韓道賓駱詩(shī)露黃健朱杰華陳澤慧閔迅

（1. 遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，遵義 563000；2. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，遵義 563000）

肺炎鏈球菌TCSs中WalR的克隆表達(dá)、保守性及抗原表位分析

韓道賓1駱詩(shī)露1黃健2朱杰華2陳澤慧2閔迅1

（1. 遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，遵義 563000；2. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，遵義 563000）

通過(guò)構(gòu)建PET28a-WalR表達(dá)載體并在大腸桿菌BL21中表達(dá)WalR重組蛋白，以評(píng)價(jià)其對(duì)C57小鼠的免疫原性；并分析其在不同血清型肺炎鏈球菌中的保守性和B細(xì)胞的抗原表位。以肺炎鏈球菌D39血清型WalR基因?yàn)槟０?，?gòu)建重組質(zhì)粒PET28a-WalR并轉(zhuǎn)入BL21誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白質(zhì)。采用ClustalX 2.1軟件對(duì)WalR蛋白在不同血清型S.pn中的保守性進(jìn)行分析；利用DNASTAR軟件對(duì)其B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建PET28a-WalR重組表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后有大量高純度的目的蛋白質(zhì)，但其主要以包涵體形式存在；WalR蛋白在不同血清型肺炎鏈球菌中高達(dá)99.4%，其B細(xì)胞抗原表位可能位于9-16、35-42、95-111、113-135、150-161、200-218等氨基酸序列位點(diǎn)。成功獲得大量以包涵體形式表達(dá)的肺炎鏈球菌WalR重組蛋白，并對(duì)其保守性和抗原表位進(jìn)行了系統(tǒng)分析。

肺炎鏈球菌；WalR；重組蛋白；保守性；抗原性

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia，S.pn）又稱(chēng)為肺炎（雙）球菌，主要引起兒童和成年人肺炎、敗血癥、腦膜炎等疾病，也是導(dǎo)致流行性中耳炎的唯一病原體［1，2］。由于青霉素等抗生素的大量使用，s.pn的耐藥性逐年走高。臨床上廣泛出現(xiàn)了多重耐藥的S.pn菌株，甚至耐萬(wàn)古霉素的S.p n菌株［3］。因此，通過(guò)研發(fā)免疫原性強(qiáng)、保守性高、價(jià) 格低廉的S.pn蛋白質(zhì)疫苗，是解決S.pn耐藥問(wèn)題的關(guān)鍵［4，5］。

雙組分系統(tǒng)（two-component systems，TCSs）是革蘭陽(yáng)性菌特有的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，是S.pn通過(guò)感受外界環(huán)境變化、生長(zhǎng)繁殖和維持自身存活的重要感應(yīng)系統(tǒng)［6，7］。組氨酸蛋白激酶（Histidine kinase，HK/WalK）及其受體（Response regulator，RR/WalR）是S.pn TCS中的一對(duì)調(diào)節(jié)蛋白，其在細(xì)胞的能量信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上起著至關(guān)重要的作用［8］。WalR主要通過(guò)磷酸化和去磷酸化使信號(hào)逐級(jí)放大，從而引起細(xì)胞能量代謝反應(yīng)。研究證實(shí)，這些信號(hào)的傳遞往往與 細(xì)菌的耐藥性和致病性密切相關(guān)，也與其生物膜的形成存在一定的關(guān)系［9］。因此，以WalR為蛋白質(zhì)疫苗作用靶點(diǎn)的相關(guān)研究可能具有重要價(jià)值。本研究擬通過(guò)蛋白重組技術(shù)獲得高純度的WalR目的蛋白以觀察其保護(hù)效應(yīng)，并探討其在不同血清型S.pn中的保守性，以期為后續(xù)蛋白疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 肺炎鏈球菌NCTC7466（D39）標(biāo)準(zhǔn)菌株。大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）菌株，原核表達(dá)質(zhì)粒PET28a為本課題組保存。

