李志強(qiáng)，劉 穎，林 風(fēng)，吳麗云*

（福建省微生物研究所 福建省新藥（微生物）篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350007）

紅曲是用紅曲菌（Monascussp.）發(fā)酵米飯制成的一種紫紅色曲米，在我國(guó)已有超過(guò)1 000年的歷史，被廣泛應(yīng)用于食品著色，醋、酒釀造，生物催化及傳統(tǒng)中醫(yī)藥等領(lǐng)域，是極為珍貴的藥食兩用原料，具有極高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。福建省古田縣為紅曲發(fā)源地，該地所產(chǎn)紅曲最為著名[1]。紅曲產(chǎn)品種類多樣，其中以大米為原料，用純培養(yǎng)的紅曲菌發(fā)酵生成的含發(fā)酵自然產(chǎn)生的莫納可林K（又稱洛伐他?。┑壬锘钚晕镔|(zhì)的紅曲為功能紅曲[2]。20世紀(jì)70年代末，ENDO A[3]從紅曲產(chǎn)物中分離到莫納可林K，該物質(zhì)與土曲霉（Aspergillus terreus）產(chǎn)的洛伐他?。╨ovastatin，又稱為mevinolin）為同一物質(zhì)[4]，是目前臨床上廣泛應(yīng)用的降膽固醇藥物之一，用于治療高血脂。洛伐他汀是紅曲菌所產(chǎn)生的聚酮類化合物之一[5]，其通過(guò)抑制膽固醇合成關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA）還原酶的活性來(lái)阻斷膽固醇的從頭合成[4，6]。最近20多年的研究發(fā)現(xiàn)，紅曲菌在代謝中除了可產(chǎn)生洛伐他汀以外，還可產(chǎn)生色素、γ-氨基丁酸、麥角甾醇、多不飽和脂肪酸、黃酮、多酚等多種生物活性物質(zhì)，具有降血脂、降血壓、降血糖、抑菌、抗癌和提高免疫力等多種功效[7-10]。

功能紅曲是通過(guò)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的，除烘干外并未經(jīng)過(guò)其他復(fù)雜的后續(xù)處理步驟，可直接服用，存在酸式和內(nèi)酯式兩種構(gòu)型的洛伐他汀。內(nèi)酯式洛伐他汀作為前體藥物，需在人體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)樗崾铰宸ニ〔拍鼙晃詹l(fā)揮作用[4]。在肝臟中，內(nèi)酯式洛伐他汀在細(xì)胞色素P450 3A4酶的作用下被水解成酸式洛伐他汀[11]。研究表明，酸式構(gòu)型的洛伐他汀功效是內(nèi)酯式構(gòu)型的2倍[6]，但前者的穩(wěn)定性不如后者。內(nèi)酯式洛伐他汀的不良藥物反應(yīng)包括肌病和肝功能異常[12]，如果不給予治療會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重問(wèn)題。因此，酸式洛伐他汀的比例應(yīng)是衡量功能紅曲安全性能和產(chǎn)品質(zhì)量的指標(biāo)之一。我國(guó)功能紅曲產(chǎn)品及其現(xiàn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。4種標(biāo)準(zhǔn)均規(guī)定了洛伐他汀的含量，但只有《浙江省中藥炮制規(guī)范》2015年版中規(guī)定了酸式洛伐他汀的比例。

表1 我國(guó)功能紅曲產(chǎn)品及其相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Functional red koji products and related standards in China

