孫鴻婉，李志剛，張靜瑩

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Ti-6Al-7Nb噴砂酸蝕處理后對大鼠成骨細(xì)胞的影響

孫鴻婉1，李志剛1，張靜瑩2

摘要：目的研究純鈦（Ti）、Ti-6Al-7Nb表面經(jīng)噴砂酸蝕（SLA）處理后大鼠成骨細(xì)胞的生物相容性。方法實(shí)驗(yàn)分為Ti機(jī)械打磨組（S1組）、Ti噴砂酸蝕組（SLA1組）、Ti-6Al-7Nb機(jī)械打磨組（S2組）以及Ti-6Al-7Nb噴砂酸蝕組（SLA2組）。用顯微鏡觀察4組樣品的表面形貌，使用接觸角測量儀分析SLA1、SLA2組樣品表面親水性，并將2組樣品放入模擬體液（SBF）中，7、14、21 d后分別用掃描電鏡（SEM）、X線衍射儀（XRD）觀察樣品表面沉積物的形貌、物相，將從大鼠顱蓋骨中提取的成骨細(xì)胞接種于4組樣品上，用倒置顯微鏡觀察大鼠成骨細(xì)胞形態(tài)，用MTT比色法測量大鼠成骨細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯微鏡下SLA1、SLA2組較S1、S2組樣品表面擁有更多孔洞，接觸角測量儀分析得出SLA1、SLA2組樣品表面為親水性結(jié)構(gòu)，且SLA2組接觸角小于SLA1組；SEM顯示在14 d時SLA2組樣品表面最先觀察到覆蓋的羥基磷灰石涂層，21 d時2組樣品表面都觀察到羥基磷灰石涂層。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出成骨細(xì)胞在SLA1、SLA2組樣品表面增殖能力強(qiáng)于S1、S2組，且在SLA2組樣品表面的增殖能力強(qiáng)于SLA1組（P＜0.05）。結(jié)論噴砂酸蝕處理的Ti-6Al-7Nb擁有良好的生物相容性，有利于促進(jìn)種植體與骨組織的結(jié)合。

關(guān)鍵詞：噴砂酸蝕；模擬體液；成骨細(xì)胞；機(jī)械打磨；鈦；Ti-6Al-7Nb

隨著口腔醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，種植技術(shù)被越來越多地應(yīng)用于口腔修復(fù)中。目前鈦（Ti）及Ti-6Al-4V因其良好的機(jī)械性能，成為廣泛使用的種植材料[1]。然而，Ti在組織液中會發(fā)生腐蝕，種植體周圍會出現(xiàn)含Ti的黑色顆粒沉積[2]。Ti-6Al-4V合金在人體中會釋放含有釩（V）的有毒元素，因此尋找新型鈦種植體材料成為研究目標(biāo)。Ti-6Al-7Nb合金用鈮（Nb）代替V，減少了毒性元素的釋放，此外該合金還具有良好的機(jī)械性能。同時，骨內(nèi)種植材料的表面形態(tài)、親水性等也是影響種植體-骨結(jié)合及臨床療效的關(guān)鍵因素[3]。我國主要使用噴砂酸蝕（SLA）的方法處理Ti及鈦合金表面，噴砂酸蝕是種植體制作常用的一種方法[4]，能提高鈦合金表面的粗糙度，進(jìn)而提高種植體-骨組織的骨結(jié)合率，提高種植的早期穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察Ti-6Al-7Nb經(jīng)噴砂酸蝕處理后，其表面形貌、親水性對大鼠成骨細(xì)胞生物相容性的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器與試劑噴砂設(shè)備（JY-80D吸入式干燥砂機(jī)），噴砂介質(zhì)（Al2O3、SiO2、Fe2O3），X線衍射儀（XRD，9430-060-03002），超高分辨率場發(fā)射掃描電鏡（SEM，NOVA Nano?SEM450），倒置熒光顯微鏡（XSP-63XDV），接觸角測量儀（OCA20），SBF模擬體液[5]，胰酶（BIBCO美國），低速離心機(jī)（TDL-50D）。

