錢源　劉君　李曉紅　馬忠蕊　王艷梅　肖雪　郭知　張?zhí)m　屈在卿

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷室，云南 昆明　650032)

昆明地區(qū)妊娠糖尿病孕婦網(wǎng)膜下脂肪的全基因組甲基化差異研究

錢源劉君李曉紅馬忠蕊王艷梅肖雪郭知張?zhí)m屈在卿

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷室，云南 昆明650032)

【摘要】目的本研究應(yīng)用甲基化芯片技術(shù)研究妊娠糖尿病網(wǎng)膜下脂肪與正常對(duì)照組的全基因組甲基化差異，提供妊娠期糖尿病網(wǎng)膜下脂肪全基因組范圍內(nèi)的甲基化差異數(shù)據(jù)背景，為尋找妊娠糖尿病網(wǎng)膜脂肪基因表達(dá)差異原因提供線索。方法收集3例通過OGTT實(shí)驗(yàn)確診但未經(jīng)過治療的妊娠期糖尿病患者和同期3例年齡，孕次產(chǎn)次，孕前BMI與之無(wú)差異的健康對(duì)照者網(wǎng)膜下脂肪組織，提取總RNA后，采用Illumina Methylation BeadChipchip芯片進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行基因甲基化結(jié)果進(jìn)行比較，尋找具有甲基化差異的基因。結(jié)果結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩研究組中網(wǎng)膜下脂肪的全基因組DNA甲基化存在差異。妊娠糖尿病組中總共有1298個(gè)基因發(fā)生了低甲基化，1570個(gè)基因發(fā)生了高甲基化。這些基因參與了細(xì)胞骨架構(gòu)建，細(xì)胞凋亡調(diào)控，細(xì)胞核內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，糖和脂代謝，炎癥反應(yīng)等。進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，兩組樣本在miRNA啟動(dòng)區(qū)上位點(diǎn)甲基化變化水平不一致的基因有3個(gè)，包括：PSORS1C1，PCDHB13和DKFZp686A1627。在同一CpG島區(qū)域位點(diǎn)甲基化變化水平不一致的基因有7個(gè)，在miRNA區(qū)域具有甲基化差異的基因有13個(gè)。結(jié)論正常對(duì)照組與GDM組中基因的甲基化位點(diǎn)和水平存在顯著差異，這可能與該基因在組織中表達(dá)的蛋白水平在兩組中的差異表達(dá)密切相關(guān)。是否甲基化的差異是導(dǎo)致相應(yīng)基因表達(dá)水平差異的原因還需要深入的研究。未來需要進(jìn)一步弄清DNA甲基化在網(wǎng)膜下脂肪中對(duì)基因表達(dá)目標(biāo)蛋白的調(diào)控作用，為妊娠糖尿病的治療和預(yù)防提供線索。

【關(guān)鍵詞】妊娠期糖尿病；甲基化譜；全基因組；網(wǎng)膜下脂肪組織

妊娠糖尿病(GDM)的病因涉及遺傳、環(huán)境、疾病等諸多方面，其發(fā)病機(jī)制也相當(dāng)復(fù)雜，到目前為止，還沒有完全揭示清楚。GDM是由基因和環(huán)境相互作用引起的代謝紊亂，主要特點(diǎn)是胰島素抵抗。胰島素抵抗的本質(zhì)就是單位胰島素的生物效應(yīng)的降低，即胰島素刺激葡萄糖利用能力的降低。最初，可以通過代償性增加胰島素分泌，產(chǎn)生高胰島素血癥，維持血糖水平正常。當(dāng)這一過程發(fā)展到超過機(jī)體代償極限，則表現(xiàn)為糖尿病。

與皮下組織不同，網(wǎng)膜下組織在解剖學(xué)上擁有更豐富的血流和神經(jīng)分布，它表達(dá)更高的受體和具有更活躍的細(xì)胞代謝活性，使其對(duì)人體交感神經(jīng)系統(tǒng)敏感，分泌更多的脂肪因子和輸出更多的游離的脂肪酸，導(dǎo)致其與代謝相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)性更高[1-9]。