高效液相色譜法具有高準(zhǔn)確度、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，是功能紅曲標(biāo)準(zhǔn)中洛伐他汀含量測(cè)定最常用的方法。依據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)，萃取溶劑種類有可能不同，在溶劑種類相同的情況下溶劑的濃度、萃取時(shí)間、高效液相色譜所采用的流動(dòng)相均可能存在差異，因此這些標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的洛伐他汀含量測(cè)定的方法并不完全相同。顯然，按照這些標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)同一個(gè)產(chǎn)品的洛伐他汀含量，可能會(huì)得到不同的數(shù)據(jù)，但這些數(shù)據(jù)之間的差異到底有多大并沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。本研究選取5份功能紅曲，分別按照我國(guó)現(xiàn)行的4個(gè)功能紅曲標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行洛伐他汀含量和酸式洛伐他汀比例的測(cè)定，比較4種檢測(cè)方法之間的差異，以期為功能紅曲產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供更好的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

功能紅曲樣品：自制，由本研究所“古田紅曲生產(chǎn)菌種庫(kù)”的優(yōu)良紅曲菌接種于米飯后經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制成，固態(tài)發(fā)酵條件參照文獻(xiàn)[16]。

洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)100600-201003，含量為99.4%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇和乙腈（色譜純）：德國(guó)Merck公司；磷酸（色譜純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其他試劑均為分析純，超純水用Milli-Q制備。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；XA105型電子分析天平（雙量程，d=0.01mg/0.1mg）和pH計(jì)（FE20）：梅特勒-托利多公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 功能紅曲樣品預(yù)處理

將固態(tài)發(fā)酵后經(jīng)過(guò)60℃干燥24 h的紅曲米粉碎（60目，粉狀）并充分混合均勻。分別按QB/T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》（以下簡(jiǎn)稱方法1）[2]、《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》2015年版（以下簡(jiǎn)稱方法2）[13]、《浙江省中藥炮制規(guī)范》2015年版（以下簡(jiǎn)稱方法3）[14]和《中國(guó)藥典》2015年版（以下簡(jiǎn)稱方法4）[15]等標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定精密稱取相應(yīng)質(zhì)量的紅曲粉，并按規(guī)定方法提取紅曲粉中的洛伐他汀。進(jìn)行高效液相色譜分析之前，所有樣品均經(jīng)過(guò)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行測(cè)定。

1.3.2 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品4份，每份10 mg，分別用4種方法中規(guī)定的溶劑溶解并定容至10 mL，作為儲(chǔ)備液，于-20℃避光保存，臨用前進(jìn)行系列稀釋。

定性用酸式洛伐他汀的制備參照QB/T2847—2007《功能性紅曲米（粉）》[2]，略作改動(dòng)。精密稱取內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品4 mg，以少量乙腈溶解后用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液超聲轉(zhuǎn)化60 min，放置到室溫后定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，待用。

1.3.3 高效液相色譜條件

色譜柱：反相C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫：28℃（方法1中的柱溫為25℃）；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：1 mL/min。根據(jù)保留時(shí)間定性化合物，使用外標(biāo)法根據(jù)峰面積定量。

方法1的流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸（385∶115∶0.14），方法2和方法3的流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（55∶5∶40），方法4的流動(dòng)相為甲醇-水（75∶25）。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)4種方法，分別用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇、體積分?jǐn)?shù)75%的丙酮、乙腈和甲醇稀釋1.3.2中配制的內(nèi)酯式洛伐他汀儲(chǔ)備液至質(zhì)量濃度分別為1μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、75 μg/mL、150 μg/mL、300 μg/mL的洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.3.3的條件進(jìn)行高效液相色譜分析，以洛伐他汀的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）作圖，進(jìn)樣線性回歸分析。相關(guān)系數(shù)R2＞0.999時(shí)，進(jìn)行后續(xù)樣品測(cè)定。

1.3.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為了研究4種方法中不同的提取條件對(duì)樣品提取的效果，另取自制同一批紅曲粉，精密稱量，按低、中、高濃度分別加入400 μg、800 μg、1 600 μg的內(nèi)酯式洛伐他汀，按1.3.1的方法進(jìn)行樣品的預(yù)處理后，按1.3.3的高效液相色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

功能紅曲樣品中洛伐他汀總含量為酸式和內(nèi)酯式洛伐他汀含量之和。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（standarddeviation，SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