1.1.2樣品的制備選取純Ti、Ti-6Al-7Nb兩種樣品，直徑14 mm，厚1 mm。兩種鈦片先后用800、1 500、2 000目SiC砂紙進(jìn)行機(jī)械打磨，將打磨過的鈦片放入丙酮中超聲清洗30 min，蒸餾水沖洗干燥。Ti、Ti-6Al-7Nb分別取一半在0.2 MPa壓強(qiáng)下噴砂30 s，將噴砂后的Ti、Ti-6Al-7Nb放入配置好的酸蝕液中酸蝕80 s，蒸餾水沖洗干燥。將樣品分為如下4組：Ti機(jī)械打磨組（S1組）、Ti噴砂酸蝕組（SLA1組）、Ti-6Al-7Nb機(jī)械打磨組（S2組）以及Ti-6Al-7Nb噴砂酸蝕組（SLA2組）。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動物新生24 h內(nèi)雄性SD大鼠10只，為一級普通動物，不計(jì)體質(zhì)量，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2012-001。

1.2方法

1.2.1樣品表面形貌觀察4組樣品各取3個在40倍顯微鏡下觀察其表面形貌。

1.2.2樣品表面接觸角測定將SLA后的Ti和Ti-6Al-7Nb各取4個放入接觸角測試儀中，觀察樣品表面的接觸角大小。1.2.3樣品表面的Ca、P沉積將SLA1、SLA2組樣品分別放入6孔板中，每孔加入10 mL模擬體液，放入37.5℃恒溫箱中，每2 d更換1次模擬體液，在7、14、21 d時從2組樣品中各取3個，去離子水清洗，40℃烘干。用SEM觀察樣品表面Ca、P沉積情況。

1.2.4樣品表面物相分析將SLA1、SLA2組樣品浸泡在10 mL的模擬體液中，分別在7、14、21 d時取出2組樣品放入XRD測試儀中，測試角度θ為20°～60°，分析表面物相。

1.2.5大鼠成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)無菌條件下取出新生鼠的顱蓋骨，用PBS沖洗，培養(yǎng)皿中加入PBS，刮除骨膜和結(jié)締組織，用手術(shù)剪刀將顱蓋骨剪碎，移至離心管中，1 000 r/min離心5 min，去上清液，加入0.25%胰蛋白酶，37℃恒溫消化20 min，吸出消化液，加入完全培養(yǎng)基，吹打骨片，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)。

1.2.6大鼠成骨細(xì)胞形態(tài)觀察在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別放入4組鈦片，將接種于鈦片表面的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化下來進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為1×105cells/mL，吹打均勻后接種到每個鈦片表面，每個鈦片上接種細(xì)胞密度為1×104cells/mL，4 h后每孔添加1 mL完全培養(yǎng)基，48 h后2.5%戊二醛置于4℃固定，4 h后棄戊二醛用50%、70%、90%、100%乙醇梯度脫水，每個梯度進(jìn)行2次，每次30 min，送檢前噴金，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的伸展情況。

1.2.7大鼠成骨細(xì)胞增殖情況測定將消化下來的細(xì)胞調(diào)整密度至1×105cells/mL，將細(xì)胞懸液接種到4組樣品表面，每個樣品表面接種細(xì)胞為1×104cells/mL，每個樣本設(shè)3個平行孔。4 h后每孔補(bǔ)加1 mL完全培養(yǎng)基，37℃下孵育1、3、5 d。然后于相應(yīng)時間點(diǎn)上棄去原培養(yǎng)基后每個鈦片表面加550 μL MTT（50 μL，5 mg/L MTT加500 μL無血清培養(yǎng)基），37℃，5%CO2濃度條件下孵育4 h，去除無血清培養(yǎng)基，每孔加400 μL DMSO，移液槍吹打均勻后將溶解液轉(zhuǎn)移至96孔板中，最后于酶標(biāo)儀下測定570 nm下的吸光度（A）值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用x ±s表示，組間比較用方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1樣品表面形貌顯微鏡下可見S1、S2組樣品表面光亮，具有砂紙打磨的機(jī)械劃痕，SLA1、SLA2組樣品表面出現(xiàn)明顯孔洞結(jié)構(gòu)，大小不等，SLA1、SLA2組較S1、S2組樣品表面粗糙，有利于增加種植體接觸面積，見圖1。

Fig. 1 The surface morphology of samples under low multiple microscope（×40）圖1低倍數(shù)顯微鏡下樣品表面形貌（×40）

2.2樣品表面的接觸角分析SLA1、SLA2組樣品表面的接觸角情況，見圖2。2組樣品表面接觸角均小于90°，為親水性，這種性能更接近于骨小梁結(jié)構(gòu)。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)大多數(shù)測量顯示Ti-6Al-7Nb的接觸角小于Ti，具有更好的表面張力。