大量經(jīng)典遺傳學(xué)手段已經(jīng)證明，不同的個(gè)體在GDM易感性上存在差異，但是單純從基因變異的角度是無(wú)法完整解釋妊娠糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，DNA甲基化，特別是啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化可以調(diào)控脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄輔助因子以及很多脂肪組織特異性基因的表達(dá)[10-12]。糖尿病患者通過長(zhǎng)期飲食控制和運(yùn)動(dòng)會(huì)使得胰島素抵抗的情況得到改善。這些證據(jù)都支持DNA甲基化的異常非?？赡苁菍?dǎo)致妊娠糖尿病發(fā)生的重要原因，同時(shí)，也可能成為改善或者治療妊娠糖尿病的突破口。

因此，本研究應(yīng)用甲基化芯片技術(shù)研究妊娠糖尿病網(wǎng)膜下脂肪與正常對(duì)照組網(wǎng)膜下脂肪的全基因組甲基化水平，比對(duì)和分析正常對(duì)照組與GDM組中基因的甲基化位點(diǎn)和水平的差異，提供了妊娠期糖尿病網(wǎng)膜下脂肪全基因組范圍內(nèi)的甲基化差異數(shù)據(jù)背景，為尋找妊娠糖尿病網(wǎng)膜脂肪基因表達(dá)差異原因提供線索。

1資料與方法

1.1一般資料本次研究對(duì)象為2012年1月至2014年5月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診定期產(chǎn)前檢查并入院分娩的孕婦。在知情同意的前提下，選取3位妊娠期糖尿病孕婦為病例組(GDM組)，選取同期的3位正常孕婦為對(duì)照組(NGT組)。

1.1.1GDM的納入標(biāo)準(zhǔn)既往無(wú)高血壓、糖尿病以及心、肝、腎疾病以及自身免疫性疾病，并符合75g OGTT的妊娠糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2NGT的納入標(biāo)準(zhǔn)既往以及妊娠期無(wú)高血壓，糖尿病以及心，肝，腎疾病和自身免疫性疾病。75gOGTT試驗(yàn)正常。

入選本研究的孕婦均無(wú)重大疾病家族史，且在年齡，身高，體質(zhì)量和孕周等方面無(wú)明顯差異。病例均為單病種病例，除本文提及的疾病外未發(fā)現(xiàn)其他疾病。

1.2方法

1.2.1樣本采集在剖宮產(chǎn)術(shù)中迅速剝離大網(wǎng)膜脂肪，大小約為0.5cm×0.5cm×0.5cm，立即存儲(chǔ)于RNALater中，凍存于-80℃超低溫冰箱中。

1.2.2采用 Illumina Methylation BeadChip芯片進(jìn)行檢測(cè)甲基化檢測(cè)將基因組DNA亞硫酸鹽處理，變性和擴(kuò)增后，用隨機(jī)內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物。再將這些DNA片段與Methylation BeadChip芯片進(jìn)行雜交，通過芯片上的特異性捕獲探針與相互補(bǔ)的酶切基因片段結(jié)合，雜交過夜，清洗后進(jìn)行單堿基延伸和染色。根據(jù)只有與gDNA發(fā)生互補(bǔ)結(jié)合的探針才能得到延伸，染色后掃描。

1.2.3數(shù)據(jù)分析將掃描得到的原始數(shù)據(jù)，通過GenomeStudio 軟件，根據(jù)Methylation Analysis Algorithms 生成每個(gè)樣本每個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平，經(jīng)過偏差校正和位點(diǎn)過濾，得到甲基化水平結(jié)果。兩組樣本進(jìn)行配對(duì)的甲基化分析，篩選差異甲基化位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)為：adjustP<0.05，Beta 差異值≥0.2。

2結(jié)果

對(duì)妊娠糖尿病組和正常對(duì)照組的網(wǎng)膜下脂肪進(jìn)行全基因組甲基化水平檢測(cè)，比對(duì)并分析兩組樣本組中網(wǎng)膜下脂肪的全基因組DNA甲基化差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)總共有1298個(gè)基因發(fā)生了低甲基化，1570個(gè)基因發(fā)生了高甲基化。

進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，兩組樣本在miRNA啟動(dòng)區(qū)上位點(diǎn)甲基化變化水平不一致的基因有3個(gè)，包括PSORS1C1、PCDHB13和DKFZp686A1627。在同一CpG島區(qū)域位點(diǎn)甲基化變化水平不一致的基因有7個(gè)，在miRNA區(qū)域具有甲基化差異的基因有13個(gè)。具體基因列表見表1～3。

表1　在miRNA啟動(dòng)區(qū)上位點(diǎn)甲基化變化水平不一致的結(jié)果列表

表2　 在同一CpG島區(qū)域位點(diǎn)甲基化變化水平不一致結(jié)果表

表3　在miRNA區(qū)域具有甲基化差異的位點(diǎn)

