田紅艷，李 笑，孫志亮，李洪利，劉雨清，尹崇高.濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濰坊 605；.濰坊醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濰坊 605；.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心，山東 濰坊 605；.濰坊醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，山東 濰坊 605

?

Gab2通過GSK-3β/Snail信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

田紅艷1，李 笑2，孫志亮2，李洪利3，劉雨清1，尹崇高4
1.濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053；
2.濰坊醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濰坊 261053；
3.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心，山東 濰坊 261053；
4.濰坊醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，山東 濰坊 261053

［摘要］背景與目的：越來越多的證據(jù)顯示，Grb2協(xié)同結(jié)合蛋白2（Grb2 binding protein-2，Gab2）與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，但Gab2與乳腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的關(guān)系尚不清楚。本研究旨在探討Gab2對(duì)乳腺癌EMT標(biāo)志物的影響，明確Gab2在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。方法：采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)80例乳腺癌組織中Gab2及EMT標(biāo)記物上皮性鈣黏著蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）的表達(dá)情況并分析其相關(guān)性，用蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測(cè)乳腺組織Gab2的表達(dá)情況，采用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)降低乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中Gab2的表達(dá)，采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子（epithelial growth factor，EGF）刺激后轉(zhuǎn)染細(xì)胞的侵襲能力變化，用Western blot檢測(cè)敲低Gab2后MDAMB-231細(xì)胞中E-cadherin及vimentin的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)p-GSK-3β的表達(dá)情況、轉(zhuǎn)錄因子Snail轉(zhuǎn)核情況。結(jié)果：Gab2在乳腺癌組織中的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.05）；乳腺癌組織中Gab2的表達(dá)量明顯高于正常乳腺組織；siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，SiGab2/MDA-MB-231細(xì)胞組中Gab2蛋白的表達(dá)量明顯降低，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染成功，劃痕實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞的侵襲能力減弱，表明Gab2影響乳腺癌細(xì)胞系的侵襲能力；敲低Gab2后，MDA-MB-231細(xì)胞中的E-cadherin的表達(dá)明顯升高，而vimentin的表達(dá)明顯降低；GSK-3β的磷酸化受到抑制，而Snail在敲低Gab2的細(xì)胞核中的表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論：Gab2可以通過GSK-3β/Snail信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌的EMT，從而促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

［關(guān)鍵詞］乳腺癌；侵襲；Grb2協(xié)同結(jié)合蛋白2；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；信號(hào)通路

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃（J12LK03，J13LK03）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410438003）；濰坊醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新基金（KX2014033）。

Correspondence to: YIN Chonggao E-mail: lihongli1213@sina.com

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞通過骨架重排，降低細(xì)胞間黏附力，向侵襲、遷移能力增強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程［1］。細(xì)胞極性消失，上皮細(xì)胞表型改變，如上皮性鈣黏著蛋白（E-cadherin）向神經(jīng)性鈣黏著蛋白（N-cadherin）轉(zhuǎn)化、波形蛋白（vimentin）增多是EMT過程中的重要變化［2］。腫瘤細(xì)胞借助EMT方式使其運(yùn)動(dòng)遷移能力增強(qiáng)，EMT是腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。

Grb2協(xié)同結(jié)合蛋白2（Grb2 binding protein-2，Gab2)是Gabs家族的重要成員，被酪氨酸磷酸化激活后接受細(xì)胞外多種因子刺激，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路，在細(xì)胞增殖、分化中起重要作用［3-4］。越來越多的研究表明，Gab2與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)［5］，但Gab2與乳腺癌EMT的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過探討Gab2對(duì)乳腺癌EMT標(biāo)志物的影響，明確Gab2在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料

收集2013年11月—2014年11月濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)切除的80例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織，并另取對(duì)應(yīng)的癌旁（大于5 cm）正常乳腺組織作為對(duì)照，其中部分存于-80 ℃冰箱保存留用，剩余做石蠟切片。所有患者的臨床資料完整，術(shù)前均未做過化療及放療，并經(jīng)病理確診?；颊吣挲g在27～74歲之間，平均51歲。

