張江寧，丁衛(wèi)英，楊　春

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原　030006）

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發(fā)酵條件對紅曲產(chǎn)洛伐他汀的影響

張江寧，丁衛(wèi)英，楊春

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原030006）

摘要：試驗從紅曲霉固態(tài)發(fā)酵條件入手，通過選擇不同碳源和氮源，研究其對洛伐他汀產(chǎn)量的影響，最終確定以葡萄糖和蛋白胨作為輔助碳源和氮源，此時洛伐他汀產(chǎn)量最高。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵條件；紅曲霉；洛伐他汀

0　引言

紅曲在我國有著悠久的歷史，主要應(yīng)用于發(fā)酵食品、色素等方面。近年來，紅曲霉的次級代謝物洛伐他汀成為研究的熱點，它是一種膽固醇合成抑制劑，能有效地抑制膽固醇生物合成過程中關(guān)鍵酶HMG- Co還原酶的活性［1］。洛伐他汀產(chǎn)量受培養(yǎng)基［2］和培養(yǎng)條件的影響很大，在條件不適時產(chǎn)量極微，甚至不產(chǎn)生。因此，本試驗從紅曲霉固態(tài)發(fā)酵條件入手，通過選擇不同碳源和氮源，研究其對洛伐他汀產(chǎn)量的影響，為科學(xué)利用紅曲霉提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料

菌種，安卡紅曲取自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2儀器和試劑

SW- CJ- 2G型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；GMSX- 280型高壓滅菌鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；甲醇（色譜純），天津市康科德科技有限公司產(chǎn)品；95%乙醇（分析純），萊陽經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠產(chǎn)品。

洛伐他汀，配置成200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；乙醇提取液（75%）的配制為25 mL蒸餾水中加入無水乙醇75 mL，混勻；中性氧化鋁預(yù)處理柱用中性氧化鋁置于130℃烘箱中烘烤4 h，使用前稱5 g裝柱（玻璃柱），用10 mL甲醇活化。

1.3培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基采用土豆培養(yǎng)基；種子液培養(yǎng)基（g/L）為葡萄糖60 g，蛋白胨20 g，NaNO310 g，MgSO4·7H2O 5 g，KH2PO410 g，121℃滅菌20 min［3］；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：大米經(jīng)清洗，放置于水中浸泡15 h后取出，蒸煮至大米顆粒分散、微黏狀態(tài)。蒸煮后的大米置于塑料發(fā)酵培養(yǎng)瓶中，于121℃，0.1 MPa的滅菌鍋內(nèi)滅菌30 min。

1.4培養(yǎng)方法

（1）試管斜面菌種培養(yǎng)。挑取1環(huán)貯藏菌種接種于斜面培養(yǎng)基中，于31℃恒溫箱中擴大培養(yǎng)1周，置于4～5℃冰箱中貯藏備用。

（2）孢子懸液的制備。斜面種子試管加無菌生理鹽水，將孢子刮下置于三角瓶中。以轉(zhuǎn)速200 r/min在搖床上放置0.5～1.0 h，觀察孢子狀態(tài)，孢子完全活化分散開后，用無菌脫脂棉過濾孢子液，濾液即為單孢子懸液，最后將孢子稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為1× 106～1×107個/ mL。

（3）固態(tài)發(fā)酵。將三角瓶中的孢子懸液按照一定的接種量接種，于裝有50 g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL培養(yǎng)容器中，于30℃恒溫培養(yǎng)20 d［4］。

1.5洛伐他汀含量測定方法［5］

1.5.1色譜條件

色譜柱采用Phenomenex kromasil 5U 100A C18型，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動相為甲醇+水（90+ 10），流速1.0 mm/min，壓力140 Bar，波長237 nm，保留時間5～6 min，進樣體積10 μL；該方法檢出最小質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 mg/kg。

1.5.2測定步驟

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制。用洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液200mg/L逐級配制0，0.04，0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00，20.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)系列。

