胡芷洋　 高雅 　郭輝　林琳華　任景慧　蘇放明*

(1.深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳　518020；2.深圳華大基因研究院，廣東 深圳　518083)

無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)篩查胎兒微缺失微重復(fù)綜合征陽(yáng)性病例的臨床分析

胡芷洋1高雅1郭輝2林琳華1任景慧1蘇放明1*

(1.深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳518020；2.深圳華大基因研究院，廣東 深圳518083)

【摘要】目的探索無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)(NIPT)微缺失微重復(fù)綜合征(MD)陽(yáng)性病例的產(chǎn)前診斷以及咨詢方法。方法對(duì)NIPT篩查MD陽(yáng)性的病例進(jìn)行產(chǎn)前超聲檢查、遺傳咨詢并進(jìn)行有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，送檢核型分析以及基因芯片(CMA)或者多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)檢查，驗(yàn)證NIPT的結(jié)果，同時(shí)抽取雙親血樣進(jìn)行核型分析以及MLPA。結(jié)果2015年1～5月期間送檢1191例NIPT檢查，9例MD篩查陽(yáng)性，其中3例MD篩查陽(yáng)性病例完成驗(yàn)證檢查。NIPT提示18q21.31-q23.23處23M缺失的一例病例，經(jīng)驗(yàn)證為18q22.3-q23處8.6M的微缺失；另一例NIPT提示9p24.3-9p13.2處36M重復(fù)的病例，經(jīng)驗(yàn)證除了該處有37M左右重復(fù)外，另外還有兩處5M以下的MD。1例證實(shí)為假陽(yáng)性，該假陽(yáng)性病例母親血測(cè)序發(fā)現(xiàn)有微重復(fù)。兩名證實(shí)MD病例超聲檢查均發(fā)現(xiàn)異常，孕婦選擇引產(chǎn)。假陽(yáng)性病例繼續(xù)妊娠。結(jié)論NIPT可以篩查較大片段的缺失和重復(fù)，但對(duì)較小的缺失或重復(fù)檢出能力欠佳，母體背景可以干擾結(jié)果。應(yīng)建議篩查陽(yáng)性的病例接受有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷取樣進(jìn)行驗(yàn)證。

【關(guān)鍵詞】無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查；微缺失微重復(fù)綜合征；產(chǎn)前診斷

新一代測(cè)序技術(shù)(NGS)快速發(fā)展，基于產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)(noninvasive prenatal testing, NIPT)檢測(cè)胎兒21-三體、18-三體和13-三體綜合征已成為臨床產(chǎn)前篩查的重要部分，其臨床價(jià)值受到廣泛肯定。NIPT在產(chǎn)前篩查診斷的適應(yīng)證在不斷擴(kuò)大。自從2011年新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志報(bào)道的首例應(yīng)用NIPT進(jìn)行胎兒微缺失綜合征的產(chǎn)前診斷后[1]，國(guó)內(nèi)外相繼報(bào)道多篇無(wú)創(chuàng)檢測(cè)胎兒微缺失微重復(fù)綜合征(microdeletion / microduplication syndrome, MD)的案例[2-5]。MD是指亞染色體結(jié)構(gòu)的異常，結(jié)構(gòu)正常的胎兒中約1%～1.7%攜帶有臨床意義的MD[6]。MD患者往往有智力發(fā)育障礙伴有或不伴結(jié)構(gòu)異常，如Di-George綜合征、X連鎖魚(yú)鱗病、貓叫綜合征、Angelman綜合征等。MD的發(fā)生率與孕婦年齡無(wú)關(guān)，因此在年輕孕婦中，子代發(fā)生MD的風(fēng)險(xiǎn)很可能高于發(fā)生唐氏綜合征的風(fēng)險(xiǎn)[7]。目前，對(duì)MD的產(chǎn)前診斷多局限在已有先證者的病例或者超聲檢查異常的病例，沒(méi)有生化學(xué)指標(biāo)篩查可篩查MD。雖然利用NIPT技術(shù)有可能查出子代的MD，然而在臨床處理時(shí)，醫(yī)生需要更為小心謹(jǐn)慎。

本文對(duì)本院產(chǎn)前診斷中心5個(gè)月中接診NIPT發(fā)現(xiàn)疑似MD病例的診療經(jīng)過(guò)進(jìn)行報(bào)道，并對(duì)規(guī)范臨床處理流程進(jìn)行討論。

1資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2015年1～5月因NIPT結(jié)果提示疑似染色體MD而就診于深圳市人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷門診并進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷病例。穿刺時(shí)滿16周病例進(jìn)行羊膜腔穿刺，滿23孕周的病例進(jìn)行臍帶穿刺。

