韓怡來崔琪武云云顧天瑤滕孝花胡人閣吳貫達官麗莉，李海燕，李校堃

（1. 吉林農業(yè)大學生命科學學院，長春 130118；2. 吉林農業(yè)大學 生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長春 130118；3. 通化市第一中學，通化 134000）

紅花脂質轉運蛋白基因的克隆及表達分析

韓怡來1崔琪1武云云1顧天瑤1滕孝花3胡人閣1吳貫達1官麗莉1，2李海燕1，2李校堃2

（1. 吉林農業(yè)大學生命科學學院，長春 130118；2. 吉林農業(yè)大學 生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長春 130118；3. 通化市第一中學，通化 134000）

克隆紅花脂質轉運蛋白基因（Lipid transfer protein，LTP），并進行生物信息學及表達分析，旨為研究LTP在紅花抵抗逆境脅迫中的作用提供依據(jù)。通過RT-PCR方法從紅花種子中克隆LTP基因序列，通過生物信息學對該基因蛋白的特征進行分析，構建LTP與相關物種LTP的系統(tǒng)進化樹，利用Real-time PCR方法分析在紅花不同號組織中LTP基因的表達量。結果顯示，LTP基因ORF全長294 bp，編碼97個氨基酸，相對分子量為7.46 kD，等電點為8.91。紅花LTP蛋白包含一個長為29個氨基酸殘基的信號肽序列；該蛋白含有一個絲氨酸磷酸化位點；三級結構預測表明該蛋白是由3個α-螺旋和一個β-轉角簡單的纏繞在無規(guī)則卷曲上的簡單結構。分子進化表明，紅花LTP基因與十字花科的甘藍型油菜進化關系最近。通過熒光定量PCR對紅花LTP基因的組織表達特異性進行分析，結果表明CtLTP在不同組織的表達水平具有顯著差異，在種子和花中呈現(xiàn)高表達，而在其他組織中低表達。

脂質轉運蛋白；紅花；熒光定量PCR；生物信息學分析

植物非特異脂質轉運蛋白（Non-specific lipid transfer protein，nsLTP）是一類胞外分泌性蛋白，分子量約為9 kD的堿性小分子蛋白［1］。脂質轉運蛋白在不同物種之間的同源性較低，但均存在脂質轉運蛋白的明顯特征。脂質轉運蛋白是一個多基因家族蛋白，如在擬南芥中已分離到100多個脂質轉運蛋白基因，在辣椒中已經(jīng)分離出6個脂質轉運蛋白基因，而在水稻全基因組測序后發(fā)現(xiàn)了53個脂質轉運蛋白基因，同時同一物種中脂質轉運蛋白基因的表達具有較強的發(fā)育和組織特異性［2，3］。

LTP 蛋白主要存在于植物地上器官的表皮組織中，許多研究表明，不同的nsLTP基因表達對生物脅迫及非生物脅迫產生不同響應［4］。國內外對水稻、菠菜、玉米、花椰菜、綠豆和擬南芥等多種植物的脂質轉運蛋白已有較深入的研究，具備多種復雜的生物學功能，主要包括脂類物質轉運、角質層蠟質合成［5，6］，低溫［7-10］、高溫［9，11］或重金屬［12］和病原菌侵害［13］，另外，在花藥和花粉發(fā)育［14，15］、干旱和鹽［16-19］的脅迫過程中也發(fā)揮重要作用。例如，小麥TaLTP1的表達受PEG、NaCl、H2O2、傷害脅迫誘導［20］，芝麻SiLTP2與SiLTP4受NaCl、甘露醇誘導［16］，臘梅nsLTP基因響應低溫脅迫其表達增高［21］，這些結果表明，nsLTP在植物對非生物脅迫和生物脅迫的反應過程中可能起著重要作用，但關于這些基因的具體生物學功能還有待進一步研究。

