胡 芃,鄭 藝,趙于飛*,吳愛林,毛云飛,常 娜

(1 中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院西區(qū)腫瘤放射治療科,合肥 230001;2 安徽省腫瘤醫(yī)院腫瘤放射治療科;*通訊作者,E-mail:672827431@qq.com)

肺癌是發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤,然而多數化療藥物都具有不可忽略的毒副作用,因此尋求低毒高效的治療藥物迫在眉睫。老藥新用,開發(fā)已上市藥物新的適應證可以節(jié)省藥物研發(fā)的成本和時間,也可以保證藥物的低毒性,因此是開發(fā)低毒高效腫瘤治療藥物的可靠途徑。他汀類藥物是臨床上廣泛應用的一線降脂藥物,通過抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMGCR)從而抑制下游膽固醇的合成。有研究顯示他汀具有抗腫瘤活性[1-3],但對肺癌的作用及機制研究并不十分明確。Hippo信號通路是負責調節(jié)組織器官大小的信號通路,在進化上高度保守,其下游核心蛋白分子為YAP和TAZ兩個輔助轉錄因子,YAP和TAZ可以入核,與TEAD轉錄因子結合形成復合物,促進靶基因的轉錄[4]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是個十分復雜的過程,TAZ被證實參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展,抑制YAP/TAZ能夠抑制肺癌細胞的增殖和轉移[5,6]。本研究以A549肺癌細胞為研究對象,考察洛伐他汀對A549肺癌細胞的增殖及凋亡的影響,并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 洛伐他汀購于美國MedChemExpress(HY-N0504)。RPMI-1640含雙抗(100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)基購于江蘇凱基生物技術股份有限公司。RIPA裂解液(P0013C)、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于南京碧云天生物技術有限公司。總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、細胞凋亡試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司。ECL發(fā)光液購于上海天能科技有限公司。mTOR、AKT、Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9、PARP、cleaved PARP、GAPDH抗體、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG購于武漢Proteintech。p-mTOR(Ser2448)、p-AKT(Ser473)、p70S6k、p-p70S6k(Ser371)、TAZ抗體購于美國CST。

1.1.2 細胞株 A549肺癌細胞株,購買于上海中科院細胞庫。

1.1.3 儀器 血球計數儀,Corning公司(美國);酶標儀,BioTek公司(美國);臺式高速冷凍離心機,Thermo公司(美國);微型離心機,Corning公司(美國);CytoFLEX流式細胞儀,Beckman Coulter公司(美國);電泳儀,Bio-Rad公司(美國);MicroChemi化學發(fā)光型凝膠成像系統,Azure公司(美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) A549肺癌細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,孵箱培養(yǎng)條件:37 ℃,5% CO2。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖 A549肺癌細胞生長至適宜密度時,消化、離心,新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后采用血球計數儀計數,將A549肺癌細胞均勻鋪于96孔板中,每孔約為1 000個細胞,次日,細胞貼壁后給與不同濃度洛伐他汀(20,40,80 μmol/L),每組6個復孔,置于孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h(時間依賴性實驗則加入40 μmol/L洛伐他汀,培養(yǎng)12,24,48 h),實驗結束前4 h加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT,4 h后吸走96孔板中液體,加入120-180 μl DMSO,輕輕搖晃細胞培養(yǎng)板,使底部結晶充分溶解后490 nm波長處測定其光吸收值,根據光吸收值換算出抑制率。

1.2.3 細胞凋亡檢測 A549肺癌細胞生長至適宜密度時,消化、離心,新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后采用血球計數儀計數,取約2×106個細胞均勻鋪于6孔板中,次日,加入不同濃度的洛伐他汀(20,40,80 μmol/L)處理24 h,收集培養(yǎng)基上清并1 000 r/min離心5 min沉淀上清中的細胞,消化貼壁細胞后500 r/min離心5 min后PBS重懸并合并細胞,用PBS洗滌2次后加入500 μl Binding Buffer、5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI,避光孵育5 min后,采用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達 A549肺癌細胞生長至適宜密度時,消化、離心,新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后采用血球計數儀計數,每孔取約2×106個細胞接種于6孔板,包括對照組和3個不同濃度洛伐他汀(20,40,80 μmol/L)處理組。洛伐他汀處理A549肺癌細胞24 h后,收集細胞樣本,12 000g離心15 min后吸取上清置于另外干凈1.5 ml離心管中,加入1/4體積5×loading buffer,混勻后100 ℃處理5-10 min,置于-20 ℃?zhèn)溆?。考察TAZ在洛伐他汀抗A549細胞增殖中的作用時,預先轉染TAZ質粒,48 h后加入40 μmol/L洛伐他汀繼續(xù)處理24 h后收取蛋白樣品,12 000g離心15 min后吸取上清置于另外干凈1.5 ml離心管中,加入1/4體積5×loading buffer,混勻后100 ℃處理5-10 min,置于-20 ℃?zhèn)溆?。制備SDS-PAGE凝膠,根據待檢測蛋白的分子量和SDS-PAGE凝膠的最佳分子范圍選擇配制適合濃度的SDS-PAGE凝膠,cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9采用12%的凝膠,mTOR、p-mTOR采用6%的凝膠,其余蛋白采用10%的凝膠。電泳采用兩步法,Step 1電壓80 V,40 min,Step 2電壓120 V,60 min。濕轉,根據待檢測蛋白的分子量決定濕轉時間,濕轉電壓維持在80 V以上;5%脫脂奶粉或5% BSA室溫封閉1-2 h;一抗4 ℃孵育過夜;二抗室溫孵育1 h;ECL發(fā)光液顯影。