1.2研究方法12孕周以上孕婦簽署同意書后抽取5ml外周血送深圳華大基因行NIPT，抽血2周后報(bào)告結(jié)果。NIPT采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)母血中游離DNA進(jìn)行低覆蓋度全基因組測(cè)序，并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)和計(jì)量效應(yīng)分析評(píng)估胎兒21-三體、18-三體、13-三體風(fēng)險(xiǎn)[8]，分析方法中包括胎兒基因拷貝數(shù)變異分析(fetal copy-number analysis through maternal plasma sequencing，F(xiàn)CAPS)的算法，用于評(píng)估胎兒染色體缺失和重復(fù)的風(fēng)險(xiǎn)[5, 9]。疑似胎兒MD病例轉(zhuǎn)至產(chǎn)前診斷門診就診，由產(chǎn)前診斷中心的超聲專家進(jìn)行三維超聲檢查。產(chǎn)前診斷醫(yī)生對(duì)孕婦解釋NIPT結(jié)果，建議進(jìn)行羊膜腔或臍帶穿刺，羊水或臍血標(biāo)本送檢染色體核型以及比較基因組微陣列(CMA，Affymetrix HD)檢查或多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)檢查。根據(jù)孕婦意愿以及NIPT報(bào)告涉及MD的位點(diǎn)選擇進(jìn)行CMA或MLPA。MLPA采用MRC-Holland的P036、P070、P095以及P245試劑盒檢測(cè)23種常見(jiàn)微缺失位點(diǎn)、各染色體亞端粒以及近著絲粒位點(diǎn)。穿刺同時(shí)抽取母血送核型以及MLPA檢測(cè)，并另外抽取母血2ml與羊水(羊膜腔穿刺病例，6ml以上)或臍血(臍帶穿刺病例，1ml)送華大基因研究院用Hiseq測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

2結(jié)果

2.1基本資料2015年1月1日至5月15日期間，深圳市人民醫(yī)院產(chǎn)科門診共送檢1191例NIPT檢測(cè)，其中9例報(bào)告提示胎兒存在疑似MD，3例疑似MD病例完成產(chǎn)前診斷以及驗(yàn)證。3例的NIPT結(jié)果中1例為微缺失(23M)，2例為重復(fù)，大小分別為36M和5M，詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)表1。截止到2015年5月15日時(shí)未在本院進(jìn)行產(chǎn)前診斷MD篩查陽(yáng)性病例中，涉及染色體分別為10號(hào)(2例)、3號(hào)、13號(hào)、15號(hào)和18號(hào)各1例。

2.2 檢測(cè)以及驗(yàn)證結(jié)果 3例MD疑似病例中，2例細(xì)胞核型檢查異常，而且CMA或MLPA結(jié)果存在MD，但片段大小以及類型與NIPT結(jié)果稍有差別。病例1羊水細(xì)胞DNA測(cè)序檢測(cè)到缺失大小為8.6M，與CMA檢測(cè)結(jié)果一致，但明顯小于NIPT檢測(cè)報(bào)告中的缺失片段；其父母核型以及MLPA未見(jiàn)異常。病例2臍血測(cè)序不僅檢測(cè)到與NIPT報(bào)告大小相近的重復(fù)，還在9q34.2q34.3和9q34.3處分別檢測(cè)到1.61M的微重復(fù)和3.28M的微缺失；父母核型以及MLPA檢查未見(jiàn)異常。1例(病例3)核型分析及測(cè)序均未見(jiàn)異常，與NIPT報(bào)告不一致；父母核型以及MLPA正常，母血測(cè)序發(fā)現(xiàn)在18p11.2p11.1處有1.2M大小微重復(fù)，詳見(jiàn)表1。

2.3妊娠結(jié)局病例1以及病例2超聲檢查均有結(jié)構(gòu)異常(表1)。病例1微缺失片段覆蓋KCNG2和PQLC1基因；病例2超聲檢查存在多個(gè)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)異常(圖1)，衍生染色體片段以及微缺失片段覆蓋DOCK8、KANK1、DMART1以及SMARCA2等數(shù)個(gè)基因區(qū)域。經(jīng)過(guò)詳細(xì)的產(chǎn)前診斷咨詢后，兩名孕婦決定終止妊娠。病例3則各項(xiàng)檢查未見(jiàn)異常，具體資料見(jiàn)表1。截止報(bào)告時(shí)，病例3仍繼續(xù)妊娠。

