表達在miR-124抑制物組中表現(xiàn)為增高；在萊菔硫烷組中表現(xiàn)為降低。在miR-124抑制物與萊菔硫烷聯(lián)合組中這些蛋白表達水平較萊菔硫烷組有所增高，但低于miR-124抑制劑組，見圖3。

3　討論

腫瘤干細胞理論認為，腫瘤組織中存在著數(shù)量極少的腫瘤干細胞，它是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)及放化療耐受的主要原因。開發(fā)和研究針對腫瘤干細胞的靶向藥物在腫瘤精準治療中具有重要意義。但至今為止，僅有萊菔硫烷、鹽霉素、小檗胺等少數(shù)天然提取物或合成藥物被認為對腫瘤干細胞有特異性抑制作用。萊菔硫烷來源于天然食物，無明顯不良反應(yīng)，容易通過血腦屏障，可抑制乳腺癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤干細胞的增殖，受到廣泛關(guān)注[1,7]。本研究表明，萊菔硫烷有效抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖，并且膠質(zhì)瘤細胞形成細胞克隆及腫瘤球的能力受到明顯削弱。萊菔硫烷在抑制膠質(zhì)瘤細胞克隆和腫瘤球形成的最低有效濃度（5.0 μmol/L）明顯低于抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖濃度[（26.41±2.13）μmol/L]。因克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力，而腫瘤球形成實驗反映了腫瘤干細胞自我更新及增殖的能力。筆者推測萊菔硫烷在較低的濃度下可能優(yōu)先抑制GSCs的增殖。

Fig. 3 The effect of sulforaphane and miR-124 on stem relative genes圖3萊菔硫烷與miR-124抑制物對SWO-38細胞干性相關(guān)基因表達的影響

萊菔硫烷抗腫瘤干細胞機制目前仍未完全清楚。近年研究證實，在乳腺癌中萊菔硫烷可下調(diào)Wnt/β-catenin通路，通過GSK3β誘導(dǎo)β-catenin磷酸化和泛素化降解[1]。Sox-2、Oct4和c-Myc等蛋白與腫瘤干細胞的增殖密切相關(guān)，其表達異常直接影響腫瘤干細胞的生物學行為[8-10]。Lin等[11]發(fā)現(xiàn)，白血病干細胞高表達Sox-2、Oct4和β-catenin基因，而萊菔硫烷能經(jīng)由β-catenin通路加強伊馬替尼對白血病干細胞的抑制作用。本研究同樣發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷有效地抑制β-catenin通路及Sox-2、Oct4、c-Myc等干性相關(guān)基因的表達。最新研究證實，miR-208a可能是β-catenin和Sox-2的上游調(diào)節(jié)子，且miR-208a可能與let-7形成反饋調(diào)節(jié)環(huán)，共同調(diào)節(jié)乳腺癌干細胞的自我更新[12]。因此，本課題組推測萊菔硫烷在β-catenin、Sox-2、Oct4等信號通路上游可能存在共同的調(diào)節(jié)因子。

miRNAs是一類功能強大的調(diào)節(jié)子，一種miRNA可調(diào)節(jié)成百上千個不同通路基因。miR-124在腦組織中含量最豐富，在神經(jīng)系統(tǒng)相對特異表達，參與神經(jīng)元的發(fā)育、分化、軸突生長以及對突觸可塑性的調(diào)節(jié)[13-14]。miR-124表達失活極易導(dǎo)致正常細胞的調(diào)節(jié)失控，進而導(dǎo)致惡性腫瘤等疾病的產(chǎn)生[15-16]。研究表明，miR-124在膠質(zhì)母細胞瘤組織中表達下調(diào)[17]，其表達情況可能與膠質(zhì)母細胞瘤的惡性增殖情況呈反比。而miR-124可通過靶向PPP1R13L基因而抑制膠質(zhì)母細胞瘤的增殖[18]。本課題組曾報道，通過增強miR-124的轉(zhuǎn)錄，可以上調(diào)Twist和SLUG的表達，從而抑制膠質(zhì)瘤細胞的分化[19]。這些研究均提示miR-124可能廣泛參與膠質(zhì)瘤生物學行為的調(diào)控。