1.2.5 TAZ質粒和轉染 TAZ過表達質粒為pBabe puro-mTAZ plasmid(Addgene plasmid#31791)。A549肺癌細胞生長至適宜密度時,消化、離心,新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后采用血球計數儀計數,每孔取數量約2×106個細胞均勻鋪于6孔板中,次日待細胞貼壁后,用Opti-MEM培養(yǎng)基預混1 μg對照質?；騎AZ過表達質粒和2 μl Lipo 3000后加入培養(yǎng)板中處理6-8 h,更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細胞RNA和蛋白樣品,采用qRT-PCR和Western blot分別在mRNA和蛋白水平驗證TAZ的表達?？疾霻AZ在洛伐他汀抗A549細胞增殖和誘導A549凋亡中的作用時,A549細胞預先轉染TAZ過表達質粒,48 h后給于洛伐他汀進行干預。

1.2.6 qRT-PCR 總RNA提取:不同濃度的洛伐他汀(20,40,80 μmol/L)處理A549細胞24 h后,采用RNA提取試劑盒提取總的RNA。RT-PCR:采用逆轉錄試劑盒對總RNA進行逆轉錄處理,逆轉錄程序為42 ℃ 2 min,85 ℃ 5 min,4 ℃保存。qRT-PCR:95 ℃ 2 min;94 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,68 ℃ 30 s進行40個循環(huán);65-95 ℃制備溶解曲線。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.3 數據統計學分析

2 結果

2.1 洛伐他汀抑制A549肺癌細胞的增殖

20,40,80 μmol/L的洛伐他汀處理A549細胞24 h,MTT實驗結果顯示,隨著洛伐他汀濃度的增加,A549肺癌細胞的存活率逐漸降低,40 μmol/L洛伐他汀組與20 μmol/L洛伐他汀組相比,A549肺癌細胞的存活率降低(P<0.05),80 μmol/L洛伐他汀組與40 μmol/L洛伐他汀組相比,A549肺癌細胞的存活率顯著降低(P<0.05),80 μmol/L洛伐他汀組與20 μmol/L洛伐他汀組相比,A549肺癌細胞的存活率顯著降低(P<0.05,見圖1)。40 μmol/L洛伐他汀處理A549細胞12,24,48 h,隨著作用時間的增加,A549細胞的存活率逐漸降低,24 h組與12 h組相比,A549肺癌細胞的存活率降低(P<0.05);48 h組與24 h組相比,A549肺癌細胞的存活率顯著降低(P<0.05);48 h組與12 h組相比,A549肺癌細胞的存活率顯著降低(P<0.05,見圖1)。以上結果表明洛伐他汀可以濃度依賴性和時間依賴性地抑制A549肺癌細胞的增殖。

2.2 洛伐他汀抑制mTOR信號通路

mTOR信號通路負責調控細胞的增殖,采用Western blot考察洛伐他汀對mTOR信號通路的影響,Western blot結果顯示,隨著洛伐他汀濃度的增加,p-AKT,p-mTOR和p-p70S6k的表達逐漸降低(P<0.05,見圖2)。該結果從分子水平證實了洛伐他汀對A549細胞的增殖抑制作用。

圖1 洛伐他汀抑制A549細胞的增殖Figure 1 Lovastatin inhibits the proliferation of A549 cells

與0 μmol/L相比,* P <0.05圖2 洛伐他汀抑制mTOR信號通路Figure 2 Lovastatin inhibits mTOR signaling pathway in A549 cells

2.3 洛伐他汀誘導A549肺癌細胞凋亡

細胞流式檢測結果顯示,隨著洛伐他汀濃度的增加,A549細胞的凋亡率不斷增加,0,20,40,80 μmol/L洛伐他汀處理后細胞凋亡率依次為(10.21±1.45)%,(22.29±4.31)%,(57.27±4.56)%,(62.58±3.43)%。與0 μmol/L組相比差異均具有統計學意義(P<0.05,見圖3)。表明洛伐他汀可以誘導A549細胞發(fā)生凋亡。

圖3 洛伐他汀誘導A549細胞發(fā)生凋亡Figure 3 Lovastatin induces apoptosis of A549 cells

2.4 洛伐他汀增加Caspase-3、Caspase-9、PARP的剪切

采用Western blot考察洛伐他汀對A549細胞凋亡標記物Caspase-9、Caspase-3和PARP剪切的影響,結果見圖4。隨著洛伐他汀濃度的增加,Caspase-9、Caspase-3和PARP剪切,即cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved PARP的表達增加(P<0.05)。該結果在分子水平證實了洛伐他汀誘導了A549細胞發(fā)生凋亡。