表1　病例資料

注：-： 未進(jìn)行檢查

圖1　病例2 的超聲檢查圖像提示胎兒鼻骨極小(上左)，眼距增寬(上中)，心臟室間隔缺損(上右)，

3討論

3.1MD與胎兒異常核型分析只能探測(cè)出8～10M以上的缺失或重復(fù)，僅有約2%～3%的多發(fā)胎兒畸形、不明原因的發(fā)育遲緩/智力障礙以及自閉癥能通過(guò)核型分析查找到原因。利用比較基因組檢查(CMA)或NGS可以檢測(cè)出片段更小的MD，12.2% 的上述異常病例可以通過(guò)CMA發(fā)現(xiàn)致病片段[10]。病例1缺失的片段位于長(zhǎng)臂末端，缺失大小8.56M，接近核型分析分辨率的下限。鑒于NIPT的報(bào)告，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室人員仔細(xì)辨認(rèn)后才發(fā)現(xiàn)18q末端的少許缺失。因此在發(fā)現(xiàn)胎兒有結(jié)構(gòu)異常時(shí)，如果僅進(jìn)行單純核型檢查極有可能漏診MD。

病例1缺失片段位于18q末端(18q22.3-q23)，超聲表現(xiàn)為單側(cè)13肋骨，雙足搖椅狀。Feenstra等[11]總結(jié)29例18q部分缺失病例的臨床表型及CMA結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)，指出18q部分缺失的表型差異性較大，共同特點(diǎn)是特征性面容、身材矮小、外耳道閉鎖、足部畸形以及智力發(fā)育遲緩，而位于18q22.3-q23處的一段4.3M片段缺失與典型18q部分缺失表現(xiàn)有關(guān)。病例1胎兒雙足的異常超聲改變可能是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的表現(xiàn)。病例2中胎兒超聲表現(xiàn)為小頭、透明隔顯示不清、短股骨、鼻骨極其短小、眼距寬、雙足過(guò)伸、單臍動(dòng)脈以及室間隔缺損，該病例中，9p以及9q兩個(gè)重復(fù)片段共達(dá)38.9M，在Decipher數(shù)據(jù)庫(kù)中均屬于病理性重復(fù)，表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、視力/聽(tīng)力障礙、小頭、足部異常、鼻梁塌陷、單臍動(dòng)脈等表現(xiàn)；此外MLPA及測(cè)序均新發(fā)現(xiàn)9q34.3存在缺失片段，該片段覆蓋SMARCA2，編碼基因表達(dá)所必需的染色質(zhì)重組復(fù)合物中的一個(gè)蛋白，表達(dá)異?？梢詫?dǎo)致Nicolaides-Baraistser 綜合征，表現(xiàn)為特殊面容(小頭、鼻梁矮塌或狹窄，鼻孔朝上，人中寬長(zhǎng))、嚴(yán)重的智力發(fā)育遲緩、語(yǔ)言障礙、暴力傾向、癲癇、身材矮小、掌骨短小而指節(jié)突出[12]。以上的特征與病例2 超聲表現(xiàn)相符合。

3.2NIPT檢測(cè)MD的技術(shù)路線自從在母血中發(fā)現(xiàn)胎兒游離DNA后，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常、甚至單基因疾病[13]都陸續(xù)成為現(xiàn)實(shí)。2011年新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志報(bào)道了首例無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒微缺失綜合征。該研究利用目標(biāo)區(qū)域測(cè)序的方法成功地鑒定出一例12p11.22和12p12.1之間4.2M的缺失[1]。此法僅適用于針對(duì)已知先證者缺失的特定部位進(jìn)行檢測(cè)。目前，主要通過(guò)以下4種方法進(jìn)行檢測(cè)：① GC校正及信息對(duì)比判定CNV，如2013年Yu等[14]利用Illumina深度全基因測(cè)序結(jié)合(locally weighted Scatterplot smoothing,LOESS)進(jìn)行GC含量校正的方法對(duì)22q11.2區(qū)域3例微缺失、2例微重復(fù)樣本進(jìn)行鑒定，分辨率達(dá)到3Mb水平[14]； ② 加深測(cè)序，如Srinivasan等[15]同樣采用Illumina全基因測(cè)序的方法對(duì)模擬血漿樣本進(jìn)行高深度測(cè)序，平均每個(gè)樣本需要約109條測(cè)序讀數(shù),通過(guò)改進(jìn)的統(tǒng)計(jì)方法，成功鑒定了一例300kb的染色體微缺失，但該方法需要較高的測(cè)序深度，成本較高；③ 滑動(dòng)窗口分析測(cè)序數(shù)據(jù)，此法可以有效減低測(cè)序深度，并有助于更準(zhǔn)確地確定CNV斷點(diǎn)位置；④ 二元分割-雙向節(jié)段調(diào)節(jié)閾值的分析法，針對(duì)N區(qū)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)檢測(cè)閾值，可以有效提高檢測(cè)準(zhǔn)確度[4]。Rampasek等[16]則通過(guò)結(jié)合上述四種模式，檢測(cè)400kb以上的MD的準(zhǔn)確度可以高達(dá)90% ，但該研究的胎兒DNA濃度高達(dá)13%。本研究中， NIPT檢測(cè)方面結(jié)合模式①+③+④，采用華大基因研發(fā)的檢測(cè)流程FCAPS，曾以低于7×106的低測(cè)序讀數(shù)，在1311例受試樣本中鑒定出4例微缺失微重復(fù)患者(9～28M)[5]。優(yōu)化數(shù)據(jù)信息處理模式是提高NIPT檢測(cè)MD準(zhǔn)確性的重要途徑。