4種方法的回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)（R2）和線性范圍見(jiàn)表2，4種方法的內(nèi)酯式洛伐他汀加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 洛伐他汀的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及洛伐他汀兩種構(gòu)型的保留時(shí)間和線性范圍Table 2 Linear regression equation and correlation coefficient of lovastatin and retention time and linear range of two configurations of lovastatin

由表2可知，內(nèi)酯式洛伐他汀在1～300 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。酸式洛伐他汀在除方法4外的其他3種方法中保留時(shí)間均穩(wěn)定，在方法1中的保留時(shí)間最長(zhǎng)；而內(nèi)酯式洛伐他汀在4種方法中的保留時(shí)間均穩(wěn)定，在方法2中的保留時(shí)間最長(zhǎng)。酸式和內(nèi)酯式洛伐他汀在方法2和方法3中的保留時(shí)間分別接近，兩者保留時(shí)間之差值＞5min。

表3 4種方法的內(nèi)酯式洛伐他汀加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery rates experiments of lactone forms of lovastatin of four methods

由表3可知，4種方法的平均加標(biāo)回收率均＞99%，表明4種方法的檢測(cè)準(zhǔn)確度較高。

2.2 《中國(guó)藥典》2015年版洛伐他汀含量測(cè)定方法存在的問(wèn)題

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定的高效液相色譜方法測(cè)定酸式洛伐他汀含量時(shí)存在兩個(gè)問(wèn)題：（1）峰形不對(duì)稱，變形嚴(yán)重；（2）保留時(shí)間漂移幅度很大，導(dǎo)致酸式洛伐他汀和樣品中其他成分的峰有可能沒(méi)有完全分開(kāi)，這會(huì)直接影響到酸式洛伐他汀檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。由圖1（B）可知，5個(gè)樣品的酸式洛伐他汀保留時(shí)間的變動(dòng)已經(jīng)超出正常范圍，而內(nèi)酯式洛伐他汀的保留時(shí)間正常、峰形對(duì)稱。作者曾嘗試過(guò)更換多種品牌和型號(hào)的色譜柱，但并不能穩(wěn)定酸式洛伐他汀的保留時(shí)間，改善其峰形。因此在方法4中只給出了內(nèi)酯式洛伐他汀含量，其他數(shù)據(jù)并沒(méi)有提供。

圖1 酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品(A)和5個(gè)樣品(B)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of acid forms of lovastatin standard(A)and five samples(B)

2.3 4種方法的檢測(cè)結(jié)果

1號(hào)樣品采用4種方法的高效液相色譜圖見(jiàn)圖2（其他4個(gè)樣品的高效液相色譜圖與1號(hào)樣品類似，因此未予列出）。由圖2可知，在方法1、方法2和方法3中酸式洛伐他汀和內(nèi)酯式洛伐他汀與相鄰色譜峰的分離度均＞1.5，能滿足樣品檢測(cè)的要求。酸式洛伐他汀和內(nèi)酯式洛伐他汀均能在20 min內(nèi)出峰，所用的分析時(shí)間較短，能滿足樣品快速分析的要求。方法1所采用的流動(dòng)相使酸式洛伐他汀和內(nèi)酯式洛伐他汀的色譜峰相鄰，但能完全分開(kāi)（分離度＞1.5）；方法2和方法3所采用的流動(dòng)相使酸式洛伐他汀和內(nèi)酯式洛伐他汀的色譜峰相距較遠(yuǎn)，分離度較高。

