錢麗波　王玨　錢源　肖雪　郭知　楊建林　楊繼青　張?zhí)m　馬潤玫

(1．云南省紅河州第三人民醫(yī)院　產(chǎn)科，云南　個舊　661000；2．昆明醫(yī)科大學(xué)婦產(chǎn)科細胞遺傳實驗室，云南　昆明　650032)

熒光原位雜交在產(chǎn)前診斷中與無創(chuàng)DNA檢測的對比研究

錢麗波1王玨2錢源2肖雪2郭知2楊建林2楊繼青2張?zhí)m2馬潤玫2

(1．云南省紅河州第三人民醫(yī)院產(chǎn)科，云南個舊661000；2．昆明醫(yī)科大學(xué)婦產(chǎn)科細胞遺傳實驗室，云南昆明650032)

【摘要】目的研究熒光原位雜交技術(shù)與無創(chuàng)DNA檢測在快速診斷胎兒染色體數(shù)目異常的價值。方法使用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，應(yīng)用特異性探針對包含5例無創(chuàng)DNA確診異常病例的372例胎兒羊水細胞進行熒光原位雜交。結(jié)果熒光原位雜交共檢出染色體數(shù)目異常20例，異常率為5.4%，包括唐氏患兒14例，占全部異常數(shù)的70%，18-三體綜合征3例，45，X2例，XXY1例，其中無創(chuàng)DNA送檢的5例異常病例中有4例均為唐氏患兒，比例為80%，熒光原位雜交檢測結(jié)果與羊水細胞核型分析結(jié)果相比較，在染色體數(shù)目異常方面兩者符合率為95.2%(20/21)。結(jié)論FISH技術(shù)用于快速診斷羊水細胞13、18、21、X，Y染色體數(shù)目時具有較高的臨床價值，但不能作為單獨的方法檢測染色體異常，而無創(chuàng)DNA檢驗可作為產(chǎn)前篩查新技術(shù)向特定孕婦推廣。

【關(guān)鍵詞】熒光原位雜交技術(shù)； 無創(chuàng)DNA檢測； 產(chǎn)前診斷； 染色體異常

染色體異常是造成新生兒缺陷的一類常見病因，發(fā)生率約1/120，其中約50%導(dǎo)致生長發(fā)育遲緩、智力落后、多發(fā)畸形及性發(fā)育異常等臨床表征。由于缺乏合適的治療方法，目前唯一的預(yù)防方法只有通過產(chǎn)前診斷來避免此類患兒的出生。較為普遍的胎兒染色體產(chǎn)前診斷方法是細胞遺傳學(xué)染色體核型分析，該技術(shù)需要對處于分裂中期的細胞進行，準確性高，但需細胞培養(yǎng)后進行染色體制備，由于其操作過程長且技術(shù)復(fù)雜，結(jié)果一般需要2周甚至更長的時間。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是一種非放射性原位雜交技術(shù)，利用特殊的熒光素標記DNA探針進行DNA雜交，經(jīng)免疫熒光顯色，可檢測細胞內(nèi)特異DNA存在與否，能快速、準確地確定細胞分裂間期核染色體非整倍體畸變[1]。胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(noninvasive prenatal testing，NIPT)，是利用大規(guī)模平行測序技術(shù)(massively parallel sequencing，MPS)對母體外周血中的游離DNA進行深度測序，獲取胎兒染色體信息的方法。由于該方法不需羊水穿刺等有創(chuàng)方法來獲得胎兒細胞，而且檢測時間較短，可在孕早期進行檢測，目前正處于快速的發(fā)展階段，隨著大規(guī)模的臨床試驗的驗證，有望代替侵入性的產(chǎn)前診斷方法。本研究使用國產(chǎn)試劑盒對372例羊水樣本的染色體數(shù)目異常進行快速診斷，并同時使用羊水培養(yǎng)進行常規(guī)染色體核型分析，由于羊水樣本中有5例是NIPT確診異常送檢，可同時比較三者結(jié)果以此探討其臨床應(yīng)用價值。

1材料和方法

1.1研究對象選擇本院自2012年6月至2014年5月期間進行羊膜腔穿刺的妊娠婦女共372名，其中5例為NIPT確診染色體異常送檢。所有羊水均培養(yǎng)成功進行核型分析。孕婦年齡21～43歲，孕周為18～24周。

1.2研究方法

1.2.1羊水采集在B超引導(dǎo)下，用21G PTC穿刺針經(jīng)腹壁抽取羊水25m1，置于無菌注射器中。留取5m1用于FISH檢測，其余用于細胞培養(yǎng)。

1.2.2羊水細胞FISH檢測步驟包括制片、雜交、洗脫和鏡檢部分。詳細操作參考金菩嘉公司操作手冊，并結(jié)合本實驗室的條件。共使用5種染色體探針，分為2組，即13/21組和18/X/Y組。13/21組的探針分別標記位于13q14(綠色)和21q22(紅色)處。18/X/Y探針分別定位于18，X，Y的p11.1-q11.1區(qū)域，分別標記水藍色、綠色和紅色。

