張紅利 賈鑫磊 劉建霞 張永芳

（大同大學生命科學學院，大同 037009）

保存方式和回軟溫度對蜜蜂標本DNA提取的影響

張紅利 賈鑫磊 劉建霞 張永芳

（大同大學生命科學學院，大同 037009）

旨在探尋保存方式及制作干標本前回軟溫度對蜜蜂不同部位DNA的影響。采用酚-氯仿法對不同方式保存的蜜蜂以及不同溫度回軟后的蜜蜂干標本的總DNA進行提取，通過瓊脂糖凝膠電泳和PCR擴增對DNA的提取結(jié)果進行鑒定。電泳結(jié)果顯示，從新鮮標本、無水乙醇泡制或自然干燥保存半年的標本中均可提取到較高質(zhì)量的總DNA，尤以頭部與足部提取效果最佳。經(jīng)不同水浴溫度回軟后保存半年的蜜蜂干標本總DNA提取結(jié)果顯示，回軟溫度為65℃時對蜜蜂DNA的破壞性最小，DNA提取的最佳部位為蜜蜂足部。正交試驗結(jié)果顯示，55℃回軟后的足部為蜜蜂干標本DNA提取的最優(yōu)組合。PCR擴增結(jié)果顯示，本實驗提取的總DNA能成功地應用于蜜蜂線粒體基因16S rRNA和CO I的擴增。從保存方式、提取部位和回軟操作3個因素對蜜蜂標本DNA的提取進行了研究，提供了較好的選擇方案。

蜜蜂；干標本；回軟；DNA提取

分子生物學是支撐現(xiàn)代昆蟲學發(fā)展的一項關鍵技術［1，2］。 隨著分子生物學的發(fā)展，從核酸分子水平上對昆蟲進行物種鑒定、物種多樣性評估以及物種親緣關系的研究，是目前重要的研究手段［3］。而有效的基因組DNA提取方法無疑是昆蟲分子生物學研究的重要前提。蜜蜂為群居動物，世界各地均有分布，在傳授花粉的過程中扮演著至關重要的角色［4-6］。關于從蜜蜂組織提取DNA 的方法已有報道，但仍以新鮮標本、酒精浸泡和冷凍保存標本為對象［7-11］，以干標本為實驗材料提取總DNA的報道極少見［12］。在實際工作中，很難直接用新鮮標本和冷凍標本進行試驗，野外通常以酒精泡制和干制方法收集標本。酒精浸泡雖然能更好地保護DNA，但因攜帶不便并容易導致標本關鍵鑒定部位褪色。因此，在實際野外取材工作中，多數(shù)標本都是以干標本帶回實驗室，并經(jīng)回軟后針插制成干標本。目前，最簡便且無害的回軟方法為水蒸汽回軟法，但DNA化學性質(zhì)極不穩(wěn)定，可以通過水解或氧化作用自發(fā)地降解［13］，而且高溫也會加劇DNA的分解，干標本再經(jīng)放置更加大了提取DNA 的難度。另外，尚未有人對蜜蜂不同部位DNA的提取效果進行研究。因此，本實驗參照傳統(tǒng)的SDS-飽和酚氯仿法通過對不同處理方式和保存方式的蜜蜂標本4個部位進行DNA提取比較，旨在以蜜蜂為對象針對干標本制作過程中回軟這一關鍵操作提供數(shù)據(jù)支持，同時也為標本DNA的提取工作提供更好的選擇方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗標本 蜜蜂標本均采自山西省大同市興云街大同大學北校區(qū)，經(jīng)鑒定為膜翅目蜜蜂科蜜蜂屬西方蜜蜂（Apis mellifera linnaeus，1758）。新鮮標本經(jīng)無水乙醇或乙酸乙酯短暫處理，干標本均采用數(shù)顯恒溫水浴鍋隔水蒸汽回軟1.5 h。