1.1.2 試劑 基因組DNA提取試劑盒（北京天根公司），DNA片段純化試劑盒（TaKaRa），質(zhì)粒提取試劑盒（美國(guó)Omega公司），限制性?xún)?nèi)切酶 BamHⅠ、XholⅠ（TaKaRa），PrimerStar高保真DNA聚合酶、DNA marker、T4DNA連接酶（TaKaRa），異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素、LB培養(yǎng)基（上海生工）。

1.2 方法

1.2.1 高保真PCR獲取目的基因 用基因組提取試劑盒對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)后的S.pn菌株D39進(jìn)行基因組DNA提取，在NCBI基因庫(kù)中查找WalR目的基因（705 bp）并且用Primer premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，引物如下：

上游引物：CGGGATCC ATGAAAAAAATACTAATTGTAG，

下游引物：CCGCTCGAG TCAAGCATTATTTCTCATGT。

PCR擴(kuò)增體系：反應(yīng)體系為50 μL：ddH2O 32 μL、5×PS Buffer 10 μL、dNTP Mixture 4 μL、肺炎鏈球菌模板DNA 1.5 μL、上游引物F和下游引物R各1 μL、Prime Star酶0.5 μL。反應(yīng)條件98℃ 20 s，54℃ 15 s，72℃ 43 s，30 cycles，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用DNA純化試劑盒純化后測(cè)得濃度儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PET28a-WalR重組質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選 將PET28a質(zhì)粒和目的基因同時(shí)用BamHⅠ、XholⅠ雙酶切，酶切后純化并且用T4DNA連接酶連接。連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，并且接種于LB培養(yǎng)基平板（含50 μg/mL卡那霉素）。過(guò)夜后挑取單個(gè)菌落增菌進(jìn)行菌液PCR，對(duì)PCR陽(yáng)性的菌液增菌提取重組質(zhì)粒行雙酶切鑒定。

1.2.3 重組WalR蛋白的表達(dá) 將上一步篩選得到的重組質(zhì)粒PET28a-WalR轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單個(gè)菌落增菌并且進(jìn)行陽(yáng)性鑒定，將陽(yáng)性菌接種到LB培養(yǎng)基中（含50 μg/mL卡那霉素）培養(yǎng)，37℃監(jiān)測(cè)光密度A600=0.4-0.6時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，12℃誘導(dǎo)12 h后9 000×g離心3 min收集細(xì)菌，重懸細(xì)菌后用超聲破菌儀破菌，12 000×g離心30 min后行SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)形式。

1.2.4 B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) 用DNASTAR Lasergene v7.1軟 件 結(jié) 合ameson-Wolf法、Emini法、Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法，分別對(duì)WalR蛋白抗原指數(shù)、表面可能性、親水性、可塑性進(jìn)行分析來(lái)分析WalR蛋白B細(xì)胞抗原表位。

1.25 保守性分析 從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取不同型別肺炎鏈球菌的WalR蛋白氨基酸序列，用ClustalX 2.1軟件分析對(duì)WalR蛋白的序列保守性。

2 結(jié)果

2.1 WalR基因擴(kuò)增

肺炎鏈球菌D39全基因組DNA為模板擴(kuò)增目的片段，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析（圖1-A），可見(jiàn)大小約為705 bp的目的條帶，與預(yù)期值相符。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將擴(kuò)增的目的基因片段與表達(dá)載體PET-28a連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，菌液PCR鑒定如圖1-B所示。對(duì)陽(yáng)性菌提取重組質(zhì)粒雙酶切鑒定如圖1-C所示。

圖1 目的基因的擴(kuò)增（A），重組質(zhì)粒菌液PCR（B）與重組質(zhì)粒雙酶切鑒定（C）

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）后挑取菌落誘導(dǎo)表達(dá)，在經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的菌中看到一條明顯的條帶，分子量約為32 kD大小，即等于26 kD大小的WalR蛋白與6 kD大小的PET28a標(biāo)簽蛋白的分子量之和，與預(yù)期相符。WalR蛋白主要集中在破菌液離心后的沉淀中（圖2），即蛋白主要是以包涵體形式存在。