1.1.2 主要試劑

兔抗人Gab2、Snail購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，p-GSK3β抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，鼠抗人vimentin、鼠抗人E-cadherin、PV-9000通用型二步法檢測(cè)試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白濃度試劑盒、核蛋白抽提試劑盒購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。MDA-MB-231細(xì)胞由濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色

連續(xù)組織切片3張，分別滴加Gab2(1︰100）、vimentin（工作液）和E-cadherin（1︰400)抗體，并做陰性對(duì)照，其余按試劑盒說明操作。結(jié)果判定參照參考文獻(xiàn)［6］。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

G a b 2干擾質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。MDA-MB-231細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，選取三代以后對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞命名：Si Gab2/ MDA-MB-231細(xì)胞組插入Gab2目標(biāo)片段5’-GTGAGAACGATGAGAAATA-3’；Scr/MDAMB-231細(xì)胞組插入無效序列的小RNA片段。轉(zhuǎn)染步驟按LipofectamineTM2000說明書操作。

1.2.3 蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）

提取組織及轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整每孔蛋白上樣量，電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，滴加Gab2(1︰500)、E-cadherin（1︰1 000)、vimentin（1︰1 000)、p-GSK-3β（1︰1 000)、Snail(1︰500)和β-actin（1︰1 000)抗體，4 ℃過夜，二抗溫育1 h，滴加化學(xué)發(fā)光劑，曝光。結(jié)果使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

MDA-MB-231細(xì)胞接種6孔板，生長(zhǎng)到90%左右時(shí)轉(zhuǎn)染，4 h換液并用10 μL槍頭劃痕，培養(yǎng)于含有0.1%血清的1640培養(yǎng)基中，并用10 ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子（epithelial growth factor，EGF）刺激，取不同時(shí)間點(diǎn)，置于顯微鏡下拍照，應(yīng)用Image J軟件測(cè)量劃痕距離，取3次實(shí)驗(yàn)平均值。

1.2.5 核質(zhì)分離

MDA-MB-231細(xì)胞接種6孔板，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，按核質(zhì)分離試劑盒說明書操作。抽提得到的細(xì)胞核蛋白，通過Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞核內(nèi)Snail蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件處理。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)及兩變量的相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織中Gab2表達(dá)與E-cadherin、vimentin表達(dá)的相關(guān)性

Gab2陽性顯色位于細(xì)胞質(zhì)，E-cadherin陽性顯色位于細(xì)胞膜，vimentin陽性顯色位于組織、細(xì)胞間質(zhì)（圖1）。乳腺癌組織中Gab2表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與vimentin表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05，表1）。

圖1　Gab2、E-cadherin和vimentin在乳腺癌組織中的表達(dá)Fig.1 Expressions of Gab2, E-cadherin and vimentin in breast invasive ductal carcinoma tissues by immunohistochemical staining

表1　乳腺癌組織中Gab2表達(dá)與E-cadherin、vimentin表達(dá)的相關(guān)性Tab.1 Correlations of Gab2 with E-cadherin and vimentin in breast invasive ductal carcinoma tissues　(n)

2.2 Gab2在正常乳腺組織及乳腺癌組織中的表達(dá)

Western blot檢測(cè)顯示，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中Gab2的表達(dá)量高于癌旁正常組織（圖2）。

圖2　Gab2在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)Fig.2 The expressions of Gab2 in normal breast tissues and breast invasive ductal carcinoma tissues

2.3 SiGab2/MDA-MB-231細(xì)胞中Gab2、E-cadherin及vimentin表達(dá)

Western blot檢測(cè)顯示，Gab2在SiGab2/ MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)比在Scr/MDA-MB-231細(xì)胞中低，提示轉(zhuǎn)染成功。Gab2表達(dá)降低后，SiGab2/MDA-MB-231細(xì)胞較Scr/MDA-MB-231細(xì)胞，E-cadherin表達(dá)量升高，而vimentin表達(dá)量降低（圖3）。