5個(gè)紅曲樣品分別采用4種方法進(jìn)行洛伐他汀兩種構(gòu)型的含量及比例的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，5個(gè)樣品洛伐他汀總含量測(cè)定值的范圍為2.45～15.55 mg/g，酸式洛伐他汀比例的測(cè)定值范圍為47.53%～86.43%。同一個(gè)樣品洛伐他汀總含量根據(jù)所采用的方法不同會(huì)有較大差異，但5個(gè)樣品洛伐他汀總含量的測(cè)定值均表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，方法2＞方法3＞方法1（表4和表5）。同一份樣品采用不同方法測(cè)定的酸式洛伐他汀的比例較接近，如樣品1中酸式洛伐他汀的比例分別為64.91%（方法1）、66.33%（方法2）、66.87%（方法3）。

圖2 不同方法測(cè)定1號(hào)樣品中的洛伐他汀高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of lovastatin contents in sample 1 by different methods

表4 5個(gè)紅曲樣品的洛伐他汀總含量和酸式洛伐他汀的比例（n=3）Table 4 Total lovastatin contents and the proportions of acid forms of lovastatin of five samples（n=3）

表5 不同方法測(cè)定的5個(gè)紅曲樣品中洛伐他汀總含量的相對(duì)比例Table 5 Relative proportions of total lovastatin contents of five red kojic samples with different methods

分別以方法2測(cè)定的5個(gè)樣品的洛伐他汀總含量為參考值，計(jì)算方法1和3測(cè)定的樣品中洛伐他汀總含量相對(duì)于方法2測(cè)定結(jié)果的相對(duì)比例，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，同一樣品采用不同方法測(cè)定的結(jié)果有差異，其中測(cè)得洛伐他汀總含量為方法2＞方法3＞方法1。

3 結(jié)論

用《中國(guó)藥典》2015年版中的高效液相色譜方法進(jìn)行洛伐他汀含量測(cè)定時(shí)，其酸式構(gòu)型保留時(shí)間異常、峰形不對(duì)稱，導(dǎo)致其含量測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確，重復(fù)性不好；而內(nèi)酯式構(gòu)型的含量測(cè)定則不存在以上問(wèn)題。

方法1中酸式和內(nèi)酯式洛伐他汀的出峰時(shí)間均避免了溶劑和雜質(zhì)峰的干擾，但兩者的出峰時(shí)間很近。在實(shí)際樣品檢測(cè)中，由于功能紅曲樣品成分多樣、系統(tǒng)輕微波動(dòng)等因素的影響，可能會(huì)使色譜峰發(fā)生拖尾或前沿現(xiàn)象，兩峰有可能無(wú)法完全分開(kāi)。而方法2和方法3中內(nèi)酯式洛伐他汀的出峰時(shí)間得到明顯延長(zhǎng)，從而與酸式洛伐他汀得到很好的分離，兩者的出峰時(shí)間同樣避免了溶劑和雜質(zhì)峰的干擾。

采用不同的方法（主要是洛伐他汀的提取條件和高效液相色譜條件），對(duì)同一份樣品的檢測(cè)結(jié)果有較大差異，采用方法2測(cè)定的洛伐他汀總含量最高。同一份樣品，采用3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的酸式洛伐他汀的比例很接近。從樣品提取方法來(lái)看，方法1、方法2和方法3中的樣品提取簡(jiǎn)便快捷，而方法4中樣品提取相對(duì)復(fù)雜繁瑣，可能會(huì)導(dǎo)致提取效率偏低。由于溶劑不可能從紅曲粉中把洛伐他汀萃取完全，4種方法洛伐他汀含量測(cè)定值之間的差異可能主要是受萃取溶劑提取效率的影響，有可能方法2提取率相對(duì)最高。綜合以上分析，在4種方法中《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》2015年版相對(duì)最好，但其他方法也不能完全否認(rèn)。功能紅曲中的洛伐他汀同時(shí)具有酸式和內(nèi)酯式兩種構(gòu)型，建議未規(guī)定酸式洛伐他汀比例的標(biāo)準(zhǔn)可在今后的標(biāo)準(zhǔn)修訂中對(duì)酸式洛伐他汀比例的檢測(cè)進(jìn)行規(guī)定。

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