Fig. 2 The surface contact angle of SLA1 and SLA2 groups圖2 SLA1、SLA2組樣品表面接觸角

2.3樣品表面Ca、P沉積量和元素分析SEM下觀察，SLA1、SLA2組樣品在模擬體液中浸泡7 d后表面無Ca、P沉積物，仍為多孔結(jié)構(gòu)；浸泡14 d后SLA1組樣品表面仍無Ca、P沉積，而SLA2組樣品表面可見Ca、P沉積并形成沉積基團(tuán)；浸泡21 d后2組樣品上均有Ca、P沉積形成沉積基團(tuán)，見圖3～5。對浸泡21 d的2組樣品進(jìn)行能譜分析，Ti表面主要是Ti、O、Ca、P、C、Na、Cl，Ca/P=1.933；Ti-6Al-7Nb表面主要是Ti、Al、Nb、O、Ca、P、C、Na、Cl，Ca/P= 1.64，見圖6。

Fig.3 SEM micrographs of SLA1 and SLA2 groups after beingsoaked in SBFfor 7 d（×3 000）圖3 SLA1、SLA2組樣品在SBF中浸泡7 d后的SEM形貌（×3 000）

Fig.4 SEMmicrographs of SLA1and SLA2groups afterbeingsoakedin SBFfor 14 d圖4 SLA1、SLA2組樣品在SBF中浸泡14 d后SEM觀察

Fig.5 SEM micrographs of SLA1 and SLA2 groups after beingsoaked in SBFfor 21 d（×2 000）圖5 SLA1、SLA2組樣品在SBF中浸泡21 d后SEM觀察（×2 000）

2.4樣品表面XRD成分分析在SBF中浸泡7 d

后SLA1、SLA2組樣品表面只有明顯的Ti衍射峰，

14 d后觀察到SLA1組樣品表面有Ti和TiO衍射峰，而SLA2組樣品除了以上兩種以外還有微弱的羥基磷灰石（HA）和銳鈦礦衍射峰，至21 d SLA2組樣品中檢測到HA和TiO明顯增多，此外又出現(xiàn)了微弱的金紅石和CaTiO3，見圖7。

Fig.7 X-ray diffraction (XRD)phase analysis of SLA1 and SLA2 groups after beingsoaked in SBFfor 7 d, 14 d and 21 d圖7 SLA1、SLA2組樣品在模擬體液浸泡7、14、21 d后的XRD物相分析

2.5大鼠成骨細(xì)胞的鑒定倒置顯微鏡下觀察到大鼠成骨細(xì)胞為長短不一、細(xì)長的紡錘型和梭形等，細(xì)胞核明顯，核仁清晰可見，見圖8。

2.6大鼠成骨細(xì)胞黏附情況大鼠成骨細(xì)胞均能黏附于4組鈦片上，在S1、S2組鈦片上只有輕微的附著，在SLA1、SLA2組可以發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞的偽足深入到孔洞中，大鼠成骨細(xì)胞牢固地附著于鈦片表面，其中SLA2組成骨細(xì)胞黏附形態(tài)又好于SLA1組，見圖9。2.7大鼠成骨細(xì)胞增殖情況成骨細(xì)胞接種于4組樣品表面，1、3、5 d后，隨著時間的增長樣品表面的細(xì)胞逐漸增多，1 d時S1和SLA1之間細(xì)胞增殖量無差別（P=0.168），SLA2組細(xì)胞增殖量多于S2組、SLA1組（P＜0.05）；3、5 d時SLA1組細(xì)胞增殖量多于S1組，SLA2組細(xì)胞增殖量多于S2組、SLA1組（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of osteoblast proliferation in sample surface for different time points between four groups表1不同時間4組成骨細(xì)胞在樣品表面增殖情況比較（n=6，A，x ±s）

3　討論

目前口腔醫(yī)學(xué)主要使用的種植體材料為Ti、Ti-6Al-4V，Ti和Ti-6Al-4V的彈性模量高于人體骨組織，在口腔行使咀嚼功能時易發(fā)生斷裂[6]，Ti-6Al-4V植入人體后易釋放毒性元素V。本實(shí)驗(yàn)采用Ti-6Al-7Nb合金代替Ti-6Al-4V合金，減少毒性元素V的釋放，不僅提高了種植體材料的生物相容性，同時還擁有與人體相似的彈性模量。