2.4 Gab2對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲性的影響

EGF刺激后SiGab2/MDA-MB-231細(xì)胞組相對(duì)遷移距離明顯比Scr/MDA-MB-231細(xì)胞組遷移距離小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果提示Gab2降低后MDA-MB-231細(xì)胞的定向遷移能力降低（圖4）。

2.5 Gab2對(duì)p-GSK-3β、Snail的影響

為了研究Gab2促進(jìn)乳腺癌EMT發(fā)生可能的分子機(jī)制，用10 ng/mL EGF無血清培養(yǎng)基刺激各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞。Western blot檢測(cè)顯示，EGF刺激后SiGab2/MDA-MB-231細(xì)胞中GSK-3β的磷酸化降低，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail在細(xì)胞核中的表達(dá)減少。結(jié)果表明Gab2表達(dá)減少后，GSK-3β失活減少且Snail轉(zhuǎn)核減少（圖5、6）。

圖3　Gab2、E-cadherin和vimentin在SiGab2/MDA-MB-231細(xì)胞和Scr/MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 The expressions of Gab2, E-cadherin and vimentin in SiGab2/MDA-MB-231 and ScrGab2/MDA-MB-231 cells

圖4　Gab2對(duì)EGF刺激后MDA-MB-231細(xì)胞侵襲性的影響Fig.4 Influence of Gab2 on invasion of MDA-MB-231 cells induced by EGF

圖5　GSK-3β在SiGab2/MDA-MB-231細(xì)胞和ScrGab2/ MDAMB-231細(xì)胞中的磷酸化情況Fig.5 The phosphorylation of GSK-3β in SiGab2/MDA-MB-231 and ScrGab2/ MDA-MB-231cells

圖6　Snail在SiGab2/MDA-MB-231細(xì)胞和ScrGab2/ MDAMB-231細(xì)胞核中的表達(dá)Fig.6 The expression of Snail in SiGab2/MDA-MB-231 and ScrGab2/ MDA-MB-231 cell nuclei

3 討 論

近年來乳腺癌的發(fā)病率升高，并且發(fā)病年齡年輕化。隨著診斷水平的提高，乳腺癌的檢出率提高，但是許多患者確診時(shí)已發(fā)展為浸潤(rùn)癌或已有淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。乳腺癌的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移是患者復(fù)發(fā)、死亡的主要原因。

多項(xiàng)研究證明，Gab2是潛在的癌基因，在卵巢癌中存在擴(kuò)增。Gavin P老鼠在體研究發(fā)現(xiàn)，Gab2是卵巢癌的一個(gè)癌基因［7-8］。Gab2與膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)相關(guān)，Gab2表達(dá)增多，患者生存期明顯縮短，Gab2表達(dá)降低后通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲［5-9］。Matsumura等［10］發(fā)現(xiàn)，Gab2在結(jié)腸癌組織中表達(dá)增多，并與淋巴結(jié)、靜脈轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移相關(guān)。沉默Gab2基因后，乳腺癌細(xì)胞周期增殖明顯降低，凋亡增加，細(xì)胞的侵襲性減弱［11］。本實(shí)驗(yàn)免疫組化及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌癌組織中Gab2表達(dá)高于癌旁正常組織，結(jié)果表明Gab2的表達(dá)與乳腺癌的侵襲相關(guān)。

EMT可發(fā)生在胚胎發(fā)育及組織損傷修復(fù)過程中，但其在腫瘤形成及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用［12］。發(fā)生EMT改變的腫瘤細(xì)胞極性消失，細(xì)胞上皮表型改變，上皮表型分子E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)分子vimentin表達(dá)增多，是EMT的特征性改變［13-14］。EMT改變使腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。Wang等［3］證明，Gab2通過PI3K途徑促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，并且抑制E-cadherin表達(dá)促進(jìn)EMT發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中Gab2表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與vimentin表達(dá)呈正相關(guān)。降低MDA-MB-231細(xì)胞中Gab2表達(dá)后，E-cadherin表達(dá)量升高，vimentin表達(dá)量降低，并且MDA-MB-231細(xì)胞侵襲性降低。此結(jié)果說明，Gab2陽性表達(dá)的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中存在EMT的發(fā)生，同時(shí)也說明降低Gab2的表達(dá)可以減少或逆轉(zhuǎn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中EMT的發(fā)生，進(jìn)而減弱細(xì)胞的侵襲能力。

GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞中以活性狀態(tài)存在，在細(xì)胞增殖、遷移中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，p-GSK-3β在乳腺癌中表達(dá)增多，GSK-3β失活可誘導(dǎo)乳腺癌EMT發(fā)生［15］。腫瘤微環(huán)境、轉(zhuǎn)錄因子等都可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail是E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子［16］。Liu等［17］發(fā)現(xiàn)，EGF通過抑制GSK-3β的活性，使Snail轉(zhuǎn)錄增加，促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞EMT的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Gab2表達(dá)減少，使GSK-3β磷酸化降低，GSK-3β抑制了Snail轉(zhuǎn)核，并促進(jìn)E-cadherin表達(dá)，減少vimentin表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)EMT發(fā)生。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明了Gab2可以通過GSK-3β/Snail信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌EMT發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，這將為研究控制乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移提供新靶點(diǎn)。

［參 考 文 獻(xiàn)］

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Gab2 promotes epithelial-mesenchymal transition in breast cancer through GSK-3β/Snail signaling pathway

TIAN Hongyan1， LI Xiao2， SUN Zhiliang2， LI Hongli3， LIU Yuqing1, YIN Chonggao4（1.Department of Pathology， Weifang Medical University， Weifang 261053， Shandong Province， China；2.College of Biological Science and Technology， Weifang Medical University， Weifang 261053， Shandong Province， China； 3.Medicine Research Center， Weifang Medical University， Weifang 261053， Shandong Province， China； 4.College of Nursing， Weifang Medical University， Weifang 261053， Shandong Province，China)

［Key words］Breast cancer； Invasion； Grb2 binding protein-2； Epithelial-mesenchymal transition； Signaling pathway

［Abstract］Background and purpose: More and more evidence has showed that Grb2 binding protein-2 （Gab2） is associated with tumor invasion and metastasis.However， the relationship between Gab2 and epithelialmesenchymal transition （EMT） in breast cancer is not clear.The aim of this study is to investigate the effect of Gab2 on EMT markers and the mechanism of Gab2 on breast cancer invasion and metastasis.Methods: Immunohistochemicalmethods were used to detect the expressions of Gab2， E-cadherin and vimentin in 80 cases of breast cancer tissues， and the correlations between them were analyzed.Western blot was used to detect the expression of Gab2 in breast tissues.After MDA-MB-231 cells were transfected with siRNA plasmid， wound healing assay was used to detect the invasive ability of transfected cells induced by epithelial growth factor （EGF） in vitro.Then Western blot was used to analyze the protein expressions of E-cadherin， vimentin， phosphorylated GSK-3β （p-GSK-3β） and nuclear Snail.Results: Gab2 was negatively correlated with the expression of E-cadherin and positively correlated with the expression of vimentin in breast cancer tissues （P＜0.05）.The expression of Gab2 in breast cancer tissues was higher than that in normal breast tissues adjacent to breast cancer.In vitro， Gab2 expression was significantly knocked down in MDA-MB-231 cells transfected with Gab2 siRNA plasmid （SiGab2/MDA-MB-231cells）.Meanwhile， the invasive ability of SiGab2/MDAMB-231cells was decreased with EGF stimulation.The expression of E-cadherin was increased in SiGab2/MDA-MB-231cells.However， the expressions of vimentin， p-GSK-3β and nuclear Snail were decreased in SiGab2/MDA-MB-231cells.Conclusion: Gab2 can promote the invasion and metastasis of breast cancer by EMT through GSK-3β/Snail signaling pathway.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.02.003

中圖分類號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3639(2016)2-0134-06

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81402389）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2014HL077）；

通信作者：尹崇高 E-mail：lihongli1213@sina.com

收稿日期：（2015-04-29 修回日期：2015-06-08）