圖2 WalR重組蛋白表達(dá)SDS-PAGE鑒定圖

2.4 WalR蛋白保守性分析

從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得不同型別肺炎鏈球菌WalR蛋白氨基酸序列：SP SMRU1009（登錄號(hào)：COO32846.1）、SP S-019（登錄號(hào)：CMX77473.1）、SP 208_80（登錄號(hào)：CKH25805.1）、SP 0311（登錄號(hào)：CKI97140.1）、SP 14（登錄號(hào)：CRH98180.1）、SP 28F（登錄號(hào)：CRH96017.1），對(duì)以上氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果（圖3）顯示W(wǎng)alR蛋白在不同型別菌株間保守性達(dá)99.4%。

2.5 B細(xì)胞抗原表位分析

從圖4可看出，以親水性、可塑性、抗原指數(shù)以及表面可能性4種方法預(yù)測(cè)的WalR蛋白B細(xì)胞抗原表位位置比較接近，綜合得到的結(jié)果顯示其較可能成為B細(xì)胞抗原表位的氨基酸區(qū)段為9-16、35-42、95-111、113-135、150-161、200-218。

3 討論

肺炎鏈球菌疫苗的研發(fā)對(duì)于減緩肺炎鏈球菌的耐藥具有不可或缺的作用，其發(fā)展共經(jīng)歷了3代［10］，第1代為23價(jià)多糖疫苗，第2代為7價(jià)結(jié)合疫苗，第 3代為蛋白質(zhì)疫苗。蛋白疫苗的研發(fā)已經(jīng)取得重要進(jìn)展，研究證實(shí)，對(duì)鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer）重組外膜蛋白（OmpA）對(duì)家禽具有顯著的保護(hù)效果［11］。肺炎鏈球菌谷氨酰胺tRNA合成酶（glutamyl tRNA syn-thetase，Gts）作為肺炎鏈球菌疫苗候選蛋白質(zhì)，其保護(hù)效果也在BALB /c 小鼠體內(nèi)得到了驗(yàn)證［12］。有關(guān)肺炎鏈球菌蛋白疫苗Audouy［13］等已在人體中用單一重組PspA變體進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)此疫苗能誘導(dǎo)針對(duì)異源PspA分子的廣譜交叉反應(yīng)抗體，產(chǎn)生的抗體可以保護(hù)小鼠抵抗腹腔注射S.pn的攻擊。Intercell公司的S.Pn三聯(lián)蛋白疫苗已進(jìn)入了Ⅱ期臨床試驗(yàn)，目前還沒(méi)有上市的S.pn蛋白疫苗。

圖3 不同型別肺炎鏈球菌WalR蛋白保守性分析

圖4 WalR蛋白B細(xì)胞抗原表位分析

雙組分系統(tǒng)（TCSs）中蛋白調(diào)節(jié)對(duì)WalK/R在低GC含量的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中具有維持細(xì)胞壁及表面穩(wěn)態(tài)的雙重作用［14，15］。研究證實(shí)，在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）RN4220血清型中通過(guò)基因沉默低表達(dá)WalR蛋白質(zhì)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)于外界水解抵抗能力降低［16］。低表達(dá)WalR蛋白使得細(xì)菌產(chǎn)生侵襲性酶的量減少，細(xì)菌的自我保護(hù)機(jī)制減弱，從而就容易被殺滅。WalR蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)代謝中的重要地位為其成為肺炎鏈球菌候選疫苗提供了保障和支持。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)ClustalX 2.1軟件對(duì)WalR的保守性進(jìn)行了分析，從它的保守性來(lái)看在不同的型別的肺炎鏈球菌中WalR的保守程度高達(dá)99.4%，這一點(diǎn)為后期的WalR蛋白疫苗制備奠定了基礎(chǔ)，使得WalR蛋白疫苗可以產(chǎn)生廣泛的保護(hù)效果（針對(duì)更多的肺炎鏈球菌血清型）。對(duì)其B細(xì)胞抗原表位分析顯示在氨基酸序列 9-16、35-42、95-111、113-135、150-16 1、200-218可能成為抗原表位。這些抗原表位為后期抗原表位鑒定提供了依據(jù)。實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建重組表達(dá)載體并且在大腸桿菌中表達(dá)出WalR蛋白，受翻譯速率、折疊速率等因素影響蛋白大部分以包涵體的形式存在，上清中蛋白量很少，課題組通過(guò)摸索不同溫度、轉(zhuǎn)速及IPTG濃度（如誘導(dǎo)溫度設(shè)置為12℃、18℃、25℃等；轉(zhuǎn)速為60 r/min、80 r/min、100 r/min等；IPTG濃度為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L等）誘導(dǎo)條件，但遺憾的是仍然未獲得呈上清表達(dá)的目的蛋白?？扇苄缘鞍椎墨@取還需要進(jìn)一步的摸索誘導(dǎo)表達(dá)條件［17］。包涵體中的蛋白量很大，并且包涵體的致密結(jié)構(gòu)可以使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)得以保留。可以采取進(jìn)一步的包涵體溶解和復(fù)性獲取可溶性蛋白［18，19］。在后續(xù)的研究中，本課題組擬通過(guò)蛋白質(zhì)復(fù)性、重新構(gòu)建質(zhì)粒等手段，以期獲得上清表達(dá)的重組目的蛋白。