紅花（Carthamus tinctorius L.）為菊科、紅花屬植物，對高溫干旱逆境具有較強的耐性，種子耐儲藏，是一種藥食兩用的經(jīng)濟作物。本課題前期已開展紅花種子、花、葉的轉錄組測序分析（SRA0472-79.2）及紅花功能基因的研究［22］，在此基礎上本研究克隆1個紅花脂質轉運蛋白基因cDNA序列并進行生物信息學分析和不同器官中的表達特性檢測，旨在為深入研究CtLTP基因的功能，揭示脂質轉運蛋白在紅花抵抗逆境脅迫中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采自吉林農業(yè)大學種植基地，經(jīng)吉林農業(yè)大學胡全德教授鑒定為菊科植物紅花（Carthamus tinctorius L.）。取紅花種子、花、莖、葉、根、胚軸和子葉迅速放于液氮，錫箔紙包好于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成 取紅花各組織置于液氮中研碎，總RNA提取方法按照Trizol試劑說明書進行，提取后進行純度及濃度測定；于-80℃保存?zhèn)溆?。cDNA合成根據(jù)Biotek公司反轉錄試劑盒操作進行，反轉錄產物分離純化后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 紅花LTP基因ORF片段的克隆 根據(jù)Solexa測序獲得的紅花轉錄組序列中功能注釋為植物脂質轉運蛋白的Unigene23752，利用NCBI 網(wǎng)站（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的ORF finder 軟件對開放閱讀框進行分析，確定起始密碼子及終止密碼子。按照引物設計原則，采用引物設計軟件 Primer5.0，對紅花轉錄組序列中的1個脂質轉運蛋白基因的ORF序列設計引物（LPT-F和LPT-R）（表1）。以反轉錄后的cDNA為模板進行PCR擴增，反應條件為：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 8 min，4℃終止反應。對PCR產物進行回收，連接pEASY-T1載體，并轉化DH5α感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選后，挑取白色菌落過夜培養(yǎng)，提取質粒，PCR、雙酶切（EcoRⅤ和Hind Ⅲ）鑒定重組子，然后測序（由生工生物工程（上海）股份有限公司完成）。

1.2.3 生物信息學分析 ORF Finder在線軟件分析紅花LTP基因相應的氨基酸序列。將獲得的紅花LTP基因ORF序列通過BLAST搜索NCBI的蛋白質和核苷酸數(shù)據(jù)庫，并通過DNAMAN軟件翻譯成氨基酸序列，利用DNAMAN軟件對來源于各種植物的LTP的相關氨基酸序列進行同源比對。相對分子質量與理論等電點（pI）預測采用ExPASy在線服務器的Compute Pi/Mw 工具，二級結構預測使用 Dublin大學的Porter 服務器，三級結構預測使用Swiss-Model服務器，結構功能域分析采用ExPASy在線務器Prosite Scanprosite。利用 SignalP4.1Server（http:// www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對紅花LTP進行信號肽預測。利用TMHMM Server v. 2.0在線軟件進行跨膜區(qū)預測。利用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining（鄰位相連法，NJ）構建系統(tǒng)進化樹等。

1.2.4 紅花LTP基因的組織表達差異分析 取紅花種子、花、莖、葉、根提取RNA，并反轉錄為cDNA用于Real-time PCR分析。定量PCR反應體系為：SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL；上下游引物（表1）各0.4 μL；ROX Reference Dye II（50×）；DNA模板2 μL；ddH2O 6.8 μL。PCR反應條件為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40個循環(huán)。

表1 擴增紅花LTP基因及qRT-PCR所用的引物序列

2 結果

2.1 紅花總RNA的提取及檢測

從吉紅1號種子中提取總RNA，凝膠電泳檢測結果（圖 1）顯示，28S rRNA和18S rRNA 條帶清晰，說明所提取的RNA完整性較好；經(jīng)核酸蛋白檢測儀測得A260/A280=1.93，A260/A230=1.98，表明RNA純度較高，可用于RT-PCR 擴增。

圖1 紅花種子總RNA電泳圖

2.2 紅花LTP基因ORF片段的克隆

根據(jù)CtLTP 基因編碼區(qū)序列特異引物（LTP-F，LTP-R），以紅花種子cDNA為模板擴增出一條294 bp的條帶（圖2-A）。經(jīng)回收純化后，PCR產物與pEASY-T1載體連接，通過菌液PCR驗證（圖2-B）和質粒的 EcoRⅤ和Hind Ⅲ雙酶切驗證（圖2-C），測序結果正確，命名該基因為CtLTP（GenBank 登錄號為KT692604）。

圖2 紅花LTP基因的克隆

2.3 紅花脂質轉運蛋白的序列分析

將推導出的紅花脂質轉運蛋白LTP氨基酸序列利用SignalP4.1軟件進行信號肽分析，發(fā)現(xiàn)CtLTP1蛋白氨基端的前29個氨基酸為信號肽序列，屬于分泌蛋白。用推測的氨基酸序列進行BLASTp比較，發(fā)現(xiàn)CtLTP屬于LTP蛋白家族（lipid-transfer protein family）。TMHMM Server v. 2.0軟件分析結果表明CtLTP1蛋白是一個跨膜蛋白，位于7-29處存在一個跨膜區(qū)，N端位于膜內，C端位于膜外。