3討論

本研究比對(duì)并分析兩研究組中網(wǎng)膜下脂肪的全基因組DNA甲基化差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總共有1298個(gè)基因發(fā)生了低甲基化，1570個(gè)基因發(fā)生了高甲基化。這些基因參與了細(xì)胞骨架構(gòu)建、細(xì)胞凋亡調(diào)控、細(xì)胞核內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖和脂代謝、炎癥反應(yīng)等。

在表1中，兩組樣本組中miRNA啟動(dòng)區(qū)上位點(diǎn)甲基化變化水平具有差異的基因包括：PSORS1C1、PCDHB13和DKFZp686A1627。PSORS1C1又稱為SEEK1，位于染色體6p21.3上HLA-C基因座的終端，兩個(gè)基因呈緊密連鎖。Cheung YH等[13]報(bào)道PSORS1C1可能和TCF19、POU5F1、CCHCR1等是1型糖尿病潛在的關(guān)聯(lián)致病基因。PCDHB13編碼原鈣黏附蛋白β13，這個(gè)基因是原鈣黏附β基因簇的一員，定位在5號(hào)染色體上。該蛋白由一個(gè)外顯子編碼，在特異的細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的神經(jīng)連接中起到重要的作用。DKFZp686A1627又名為PHF2P1，是一個(gè)假基因。

表2中，在同一CpG島區(qū)域位點(diǎn)甲基化變化水平不一致的基因包括：PFKP、GSTT1、ZFYVE28、PCDHB、RNF39、HLA-C、HLA-DRB。其中，PFKP基因又名為PFKF、PFK-C、PFK-P或者 ATP-PFK，定位在10號(hào)染色體上。該基因編碼PFKP蛋白酶，主要在糖代謝中不可逆的催化6磷酸果糖成為1,6雙磷酸果糖，在糖酵解中發(fā)揮重要作用[14,15]。Morgan AR等[16]報(bào)道過PFKP的基因變異與SGA的發(fā)生密切相關(guān)。GSTs(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)是人體內(nèi)一類具有重要解毒作用的多基因酶族。GSTs催化各種親電子致癌物與谷胱甘肽反應(yīng)。其中GST-θ同工酶由GSTT1基因編碼，分別對(duì)多環(huán)芳烴類和鹵代烷烴類具有很強(qiáng)的解毒作用[17,18]。RNF39又稱為HZF，HZFW， LIRF。該基因存在于6號(hào)染色體MHC I基因區(qū)域內(nèi)中間，HLA-J的前面。該基因編碼的蛋白在小鼠功能實(shí)驗(yàn)中表明在神經(jīng)突觸可塑性中起到非常重要的作用。人類白細(xì)胞抗原(HLA)基因位于第6對(duì)染色體短臂上，為一組密切連鎖的基因群。Ⅰ類基因區(qū)域包括HLA-A、HLA-B、HLA-C和其他一些功能未明的基因及假基因，其編碼的抗原分子存在于全部有核細(xì)胞的表面，負(fù)責(zé)遞呈外來抗原給CD8+的T淋巴細(xì)胞；Ⅱ類基因區(qū)域主要包括HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP3個(gè)亞區(qū)，分別編碼DR、DQ和DP抗原，存在于成熟B淋巴細(xì)胞及抗原遞呈細(xì)胞表面，負(fù)責(zé)遞呈抗原給CD4+細(xì)胞。HLA通過主要組織相溶性復(fù)合體(MHC)限制，參與T淋巴細(xì)胞識(shí)別抗原和其他免疫細(xì)胞的相互作用，以及自身耐受的形成和維持，在識(shí)別自身和異己、誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等多個(gè)方面均具有重要作用。研究支持HLA與糖尿病的發(fā)生有強(qiáng)烈的相關(guān)性[19]。