本研究表明，萊菔硫烷可增強miR-124的轉(zhuǎn)錄，從而抑制β-catenin、Sox-2、Oct4等干性相關(guān)基因的表達。而下調(diào)miR-124則部分地削弱萊菔硫烷對這些干性相關(guān)基因的調(diào)控，降低其抗腫瘤效率。miR-124與β-catenin、Sox-2、Oct4等基因的調(diào)控關(guān)系目前鮮見報道。積累的證據(jù)顯示，miRNA除了直接結(jié)合于靶基因的3′末端非編碼區(qū)域外，還可結(jié)合于靶基因編碼區(qū)域[20]。同時，miRNA與靶基因之間的標靶序列結(jié)合形式也存在多樣性，可通過嚴密或非嚴密互補結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用[20]。例如，在胚胎干細胞分化過程中miR-296、miR-470和miR-134分別被證實調(diào)控著Nanog、Oct4和Sox2，其作用機制是通過編碼區(qū)序列的非嚴密結(jié)合原則進行的[20]。筆者推測，miR-124可能直接與β-catenin、Sox-2、Oct4等基因的mRNA結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達。這些相互作用的細節(jié)仍有待進一步研究。

綜上所述，萊菔硫烷有效抑制膠質(zhì)瘤細胞克隆和腫瘤球的形成以及部分干性相關(guān)基因的表達，提示萊菔硫烷可抑制GSCs的增殖，其分子機制可能與miR-124/(β-catenin/Sox-2/Oct4)通路有關(guān)。

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（2015-09-28收稿2015-11-12修回）

（本文編輯李國琪）

Sulforaphane suppressed the proliferation of glioma stem cells via miR-124

XIE Youke, LI Xuemei, HUANG Dingping
Department of Oncology, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, China

Abstract:Objective To investigate the effect of sulfuraphane (SFN) on proliferation of glioma stem cell line SWO-38, and its mechanism threreof. Methods Cell proliferation of SWO-38 treated with SFN was measured by cell prolifera?tion assay. Clone formation experiment, tumor sphere formation experiment and Western blotting method were applied to de?tect the ability of cell clone formation and tumor sphere formation, and the expression of stemness relative genes, such as βcatenin, Oct4, Sox-2 and c-Myc. The effects of SFN and/or miR-124 inhibitor (miR-124i) on the expression of stemness rel?ative genes were compared. Changes of miRNAs (miRNA-9, 21, 221, 124, 128 and 181) induced by SFN were measured by real time quantity PCR. Results SFN suppressed the proliferation of SWO-38 cells in a dose-dependent manner, in which IC50was (26.41±2.13)μmol/L. SFN also decreased the ability of forming cell clone and tumor sphere, as well as the expres?sion of stemness relative genes (β-catenin, Oct4, Sox-2 and c-Myc) in a dose-dependent manner. At the same time, SFN led to the change in many miRNAs, during which SFN increased the transcription of miR-124 (-5.9-fold) and miR-128 (-2.6-fold), and decreased the transcription of miR-9, miR-21 and miR-221. Compared to the blank control, the expression levels of β-catenin, Oct4, and Sox-2 were significantly increased in miR-124i group. On the other hand, the expressions of above genes were also higher in combined group, which was treated with miR-124i and SFN than those in SFN group, but lower than those of miR-124i group. Conclusion SFN can efficiently inhibit the proliferation of giloma stem cells in SWO-38 cell line through miR-124/(β-catenin/Sox-2/Oct4)signalingpathway.

Key words:glioma; neoplastic stem cells; cell proliferation; microRNAs; sulforaphane; miR-124

中圖分類號：R739.4

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/20150197

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81560476）

作者簡介：謝有科（1979），男，主治醫(yī)師，博士，主要從事膠質(zhì)瘤及肺癌等腫瘤干細胞的臨床防治研究