4 結(jié)論

通過(guò)基因重組對(duì)WalR蛋白質(zhì)進(jìn)行了原核表達(dá)得到大量包涵體形式的蛋白質(zhì)，ClustalX 2.1軟件分析得出其在不同血清型肺炎鏈球菌中具有高保守性，利用DNASTAR Lasergene v7.1軟件對(duì)B細(xì)胞抗原表位分析顯示在氨基酸序列 9-16、35-42、95-111、113-135、150-161、200-218可能成為抗原表位。

［1］Sugita G, Hotomi M, Sugita R, et al. Genetic characteristics of Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae isolated from children with conjunctivitis-otitis media syndrome［J］. Journal of Infection and Chemotherapy：Official Journal of the Japan Society of Chemotherapy, 2014, 20（8）：493-497.

［2］Reijtman V, Gagetti P, Faccone D, et al. Macrolide resistance in Streptococcus pneumoniae isolated from Argentinian pediatric patients suffering from acute otitis media［J］. Revista Argentina Demicrobiología, 2013, 45（4）：262-266.

［3］Altinkanat GG, Soysal A, Kuzdan C, et al. Serotype distribution and antibiotic susceptibilities of Streptococcus pneumoniae causing acute exacerbations and pneumonia in children with chronic respiratory diseases［J］. Mikrobiyoloji Bülteni, 2013, 47（4）：684-692.

［4］Min X, Zhang X, Wang H, et al. Protection against pneumococcal infection elicited by immunization with glutamyl tRNA synthetase, polyamine transport protein D and sortase A［J］. Vaccine, 2012, 30（24）：3624-3633.

［5］DosSSR, Passadore LF, Takagi EH, et al. Serotype distribution of Streptococcus pneumoniae isolated from patients with invasive pneumococcal disease in Brazil before and after ten-pneumococcal conjugate vaccine implementation［J］. Vaccine, 2013, 31（51）：6150-6154.

［6］Huang WZ, Wang JJ, Chen HJ, et al. The heat-inducible essential response regulator WalR positively regulates transcription of sigI, mreBH and lytE in Bacillus subtilis under heat stress［J］. Research in Microbiology, 2013, 164（10）：998-1008.

［7］Liu P, Chen X, Huang Q, et al. The Role of CzcRS Two-component systems in the heavy metal resistance of Pseudomonas putida X4［J］. International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16（8）：17005-17017.

［8］Dhiman A, Bhatnagar S, Kulshreshtha P, et al. Functional characterization of WalRK：A two-component signal transduction system from Bacillus anthracis［J］. FEBS Open Bio, 2014, 4：65-76.

［9］Gotoh Y, Doi A, Furuta E, et al. Novel antibacterial compounds specifically targeting the essential WalR response regulator［J］. The Journal of Antibiotics, 2010, 63（3）：127-134.

［10］朱學(xué)喆, 趙志強(qiáng), 謝貴林. 肺炎鏈球菌疫苗研制進(jìn)展［J］. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展, 2013, 41（1）：58-64.