3.3如何分析NIPT報(bào)告MD Cheung SW等[17]總結(jié)了5家NIPT公司的307例非整倍體陽(yáng)性報(bào)告病例，T21、T18、T13、X單體和性染色體三體陽(yáng)性報(bào)告中，分別有9%、23%、46%、62% 和17%的病例經(jīng)驗(yàn)證為正常核型。與檢測(cè)非整倍體一樣，NIPT檢測(cè)MD的準(zhǔn)確性也受到多個(gè)因素影響，如胎兒DNA濃度、胎兒胎盤嵌合、母體拷貝數(shù)異常等。目前普遍采用的NIPT計(jì)算模式均假設(shè)所有母親全部片段的DNA拷貝數(shù)是一致的，因此如果母體有缺失或重復(fù)時(shí)，就可能造成NIPT結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性。Snyder MW等[18]對(duì)3例T18假陽(yáng)性病例母血進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2例都有微重復(fù)[18]。本文中病例3出現(xiàn)微重復(fù)以及T18的假陽(yáng)性，也可能是由于母親自身存在微重復(fù)，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此NIPT篩查MD陽(yáng)性的病例必須進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷進(jìn)行確認(rèn)。

此外，2例確認(rèn)的MD病例中驗(yàn)證檢查的片段以及類型與NIPT報(bào)告有出入。相對(duì)小片段MD(病例1)，NIPT對(duì)于較大片段MD的具體大小判斷(病例2)比較準(zhǔn)確。病例1實(shí)際缺失大小約為8.56M， NIPT報(bào)告為23M；而病例2中9p24.3-p13.2的重復(fù)片段大小與NIPT報(bào)告相似，但其他的兩個(gè)1.6M以及3.3M的MD則未能在NIPT中測(cè)出。本案例中使用的NIPT采用的測(cè)序數(shù)據(jù)量和FCAPS算法主要是針對(duì)檢測(cè)10M以上的缺失或重復(fù)[5]，因此對(duì)于更小片段的MD，可能需要通過(guò)提高測(cè)序數(shù)據(jù)量和優(yōu)化信息分析方法。本研究中1191例NIPT檢查中，僅9例篩查陽(yáng)性，低于文獻(xiàn)中結(jié)構(gòu)正常胎兒中1%～1.7%的MD發(fā)生率[6]，不排除現(xiàn)有的NIPT方法漏診更小片段的MD可能。

利用NIPT篩查MD是可能的，但如何選擇檢測(cè)對(duì)象值得討論。如果在胎兒沒(méi)有結(jié)構(gòu)異常也沒(méi)有不良生育史、家族史的低危人群中進(jìn)行普篩，有可能增加許多不必要的侵入性產(chǎn)前診斷操作以及孕婦的焦慮。對(duì)待NIPT報(bào)告中的MD陽(yáng)性病例，必須進(jìn)行詳細(xì)的超聲檢查并建議孕婦接受侵入性產(chǎn)前診斷，進(jìn)行核型分析以及CMA檢查確診，必要時(shí)可抽取孕婦血進(jìn)行對(duì)照。

參 考 文 獻(xiàn)

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編輯：宋文穎

【Abstract】ObjectiveTo explore a clinical prenatal management for cases with a positive result of microdeletion / duplication (MD) by invasive prenatal test (NIPT). MethodInvasive prenatal diagnosis was arranged for cases with positive MD screening results after detail ultrasound fetal anomaly scan and genetic consultation. Both the fetal and parental samples were sent for karyotyping and multiplex ligation-dependent implication probe amplification (MLPA) / chromosomal microarray analysis (CMA).ResultsA total of 1191 NIPT were performed with 9 cases screened positive for MD. 2 of 3 cases which underwent testify examinations were confirmed to have MD, and two more MD were detected only by CMA in one MD case, whereas the other one was false positive. The maternal sample of the false-positive one was found to have microduplication by sequencing. The two confirmed MD cases terminated the pregnancies whereas the false positive one continued.ConclusionsNIPT can be used as a screening tool to detect MD with a relatively large fragment but its ability to detect small-sized MD is limited and can be affected by maternal background. Therefore invasive prenatal diagnosis is indicated to confirm diagnosis in positive cases.

【Key words】noninvasive prenatal testing; microdeletion / microduplication syndrome; prenatal diagnosis

DOI:10.13470/j.cnki.cjpd.2016.01.006

*通訊作者：蘇放明，E-mail：sfmlxq@163.com

【中圖分類號(hào)】R394.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

(收稿日期：2015-07-14)