1.1.2 實驗儀器及試劑 HC-3018R高速冷凍離心機（安徽中科中佳），DYY-10C電泳儀（北京六一），Tannon 1600凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技），DTC PCR儀（西安天隆科技），UPH-Ⅱ-60L優(yōu)普系列超純水機（成都超純科技有限公司），HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市國旺實驗儀器廠），蛋白酶K，Gold View I型核酸染液，DL2000 Plus Marker（寶生物工程 ），2×Taq PCR StarMix with Loading Dye，Direct-LoadTMλ DNA/HindIII Marker（北京華大基因），16S rRNA及CO I引物（上海生工），軟件：Quantity One。

1.2 方法

1.2.1 蜜蜂DNA的提取方法 所有標本提取DNA前均使用超純水沖洗數(shù)秒后用濾紙除去殘余水分，之后采用傳統(tǒng)的蛋白酶K消化-飽和酚氯仿抽提法進行蜜蜂DNA的提?。?4］。對傳統(tǒng)方法進行部分改良，恒溫水浴消化2 h后補加酶液50 μL以提高消化水平。飽和酚氯仿抽提前，使用TE溶液補加體系至800 μL以減少抽提過程中的損失。

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳及定量分析 總DNA點樣于0.8%的瓊脂糖凝膠，PCR產(chǎn)物點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠（均含5%的Gold ViewerⅠ型核酸染液），80 V電泳60 min，至凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照保存。正交實驗電泳圖采用軟件Quantity One對目標條帶區(qū)進行光密度測定作為定量分析依據(jù)。

1.2.3 正交試驗設計 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，采用L16（42）正交表，研究不同溫度處理和提取部位對DNA提取結(jié)果的影響。正交試驗的兩因素四水平如表1。

表1 正交實驗因素及水平

1.2.4 線粒體16S rDNA和CO I的PCR擴增鑒定 以新鮮標本的足部，無水乙醇浸泡標本的足部，自然干燥保存標本的頭部、胸部、腹部、足部及正交實驗各部位最優(yōu)水平提取到的DNA為模板，采用線粒體DNA中16S rDNA通用引物（上游引物：5'-TTATTCACCTGTTTAWCAAAAACAT-3'和下游引物：5'-TATAGATAGAAACCAATCTG-3'）和CO I通 用 引 物（ 上 游 引 物 ：5'-AATTGGWGGWTTYGGAAAYTG-3' 和下游引物：5'-GGTAATCAGAGTATCGWCGNGG-3'）（簡并堿基W代表A/T，簡并堿基N代表A/T/G/C）進行PCR擴增［15，16］。PCR反應體系為10 μL，其中模板DNA 0.5 μL，上游引物和下游引物各1.25 μL，PCR Taq Mix 5 μL，ddH2O 2 μL。PCR擴增程序為93℃預變性1 min；92℃變性10 s，54℃退火30 s，68℃延伸1 min，15個循環(huán)后，每循環(huán)一次延伸時間延長10 s再進行15個循環(huán)；68℃再延伸7 min，最后4℃保溫。

2 結(jié)果

2.1 新鮮標本總DNA的提取結(jié)果

用飽和酚法分別對經(jīng)乙酸乙酯和無水乙醇收集的新鮮蜜蜂標本進行體細胞DNA的提取，提取樣品經(jīng)電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。從無水乙醇收集標本的4個部位均可提取到總DNA，且條帶清晰、明亮、基本成線形，但其中4個DNA樣品均在同一位置出現(xiàn)另一條條帶。而乙酸乙酯收集新鮮標本中，足部DNA提取效果最佳，腹部DNA基本降解。

圖1 乙酸乙酯（A）及無水乙醇（B）處理后的新鮮蜜蜂總DNA提取結(jié)果

2.2 無水乙醇浸泡和自然干燥標本總DNA的提取結(jié)果

用飽和酚法分別對經(jīng)無水乙醇浸泡和自然干燥后室溫保存半年的蜜蜂標本進行體細胞DNA的提取，結(jié)果如圖2所示。兩種保存方式對標本DNA完整度影響均較小。從無水乙醇浸泡標本獲得的總DNA條帶清晰，譜帶整齊明亮，且無拖尾現(xiàn)象，但其中多數(shù)DNA樣品也均在同一位置出現(xiàn)另一相對分子質(zhì)量較小的條帶。對于自然干燥處理室溫保存半年的蜜蜂標本，由足部提取的DNA條帶單一，較為清晰，而胸部提取的DNA條帶略淡。