為了達(dá)到種植體-骨結(jié)合的目的，對種植體表面進(jìn)行處理已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。近年來研究表明噴砂酸蝕處理后，種植體和成骨細(xì)胞之間接觸面積的增加可以改變表型表達(dá)，并允許更多的成骨細(xì)胞分化[7-8]。本實(shí)驗(yàn)得出，與機(jī)械打磨的樣品比較，噴砂酸蝕處理后的樣品表面具有大小不等的一級孔洞和二級孔洞，增加了樣品表面的粗糙度，有利于提高種植體的生物活性。

種植體植入人體頜骨中，兩者之間充滿液體成分，種植體與液體、液體與頜骨之間形成的接觸角越小潤濕越好，越有利于種植體-骨之間的結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)研究表明噴砂酸蝕處理的Ti-6Al-7Nb與Ti相比接觸角小，說明Ti-6Al-7Nb濕潤性好，有利于提高種植體與骨的接觸面積。并且Conserva等[9]研究證明成骨細(xì)胞生長在粗糙和親水性的鈦片表面具有更強(qiáng)的分化能力。

此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)噴砂酸蝕處理的Ti-6Al-7Nb放入模擬體液21 d后表面擁有大量Ca、P沉積，可誘導(dǎo)形成羥基磷灰石涂層。HA涂層可以加快種植體與骨結(jié)合的速度，能誘導(dǎo)骨組織長入孔隙中，與新形成的骨組織呈交叉結(jié)構(gòu)，在短時間內(nèi)形成牢固的骨結(jié)合[10]。MTT結(jié)果顯示，噴砂酸蝕處理的Ti-6Al-7Nb比其他3組樣品更能促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖，使更多的成骨細(xì)胞和細(xì)胞突起嵌入鈦片孔洞中，說明噴砂酸蝕處理的Ti-6Al-7Nb擁有良好的生物相容性。上述結(jié)果顯示，Ti-6Al-7Nb經(jīng)噴砂酸蝕處理后對種植體-骨結(jié)合和表面生物相容性均有很大提高。

（圖6，8，9見插頁）

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（2015-08-20收稿2015-10-23修回）

（本文編輯李國琪）

The effects of sanding acid etch treatment of Ti-6Al-7Nb surface on rat osteoblasts

SUN Hongwan1, LI Zhigang1, ZHANG Jingying2
1 The Second Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, China;
2 School of Medicine, Dalian University
Corresponding Author E-mail: ZGLi700103@163.com

Abstract:Objective To investigate the biocompatibility of pure titanium (Ti) and Ti-6Al-7Nb surface treated by sanding acid etch (SLA) on rat osteoblasts. Methods Experiments were divided into four groups, Ti mechanical grinding group (S1 group), Ti sand-blastingacid group (SLA1 group), Ti-6Al-7Nb mechanical grindinggroup (S2 group)and Ti-6Al-7Nb sand-blasting acid group (SLA2 group). The surface topography of samples was examined by microscope. The contact angle measurement instrument was used to analyse surface hydrophily of SLA1 and SLA2 groups. The surface sediment mor?phology and phase were observed by scanningelectron microscopy (SEM)and X-ray diffraction (XRD)in two groups after be?ing soaked into simulated body fluid (SBF) for 7 d，14 d and 21 d. Osteoblasts extracted from rats were seeded on titanium sheets, and the osteoblast cells on different titanium surfaces were observed by inverted microscope. MTT colorimetric meth?od was used to measure the proliferation of osteoblasts. Results Compared with S1 and S2 groups, there were more holes on sample surface of SLA1 and SLA2 groups. The sample surface was hydrophilic structure in SLA1 and SLA2 groups. The con?tact angle was smaller in SLA2 group than that of SLA1 group. The hydroxyapatite coating was firstly observed in SLA2 group at 14 d. The hydroxyapatite coating was found in samples of two groups after 21 d. The proliferative ability of osteo?blasts was stronger in SLA1 and SLA2 groups than that of S1 and S2 groups. And the proliferative ability of osteoblasts was stronger in sample surface of SLA2 group than that of SLA1 group (P＜0.05). Conclusion Ti-6Al-7Nb by SLA has good biological compatibility, which is helpful to promote the combination of implant and bone tissue.

Key words:sandblastingetching; simulated body fluid; osteoblast; mechanical grinding; titanium; Ti-6Al-7Nb

中圖分類號：R783.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.11958/20150084

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金青年基金（81500890）；大連市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2013E11SF057）
作者單位：1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔修復(fù)科（郵編121000）；2大連大學(xué)醫(yī)學(xué)部

作者簡介：孫鴻婉（1990），女，研究生在讀，主要從事口腔修復(fù)、種植研究

通訊作者E-mail:ZGLi700103@163.com