利用ProtParam 軟件對去除信號肽的紅花LTP成熟蛋白進行基本特性分析，結果顯示CtLTP1含有原子總數(shù)為1 029，分子式為C316H513N97O94S9，其分子量為7 463.6 Da，理論等電點為8.91。

用DictyOGlyc在線工具對蛋白的糖基化位點進行預測。根據(jù)P值大于0.5即為存在糖基化位點為評分標準，LTP蛋白僅存在1個糖基化位點，是位于第46位的絲氨酸（Ser）。這些修飾可能與LTP蛋白的生物學功能密切相關。

采用 SWISS-MODELSOPMA 進行LTP的編碼蛋白二級結構分析，結果表明LTP蛋白二級結構主要由α-螺旋（Alpha helix，39.18）、延伸鏈（Extended strand，10.31）、無規(guī)則卷曲（Random coil，40.21）、β-轉角（Beta turn，10.31）組成。

在SWISS-MODEL依據(jù)保守結構域作圖工具中，對CtLTP編碼蛋白進行三維結構建模，結果（圖3）顯示，CtLTP編碼蛋白是由3個α-螺旋和一個β-轉角簡單的纏繞在無規(guī)則卷曲上的簡單結構。

圖3 LTP蛋白三級結構預測圖

2.4 同源性分析和系統(tǒng)進化樹分析

紅花LTP蛋白氨基酸序列與其他植物LTP蛋白進行比對，結果顯示在植物LTP中一些保守的氨基酸在紅花中同樣存在，但只有7個保守的半胱氨酸殘基。利用DNAMAN軟件對紅花LTP進行同源性分析顯示，與其他物種比較CtLTP蛋白與甘藍型油菜一致性最高，為47.42%。結果表明，CtLTP是一個新的紅花脂質轉運蛋白。

為了進一步了解CtLTP蛋白與其他物種LTP蛋白間的進化關系，采用MEGA5.0軟件的NJ法構建系統(tǒng)進化樹（圖4）。通過與14種植物的LTP氨基酸聚類分析發(fā)現(xiàn)，脂質轉運蛋白在煙草、野生大豆、甘藍型油菜、擬南芥等植物中均以多種形式存在，且序列差異較大，在系統(tǒng)進化樹分散在遺傳距離較遠的分支上。紅花LTP蛋白與擬南芥、野生大豆、油橄欖、千里光以及苜蓿同屬于一個分支。

圖4 紅花LTP與其他物種LTP的聚類分析

2.5 紅花LTP基因的組織差異表達分析

利用實時熒光定量PCR技術檢測CtLTP基因在不同組織中的相對表達量。組織差異表達可為研究基因的功能和調控機制提供依據(jù)，本實驗選取紅花的種子、花、莖、葉、根、胚軸和子葉7個組織對紅花脂質轉運蛋白基因進行了組織差異表達分析。圖5顯示，CtLTP在不同組織的表達水平具有顯著差異，在種子和花中呈現(xiàn)高表達，而在其他組織中低表達。

3 討論

紅花在食品、藥品領域起著重要作用，是我國重要的油料和經(jīng)濟作物。紅花病害的發(fā)生和流行一直是影響紅花黃色素及紅花油產量的重要因素，特別是根腐病、銹病等病害嚴重影響了紅花的產量及品質。因此，通過生物技術手段提高紅花品種的抗性，確保紅花食品、藥品的安全是十分必要的。