圖2 無水乙醇浸泡（A）及自然干燥（B）室溫保存半年后的蜜蜂總DNA提取結(jié)果

2.3 加溫回軟標本總DNA的提取結(jié)果

經(jīng)6個溫度回軟后保存半年的蜜蜂干標本DNA提取結(jié)果如圖3所示，4個回軟溫度（45℃、55℃、65℃和85℃）對各部位DNA的破壞性較小；95℃高溫水汽回軟后，蜜蜂干標本各部位的DNA幾乎完全降解，僅在腹部呈現(xiàn)一條很淡的條帶；75℃回軟后僅胸部和腹部有一條弱帶，頭部和足部均未有條帶出現(xiàn)。蜜蜂4個部位中，頭部經(jīng)高溫水汽回軟后DNA條帶均呈現(xiàn)彌散狀；胸部、腹部和足部提的DNA條帶相對清晰完整，受回軟溫度的影響較小。

圖3 回軟處理后蜜蜂總DNA提取結(jié)果

2.4 正交實驗結(jié)果

通過分析正交實驗電泳圖，結(jié)果如圖4和表2所示，A因素對應的最佳水平為4（足部），B因素對應的最佳水平為3（65℃處理）。DNA保存條件的最佳組合為55℃回軟標本的足部，較優(yōu)水平為45℃、65℃回軟標本的足部和45℃、55℃回軟標本的頭部。

圖4 正交實驗中蜜蜂總DNA的凝膠電泳圖譜

2.5 PCR擴增結(jié)果

實驗中用16S rDNA和CO I兩對通用引物對隨機選擇的10個DNA樣品進行了擴增，結(jié)果（圖5）顯示，以不同的DNA樣品做模板，均在相應的位置擴增出目的條帶（CO I片段的長度約為1 000 bp，16S rDNA片段的長度約為600 bp）。因此，通過本實驗提取的DNA均可用于后續(xù)的PCR擴增。

3 討論

蜜蜂基因組DNA提取的研究報道集中于探討提取方法和保存方式對DNA提取效果的影響。目前主要采用傳統(tǒng)方法提取蜜蜂DNA［7，11，12，17，18］，但也有學者根據(jù)不同的應用目的，嘗試用新型方法對蜜蜂DNA進行提?。?，19］，獲得較好的效果。關于干燥及保存方法對蜜蜂標本DNA完整性的影響也有相關報道［17，18］，但是不同保存方式中蜜蜂不同部位的DNA保存效果，以及不同回軟溫度對干標本DNA的損害度均未見報道。