1.2.3NIPT送檢本實驗中5例NIPT送檢結(jié)果分別由貝瑞何康公司送檢4例，深圳華大基因公司送檢1例，具體實驗操作參考其公司操作手冊。

1.2.4結(jié)果判讀本實驗中FISH結(jié)果判別時，每張羊水玻片至少計數(shù)50個細胞。若正常細胞數(shù)≥85%則判為異常，若異常細胞數(shù)≥65%則判為異常，若異常細胞數(shù)>15%，并且<60%,則需要加倍計數(shù)到100個細胞。

2結(jié)果

采用13/21號和18/X/Y染色體熒光探針檢測372例羊水間期核細胞。檢出染色體異常20例，唐氏患兒14例，占全部異常數(shù)的70%，18-三體綜合征3例，45，X2例，XXY1例，檢測結(jié)果與培養(yǎng)后羊水細胞核型檢測結(jié)果一致。詳見表1.

采用羊水細胞核型分析檢測372例羊水細胞，全部培養(yǎng)成功，其中檢出染色體異常21例，除一例為46，XX[14]/47,XX,+mar[21]外，其余結(jié)果均與FISH檢測的染色體結(jié)果一致。在診斷染色體數(shù)目異常上，F(xiàn)ISH檢測結(jié)果與羊水細胞核型分析的符合率為95.2%。

表1　 FISH實驗結(jié)果和細胞遺傳學(xué)實驗結(jié)果對照表(共21例異常)

3討論

唐氏綜合征是最常見的染色體非整倍體疾病[2]，其他比較常見的染色體非整倍體疾病包括18-三體、13-三體、Turner綜合征。目前診斷胎兒染色體非整倍體疾病唯有通過侵入性產(chǎn)前診斷操作，如絨毛活檢、羊膜腔穿刺獲得樣本。傳統(tǒng)的羊水細胞培養(yǎng)檢測方法細胞培養(yǎng)周期較長，容易給孕婦帶來焦慮感，也給臨床帶來不便。FISH檢測技術(shù)通過用已知的單鏈核酸探針，與標本中未知單鏈核酸結(jié)合，形成可檢測的雜交雙鏈核酸，不需要經(jīng)過細胞培養(yǎng)階段，因其快速、準確、靈敏度高、特異性強的突出特點彌補了長期以來僅依靠細胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷的不足和局限性，一定程度上避免了培養(yǎng)失敗的缺陷，實現(xiàn)了快速診斷染色體異常的可能。

由于侵入性操作可能會帶來的流產(chǎn)風(fēng)險，目前利用血清學(xué)生物標記物、超聲等對普通妊娠人群進行篩查，篩選出進一步行產(chǎn)前診斷的高危人群顯得尤為重要[3]。但是經(jīng)過傳統(tǒng)的篩查方法大約仍有5%的孕婦需要行侵入性操作，且僅有30%的胎兒會發(fā)現(xiàn)異常[4]。即使經(jīng)過數(shù)十年的努力，聯(lián)合篩查方法的應(yīng)用能使檢出率提高90%以上，但仍要有3%～5%的人群需行侵入性操作[5]。自從1997年，香港中文大學(xué)的盧煜明教授等[6]首先在母血漿中發(fā)現(xiàn)了胎兒游離DNA(cell free fetal DNA，cffDNA)，在正常妊娠過程中cffDNA幾乎全部來源于胎盤的滋養(yǎng)層細胞。由于cffDNA在孕7周胎兒胎盤循環(huán)建立后，就可以一定比例穩(wěn)定的存在于母體外周血中，且其半衰期只有16.3分鐘，在正常分娩2小時后在母體外周血中已檢測不到。因此cffDNA檢測不受孕周與年齡的限制，這使無創(chuàng)產(chǎn)前診斷成為可能。目前，隨著MPS的飛速發(fā)展，國內(nèi)外研究人員進行了大量的臨床試驗。Palomaki等[7, 8]的研究驗證了MPS對高危妊娠母體血漿胎兒T21的檢測擁有近99%的靈敏度和特異度。隨后該小組又發(fā)表一項研究顯示，MPS全基因組隨機測序技術(shù)對T18檢測的靈敏度為100%，假陽性率為0.28%，對T13檢測的靈敏度為91.7%，假陽性率為0.97%。同時NIPT還可檢測其他染色體非整倍體，包括易位型三體及嵌合型三體，對特納綜合征(45X)檢測的靈敏度為93.8%，特異度為99.8%。