（2）樣品處理及測定。準(zhǔn)確稱取混勻樣品1.0 g 于25 mL容量瓶或試管中，加入乙醇提取液15 mL左右（平行做3份），超聲波提取30 min，補加提取液至刻度，收集濾液。準(zhǔn)確吸取濾液5.0 mL，通過預(yù)先活化好的中型氧化鋁小柱，用9.0 mL甲醇（3.0，3.0，3.0 mL分3次）洗脫。收集洗脫液定容10.0 mL，用高效液相色譜測定。通過被測樣品液組分與標(biāo)準(zhǔn)液保留時間對比進行定性，利用被測樣品液組分的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)液峰面積對比進行定量。

（3）結(jié)果計算。

1.6培養(yǎng)條件對洛伐他汀產(chǎn)量的影響

1.6.1碳源種類對洛伐他汀產(chǎn)量的影響

分別添加5%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油［6］、玉米粉為附加碳源，按照固態(tài)發(fā)酵方法進行固態(tài)發(fā)酵，通過1.5中的檢測方法檢測洛伐他汀的含量。

1.6.2氮源種類對洛伐他汀產(chǎn)量的影響

分別添加2%的有機氮源大豆粉［7］、蛋白胨［8］、酵母膏，以及無機氮源NaNO3［9］，NH4NO3，NH4Cl為附加氮源。

2　結(jié)論

2.1碳源種類對洛伐他汀產(chǎn)量的影響

碳源是紅曲霉生長代謝重要的物質(zhì)之一，提供菌體代謝所需要的能量，同時也是構(gòu)成菌體細(xì)胞及各種代謝產(chǎn)物的主要成分。

碳源種類對洛伐他汀產(chǎn)量的影響見圖1。

由圖1可知，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、玉米粉作為附加碳源時都能不同程度的增加，其中葡萄糖作為附加碳源時洛伐他汀的產(chǎn)量最高，達(dá)到13.6 mg/g，有顯著差異，因此葡萄糖是該菌株固態(tài)發(fā)酵的最適碳源。

2.2氮源種類對洛伐他汀產(chǎn)量的影響

圖1　碳源種類對洛伐他汀產(chǎn)量的影響

氮在微生物的生長代謝中具有重要的作用，因為氮元素是構(gòu)成微生物細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的重要成分。因此，在微生物生長過程和代謝產(chǎn)物的合成過程中，氮源也是必須的。以固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基進行發(fā)酵，檢測洛伐他汀的含量，以蛋白胨為附加氮源洛伐他汀的產(chǎn)量最高，與其他幾種氮源相比差異比較明顯。大豆粉與酵母膏之間差異不顯著，NaNO3與NH4Cl之間差異也不顯著，總體來講有機氮源洛伐他汀產(chǎn)量大于無機氮源，因此選擇影響最大的蛋白胨作為固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀的氮源。

氮源種類對洛伐他汀產(chǎn)量的影響見圖2。

圖2　氮源種類對洛伐他汀產(chǎn)量的影響

3　結(jié)論

本試驗通過對洛伐他汀固態(tài)發(fā)酵條件的分析，確定了分別以葡萄糖和蛋白胨作為發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀的輔助碳源和氮源，此外還有一些其他因素對發(fā)酵產(chǎn)物也有著不可忽視的影響。例如，接種量大小、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間，同時紅曲中的洛伐他汀含量達(dá)到較高值時，其中的毒害物質(zhì)桔霉素含量的高低也是應(yīng)關(guān)注的關(guān)鍵點，在以后的工作中有待進一步研究。

參考文獻：

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Effects of Fermentation Conditions of Monascus Lovastin Production

ZHANG Jiangning，DING Weiying，YANG Chun
（Agricaltural Products Processing Research Insitute，Shanxi Acadeing of Agricultural Science，Taiyuan，Shanxi 030006，China）

Abstract：In this experiment，the operational factors on lovastatin in yield by solid- state fermentation are studied，the result show that the optimum conditions is glucose and peptone as additive carbon source and nitrogen source.

Key words：fermentation；monascus；lovastatin

中圖分類號：TQ463

文獻標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.05.014

文章編號：1671- 9646（2016）05a- 0050- 02

收稿日期：2016- 01- 30

基金項目：山西省青年科技研究基金項目（2015021144）。

作者簡介：張江寧（1981—），女，碩士，助理研究員，研究方向為食品科學(xué)。