表3中，在miRNA區(qū)域具有甲基化差異位點(diǎn)的基因包括：MSLN、ATP2B2、MIR886、MIR202、MIR1228、MIR346、MIR886、MIR526A1、MIR548N、MIR654、MIR886和MIR300。其中，MSLN稱為間皮素，是一種分子量為40KDa的細(xì)胞表面糖蛋白，高表達(dá)于多種腫瘤組織中，一些研究表明，特殊信號(hào)途徑的激活在腫瘤間皮素表達(dá)增加中起重要作用[20]。ATP2B2稱為鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶B2。ATP酶能將三磷酸腺苷(ATP)催化水解為二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根離子的酶，是一個(gè)釋放能量的反應(yīng)。小鼠動(dòng)物模型中的研究支持ATP2B2的變異與聽力丟失和運(yùn)動(dòng)平衡密切相關(guān)[21]。Hu CC等[22]報(bào)道C20orf166-AS1在前列腺癌組織中具有顯著性差異表達(dá)，推測(cè)其可能是前列腺癌的特異lncRNAs。研究支持MiR-886-3p 在人骨髓細(xì)胞中下調(diào)SDF1的表達(dá)[23]。Mir346作用于RIP140蛋白的5'非轉(zhuǎn)錄區(qū)，上調(diào)RIP140蛋白的表達(dá)。受體相互作用蛋白140(receptor-interacting protein 140, RIP140)是一種轉(zhuǎn)錄輔抑制因子，其與核受體結(jié)合后能夠負(fù)向調(diào)節(jié)多種代謝組織中靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括脂肪組織、肌肉組織以及肝臟等。基因沉默RIP140后，多種代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，主要涉及糖酵解、甘油三酯合成、三羧酸循環(huán)、脂肪酸β氧化、線粒體電子傳遞以及氧化磷酸化等能量代謝過程[24]。RIP140有望成為治療代謝綜合征的候選靶點(diǎn)。He J等[25]認(rèn)為MiR300可能在調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)對(duì)輻射時(shí)參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期以及DNA損傷和修復(fù)的信號(hào)通路。

綜上，本研究支持正常對(duì)照組與GDM組中基因的甲基化位點(diǎn)和水平存在顯著差異，這可能與該基因在組織中表達(dá)的蛋白水平在兩組中的差異表達(dá)密切相關(guān)。是否甲基化的差異是導(dǎo)致相應(yīng)基因表達(dá)水平差異的原因還需要深入的研究。未來需要進(jìn)一步弄清DNA甲基化在網(wǎng)膜下脂肪中對(duì)基因表達(dá)目標(biāo)蛋白的調(diào)控作用，為妊娠糖尿病的治療和預(yù)防提供線索。

參 考 文 獻(xiàn)

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編輯：宋文穎

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【Abstract】ObjectiveIn order to investigate the pathogenesis of gestational diabetes mellitus (GDM), the differences of genes methylation patterns in omenta adipose tissues between pregnant women with GDM and the normal pregnancies were compared.These data provided the background of methylation patterns in whole genome, which could provide the clues for explaining the discrepancy of gene expression between the two study groups. Method3 cases of omenta adipose tissues in insulin untreated GDM pregnancies diagnosed by oral glucose tolerance test (OGTT) were collected. Meanwhile, the same cases of omenta adipose tissues in normal pregnancies were collected. There was no discrepancy between the two groups , including gestation age, parity and pre-pregnancy BMI. The RNAs of these tissues were extracted, and the gene methylation of these tissues were detected by Illumina Methylation BeadChipchip. The differences of gene expression profiles between GDM and normal controls were analyzed in order to find the possible disease genes. ResultsThere was discrepancy of mathylation pattern in whole genome between the two groups. 1298 genes were hypomethylated and 1570 genes were hypermethylated in GDM group. These genes were involved in many physiological functions such as: cytoskeleton conformation, cell apoptosis, ignal transduction,fat and sugar metabolism and inflammation. Futher data supported that there were different methylation patterns in three genes, PSORS1C1，PCDHB13and DKFZp686A1627. There were seven genes with different methylation patterns in the same CpG island regions, thirteen genes with diggerent methylation patterns in miRNA regions.ConclusionsThere are notable CpG methylation differences in omental adipose tissues between GDM and the normal pregnancie, which would be closely relatively with the expression difference of target genes. Whether the discrepancy of methylation pattern was the lead course of the exprssion were needed for further research. The mechanisms of gene methylation on target protein should be elucidated, which could provide the clues for prevention and treatment of GDM.

【Key words】GDM； methylation profile； genome； OVAT

DOI:10.13470/j.cnki.cjpd.2016.01.001

基金項(xiàng)目：云南省科技廳-昆明醫(yī)學(xué)院應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2012FB039)；國(guó)家自然科學(xué)基金(81360103)

*通訊作者：錢源，E-mail：yuanqian2x@hotmail.com

【中圖分類號(hào)】R714.256

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

(收稿日期：2015-07-01)