與0 μmol/L相比,* P <0.05圖4 洛伐他汀促進Caspase-9、Caspase-3和PARP的剪切Figure 4 Lovastatin increased the cleavage of Caspase-9, Caspase-3 and PARP

2.5 洛伐他汀抑制A549肺癌細胞中TAZ的表達

Western blot結果發(fā)現,隨著洛伐他汀濃度的增加,A549細胞中TAZ的表達逐漸減少(P<0.05),與0 μmol/L比較差異具有統計學意義(P<0.05,見圖5),該結果表明洛伐他汀可以濃度依賴性地抑制A549細胞中TAZ的表達。

與0 μmol/L相比,* P <0.05圖5 洛伐他汀抑制TAZ的表達Figure 5 Lovastatin inhibits TAZ expression in A549 cells

2.6 過表達TAZ減弱了洛伐他汀對A549細胞的增殖抑制作用

采用TAZ過表達質粒在A549細胞中過表達TAZ,結果TAZ在mRNA水平和蛋白水平的表達均顯著上調(P<0.05,見圖6)。流式結果顯示,過表達TAZ后,洛伐他汀對A549細胞的凋亡誘導作用明顯減弱,單獨洛伐他汀(40 μmol/L)組的凋亡率為(53.56±3.87)%,洛伐他汀(40 μmol/L)聯合TAZ過表達組的凋亡率為(12.11±2.58)%,兩組間差異具有統計學意義(P<0.05,見圖7)。單獨洛伐他汀(40 μmol/L)組的增殖抑制率為(51.43±4.82)%,洛伐他汀(40 μmol/L)聯合TAZ過表達組的增殖抑制率為(9.35±3.55)%,洛伐他汀對A549細胞增殖抑制作用被明顯逆轉,差異具有統計學意義(P<0.05)。這些結果證明TAZ介導了洛伐他汀對A549細胞的凋亡誘導作用和增殖抑制作用。

與對照組比較,* P <0.05圖6 TAZ過表達效率驗證Figure 6 The efficiency of TAZ overexpression in A549 cells

圖7 過表達TAZ逆轉了洛伐他汀對A549細胞的凋亡誘導作用和增殖抑制作用Figure 7 TAZ overexpression reverses pro-apoptosis effect and anti-proliferative effect of lovastatin in A549 cells

3 討論

他汀類藥物是臨床上最為常見的降膽固醇藥物,其作用機制是通過競爭性抑制HMG-CoA還原酶的活性抑制甲羥戊酸的生成從而抑制下游膽固醇的合成。除了抑制膽固醇的合成之外,他汀類藥物也具有抗腫瘤活性。本研究證實了洛伐他汀對肺癌A549細胞增殖的增殖作用和凋亡誘導作用,機制研究提示TAZ可能在洛伐他汀抗A549增殖中發(fā)揮重要作用。

研究結果表明,洛伐他汀誘導A549細胞發(fā)生凋亡,凋亡是細胞為維持內環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的自主有序的死亡。通常表型為核濃縮、起皺、膜發(fā)泡以及DNA片段化,可由兩種途徑介導:一是TNF-α介導的死亡受體途徑,又稱外源性途徑;二是線粒體途徑,又稱內源性途徑[7]。Caspase-9的剪切增加是線粒體途徑激活的標志之一,由此可以判定,洛伐他汀通過激活了線粒體途徑誘導A549細胞凋亡。

他汀作為降膽固醇藥物通過競爭性抑制HMG-CoA還原酶的活性抑制膽固醇合成的同時,也抑制了甲羥戊酸通路中其他中間代謝產物的合成,從而抑制異戊烯的合成,從而影響到蛋白的異戊烯化,抑制小G蛋白(small GTPase)的生理功能[8-10]。因此可推測,洛伐他汀可能通過抑制了某小G蛋白的生理活性從而影響到Hippo信號通路。TAZ是Hippo信號通路下游的核心成員,TAZ能夠入核與TEAD家族轉錄因子結合形成轉錄因子復合物啟動靶基因的轉錄[11,12]。TAZ可受上游Hippo信號通路中LATS1/2的磷酸化導致TAZ無法進入細胞核,使TAZ滯留在胞質中從而被降解[13]。有研究表明,TAZ能夠調控細胞的增殖和凋亡[14,15],本研究發(fā)現洛伐他汀在抑制A549細胞增殖,誘導A549細胞發(fā)生凋亡的同時促進了TAZ的降解,由此可推斷,洛伐他汀可能通過了下調TAZ誘導A549細胞發(fā)生凋亡,抑制其增殖。此外,他汀類藥物作為臨床上的常用藥物,或許可以免去新藥研發(fā)中的眾多臨床前實驗步驟,這種“老藥新用”的模式對于藥物的開發(fā)具有積極的意義。

綜上所述,本研究證實了洛伐他汀對A549肺癌細胞的增殖抑制作用,并對其機制做了初步探討,為他汀類藥物在臨床上應用于肺癌的治療提供了理論依據。