［11］Chu CY, Liu CH, et al. Development of a subunit vaccine containing recombinant Riemerella anatipestifer outer membrane protein A and CpG ODN adjuvant［J］. Vaccine, 2015, 33（1）：92-99.

［12］閔迅, 黃美容, 黃健, 等. 肺炎鏈球菌疫苗候選蛋白質(zhì)谷氨酰胺tRNA合成酶的保守性與抗原性分析［J］. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2012, 30（6）：442-446.

［13］Audouy SA, van Selm S, van Roosmalen ML, et al. Development of lactococcal GEM-based pneumococcal vaccines［J］. Vaccine, 2007, 25（13）：2497-2506.

［14］Moraes JJ, Stipp RN, Harth-Chu EN, et al. Two-component system VicRK regulates functions associated with establishment of Streptococcus sanguinis in biofilms［J］. Infection and Immunity, 2014, 82（12）：4941-4951.

［15］Wayne KJ, Li S, Kazmierczak KM, et al. Involvement of WalK（VicK）phosphatase activity in setting WalR（VicR）response regulator phosphorylation level and limiting cross-talk in Streptococcus pneumoniae D39 cells［J］. Molecular Microbiology, 2012, 86（3）：645-660.

［16］Zheng L, Yan M, Fan F, et al. The essential walK histidine kinase and walR regulator differentially mediate autolysis of RN4220［J］. Journal of Nature and Science, 2015, 1（6）：e111.

［17］Sun L, Andika IB, Shen J, et al. The P2 of Wheat yellow mosaic virus rearranges the endoplasmic reticulum and recruits other viral proteins into replication-associated inclusion bodies［J］. Molecular Plant Pathology, 2014, 15（5）：466-478.

［18］Yamaguchi H, Miyazaki M. Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies［J］. Biomolecules, 2014, 4（1）：235-251.

［19］Pereira LM, Silva LR, Alves JF, et al. A simple strategy for the purification of native recombinant full-length human RPL10 protein from inclusion bodies［J］. Protein Expression and Purification, 2014, 101：115-120.

（責(zé)任編輯 李楠）

Clone and Expression of WalR in Streptococcus pneumonia TCSs and Analyzation of Conservation and Antigenic Epitope

HAN Dao-bin1LUO Shi-lu1HUANG Jian2ZHU Jie-hua2CHEN Ze-hui2MIN Xun1
（1. Department of Medical Laboratory of Zunyi Medical University，Zunyi 563000；2. Clinical Laboratory Department of Zunyi Medical University Affiliated Hospital，Zunyi 563000）

This work aims to express WalR protein in Escherichia coli BL21 through constructing recombinant expression vector PET28a-WalR and to analyze the immunogenicity in the experimental animal C57 mice，as well as to test the conservation in different Streptococcus pneumonia serotypes and B cell antigenic epitopes. Using the WalR gene of S. pneumonia D39 as the template，the recombinant expression vector PET28a-WalR was constructed and then transferred into Escherichia coli BL21 for induced expressing target protein. The conservation of WalR protein in varied S. pneumonia serotypes was analyzed by ClustalX 2.1 software，and the B cell antigenic epitopes was analyzed by DNASTAR Lasergene v7.1. As result，recombinant expression vector PET28a-WalR was constructed successfully and much target protein was obtained by inducement of IPTG，however mainly in inclusion body. The conservation of WalR protein was up to 99.4% among different S. pneumonia serotypes，and the antigenic epitopes of WalR protein were likely located in 9-16，35-42，95-111，113-135，150-161，and 200-218 of amino acid sequence. In conclusion，recombinant S. pneumonia WalR protein in the form of inclusion body was successfully acquired，and the conservation and antigenic epitope were analyzed.

Streptococcus pneumonia；WalR；recombinant protein；conservation；antigenicity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.028

2015-12-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81460317），貴州省科技攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合SY字（2012）3092號(hào)）

韓道賓，男，碩士研究生，研究方向：細(xì)菌致病分子機(jī)制研究；E-mail：you15865885832@126.com

閔迅，男，博士，教授，研究方向：細(xì)菌致病分子機(jī)制研究；E-mail：2815400619@qq.com