圖5 紅花LTP基因的組織表達分析

脂質轉運蛋白在植物中普遍存在，目前已經(jīng)從單子葉植物和雙子葉植物的很多器官和組織中發(fā)現(xiàn)了脂質轉運蛋白，其中以在擬南芥、水稻、玉米、小麥、棉花、辣椒、以及番茄等作物中研究較為深入。本研究根據(jù)紅花轉錄組測序結果，克隆到1個脂質轉運蛋白基因CtLTP，其編碼的蛋白屬于Nonspecific lipid-transfer proteinⅡ（nsLTP2） 亞 家 族，其具有 LTP蛋白的理化性質，包括8個保守的半胱氨酸殘基、堿性等電點、低分子量以及N端典型信號肽結構等［24］。通過對13種植物與克隆得到的紅花LTP氨基酸序列進行多重比對發(fā)現(xiàn)，他們的同源性差異較大，說明LTP蛋白的一級結構在不同物種間存在差異，具有多態(tài)性。LTP能被病原菌誘導而高水平表達，并能抑制病原菌的生長和誘導植物系統(tǒng)抗性的產生［25］。擬南芥LTP3作為一個新的負調控因子，通過調控ABA-SA的平衡參與植物免疫［26］。過量表達LTPs基因也能提高轉基因作物對病原菌的抗性，能夠增強作物的抗病和適應不良環(huán)境的能力；小麥TdLTP4基因在擬南芥中過表達能夠提高其抗旱和抗鹽能力，同時轉基因擬南芥離體葉片表現(xiàn)出增強對交鏈孢菌和灰葡萄孢真菌性［27］；小麥TdLTP3能夠增強擬南芥抗旱性及氧化應激能力［28］；超表達脂質轉運蛋白AZI能夠增強植物對鹽的耐受性，體內外實驗證明其通過與有絲分裂原活化的蛋白激酶MPK3相互結合發(fā)揮作用［29］；轉LTP基因甘藍型油菜對菌核病的抗病性增強［30］。因此，通過基因工程的手段過量表達LTPs基因培育作物抗逆新品種，具有廣泛的應用前景。

本研究克隆到1個脂質轉運蛋白基因CtLTP基因，并主要在紅花種子及花瓣中表達，具有顯著的組織表達特異性，為進一步利用紅花的脂質轉運蛋白LTP提高紅花的抗性研究奠定基礎，以推動紅花轉基因育種的進程。下一步實驗會將CtLTP基因構建植物表達載體并轉化到植物中進行表達及功能驗證，期望獲得抗病抗逆能力增強的轉基因植物；同時，亦可構建原核表達載體，獲得純化的LTP蛋白，在體外驗證該蛋白的功能。

4 結論

本研究成功克隆1個紅花脂質轉運蛋白LTP基因cDNA序列并進行生物信息學分析及組織特異性表達分析，結果表明，紅花LTP基因在不同組織的表達水平具有顯著性差異，在種子和花瓣中較高，而在其他組織中表達量較低。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Analysis of Lipid Transfer Protein LTP Gene in Carthamus tinctorius

HAN Yi-lai1CUI Qi1WU Yun-yun1GU Tian-yao1TENG Xiao-hua3HU Ren-ge1WU Guan-da1GUAN Li-li1，2LI Hai-yan1，2LI Xiao-kun2
（1. College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118；2. Ministry of Education Bioreactor and Drug Development Research Center，Jilin Agricultural University，Changchun 130118；3. Tonghua No.1 Senior High School，Tonghua 134000）

LTP（Lipid transfer protein）gene was cloned，its bioinformatics and expression were analyzed，providing the basis for the study the role of LTP gene in safflower resisting stresses. The sequence of LTP gene was cloned by RT-PCR technique，the protein characteristics were analyzed using bioinformatics，and the phylogenetic tree of LTP for safflower and other species was constructed. The expressions of LTP gene in the different tissues were analyzed using Real time-PCR. Sequence analysis showed that ORF of LTP was 294 bp，encoding a protein of 97 amino acids with a molecular weight of 7.46 kD，isoelectric point of 8.91. Safflower LTP protein contained a long signal peptide sequence of 29 amino acid residues，and the protein contained a serine phosphorylation site. Tertiary structure prediction indicated that the protein was a simple structure of 3 α-helix and 1 β-turn twining in random coils. Molecular evolution showed that the evolutionary relationship of LTP between Brassica of cruciferous and safflower was the most similar. Tissue-specific expression analysis of safflower LTP by fluorescence quantitative PCR showed that the gene expression levels in different tissues presented a significant difference，while high expression in seeds and flowers，and low expression in other tissues.

lipid transfer protein；safflower；Real-time PCR；bioinformatics analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.022

2015-07-22

國家高技術研究發(fā)展計劃（“863”）項目（2011AA100606），吉林省教育廳“十三五”科學技術研究項目重點項目（吉教科合字［2016］179號） ，國家自然科學基金資助項目（31201237），吉林農業(yè)大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（201610193046，201410193045），吉林省科技廳中青年領軍人才及優(yōu)秀創(chuàng)新團隊項目（20111815），教育部博士點基金-青年教師基金項目（20122223120002）

韓怡來，男，研究方向：生物技術；E-mail：994435840@qq.com

官麗莉，女，實驗師，研究方向：藥用植物與生物技術；E-mail：guanll2004@163.com