本研究中羊水FISH檢測結(jié)果與羊水培養(yǎng)成功的372例結(jié)果相比，在檢測13號，18號，21號，X，Y染色體異常上，20例結(jié)果相符，所有唐氏患兒均被檢出。FISH漏檢一例46，XX [14]/47,xx,+mar [21]。FISH漏檢是因為易位區(qū)域或倒位在探針檢測范圍之外，這些染色體結(jié)構(gòu)異常會被遺漏，是FISH實驗的主要局限性。FISH應(yīng)該與羊水細胞遺傳學(xué)檢測即染色體核型分析相結(jié)合，才能全面地診斷胎兒染色體疾病，F(xiàn)ISH技術(shù)能否單獨作為產(chǎn)前診斷的方案供臨床選擇，值得商榷。

而對于NIPT送檢的5例樣本，其中有4例經(jīng)檢測均為唐氏患兒，與其送檢的檢測報告相符。而其中一例送檢時檢測報告為45,X，經(jīng)FISH和細胞遺傳學(xué)檢測均為正常，未發(fā)現(xiàn)其他異常。由此我們可以看出NIPT對于21號染色體具有較高的靈敏度的特異度，而對于非整倍體的X的檢出目前特異度還不是很理想，尚需進一步的研究和驗證。

相比于其他的篩查手段，我們可以看出NIPT技術(shù)在靈敏度和特異度方面有無可比擬的優(yōu)勢，但是由于現(xiàn)在MPS技術(shù)尚未大規(guī)模普及而且成本偏高，我們?nèi)匀徊恢С炙性袐D為了避免有創(chuàng)的羊水穿刺而選擇NIPT。目前國內(nèi)的產(chǎn)前診斷技術(shù)專家組于2012年就NIPT進行了論證，邊旭明等指出，該檢測技術(shù)是一種“近似于診斷水平”、“目標疾病指向精確”的產(chǎn)前篩查新技術(shù)，目前其臨床適用人群包括：①有介入性產(chǎn)前診斷禁忌證者(先兆流產(chǎn)、發(fā)熱、有出血傾向、感染未愈等)；②產(chǎn)前篩查高?；蚺R界高危孕婦；③珍貴兒，知情后拒絕介入性產(chǎn)前診斷的孕婦；④對介入性產(chǎn)前診斷極度焦慮的孕婦；⑤就診時處于較大孕周、超出目前產(chǎn)前篩查范圍的孕婦[9]。

隨著將來測序技術(shù)的進一步發(fā)展，NIPT的檢測成本將不再成為該技術(shù)廣泛應(yīng)用的瓶頸。而更大規(guī)模的NIPT臨床試驗也將進一步提高其準確性，NIPT的加入會極大的減少孕婦不必要的羊水穿刺，從而有效的提高我國產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷水平，也為孕婦們帶來福音。

參 考 文 獻

[1] Witters I, Devriendt K, Legius E, et al. Rapid prenatal diagnosis of trisomy 21 in 5049 consecutive uncultured amniotic fluid samples by fluorescence in situ hybridisation (FISH)[J]. Prenat Diagn,2002,22(1):29-33.

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[3] Wiseman FK, Alford KA, Tybulewicz VL, et al. Down syndrome--recent progress and future prospects[J]. Hum Mol Genet,2009,18(R1):R75-R83.

[4] Malone FD, Canick JA, Ball RH, et al. First-trimester or second-trimester screening, or both, for Down's syndrome[J]. N Engl J Med,2005,353(19):2001-2011.

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[8] Canick JA, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to identify Down syndrome and other trisomies in multiple gestations[J]. Prenat Diagn,2012,32(8):730-734.

[9] 邊旭明. 胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測[J]. 實用婦產(chǎn)科雜志，2013，5:330-333.

編輯：宋文穎

【Abstract】ObjectiveTo investigate the clinical value of fluorescence in situ hybridization(FISH) and noninvasive prenatal testing(NIPT) in rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy of fetus. MethodWith FISH technique, chromosome-specific DNA probe were used to detected 372 uncultured amniotic fluid samples included 5 abnormal samples detected by NIPT. Results20 cases of chromosome abnormal have been detected, the ratio is 5.4%,included 14 cases of Down syndrome(DS), 3 cases of trisomy 18 syndrome，2 cases of 45,X and 1 cases of XXY. The 5 abnormal cases send by NIPT have detected 4 cases of DS, the ratio is 80%. The coincidence rate of diagnosis between FlSH and conventional cytogenetics was 95.2%(20/21)．ConclusionsFISH technique has high clinical value for rapid detecting of fetus chromosome aneuploidy, but it can’t be taken to detect chromosome abnormalities alone, and the NIPT can be a new prenatal screening to popularize.

【Key words】FISH； NIPT； prenatal diagnosis； chromosomal abnormality

DOI:10.13470/j.cnki.cjpd.2016.01.007

【中圖分類號】R394

【文獻標識碼】A

(收稿日期：2015-02-21)