本實驗通過研究保存方式、提取部位、回軟操作對蜜蜂標本DNA提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新鮮標本或久置標本均以無水乙醇固定后提取的DNA質(zhì)本成功提取到質(zhì)量較好的DNA。因此，針對昆蟲干標本，其DNA保存的難易程度應該具有種屬差異性，這種差異可能與它們自身的生存環(huán)境、食性及自身量最佳。干標本制作前回軟操作對DNA影響較大，明顯劣于自然干燥保存半年標本的DNA提取效果。4個部位相比較，足部DNA提取效果最佳，而且不影響蜜蜂標本的形態(tài)鑒定。新鮮標本經(jīng)乙酸乙酯處理后提取的DNA質(zhì)量略差，這可能與前期處理有密切的聯(lián)系。因新鮮標本組織含胞液較多，使用鑷子夾取較困難，花費時間較長。而且整個解剖過程均在室溫下進行，胞液中本身含有眾多核酶，由于酶的高效性，短時間也會對DNA造成嚴重的降解。而新鮮標本若經(jīng)無水乙醇短暫固定后，組織失去大部分胞液，一方面可以極大的縮短解剖所用的時間；另一方面，自由水的缺失在一定程度上抑制了胞內(nèi)核酶的活性，從而減少了DNA的損傷。因而在使用新鮮標本為材料時解剖工作宜在低溫下進行，或者選擇使用無水乙醇短暫固定后再進行后續(xù)操作。經(jīng)無水乙醇短暫固定后的新鮮標本及無水乙醇浸泡保存半年的標本提取的DNA電泳圖中，多數(shù)樣品呈現(xiàn)出另一條明顯的條帶，本樣品經(jīng)RNase A消化電泳后，確證為RNA條帶，這與季清娥等［12］和董霞等［20］認為第二條帶為RNA污染條帶結(jié)論相同。對于自然干燥保存半年后的蜜蜂標本，其DNA保存情況依然較為理想，而同期處理保存的蝗蟲及蜻蜓干標本，發(fā)現(xiàn)有霉變現(xiàn)象且DNA發(fā)生嚴重降解，僅有個別標代謝產(chǎn)生的某些具有抑菌作用的特殊化合物有關。

表2 正交試驗蜜蜂總DNA提取量

圖5 不同模板DNA的PCR擴增產(chǎn)物

野外干標本通常需回軟后針插制成儲存干標本，考慮到回軟操作對標本DNA的影響，本實驗設置了6個水浴溫度對標本進行回軟，儲存半年后進行DNA的提取。在單因素實驗中發(fā)現(xiàn)，95℃蒸汽回軟的蜜蜂標本中，DNA完全降解。剩余的5個梯度溫度中，相較而言，75℃蒸汽回軟的蜜蜂標本提取到的DNA效果較差。因此，在設計正交試驗時，剔除95℃和75℃兩個溫度水平。比較蜜蜂標本不同部位的DNA提取結(jié)果發(fā)現(xiàn)，足部與頭部DNA保存較完整，不易發(fā)生降解，能提取到高質(zhì)量的DNA。和志嬌等［17］認為，從蜜蜂足部提取DNA容易受到花粉DNA的污染，本實驗以桃花新鮮花粉及自然干燥花粉為材料均未提取到DNA，因此蜜蜂的足部雖細小但完全能用于DNA的提取。另外，本研究中取蜜蜂標本前足、中足、后足各一只便可提取到滿足實驗研究要求的DNA，這對于從分子水平研究那些珍貴稀有標本具有重要的意義和價值。

正交實驗結(jié)果中，通過分析樣品目標條帶的光密度值，發(fā)現(xiàn)溫度對不同部位產(chǎn)生的影響是不一致的。對于足部和頭部來說，隨著溫度的升高，其保存的完整DNA的量總體呈下降趨勢；而對于腹部與胸部來說，隨著溫度的升高，其保存的完整DNA量總體呈上升趨勢，這說明回軟過程中DNA可能不僅發(fā)生了化學降解反應，還有可能伴隨著部分的酶降解反應。對于足部和頭部來說，以化學降解為主，溫度越高降解越嚴重；而對于胸部和腹部來說，以酶降解為主，溫度越低，降解程度越高。由部位來看，K4＞K1＞K3＞K2，這說明與腹部及胸部相比較，蜜蜂足部和頭部雖然所含組織較少，但提取出來的完整DNA量要比其多，與我們通常認為的組織越大，提取到的DNA越好相反。這提示我們在標本中獲得高濃度、高質(zhì)量的DNA主要取決于標本中所保留的完整DNA的量，樣品雖少，但也可以獲得高濃度的DNA，而取材的多少居于次要因素。因而在提取標本DNA時，不能一味追求選擇大的組織或者通過增加組織量來祈求獲得高濃度、高質(zhì)量的DNA，更應該注重組織的保存狀況。由溫度來看，K3＞K2＞K1＞K4，即對于整體來說，65℃回軟保存的完整DNA量最多；55℃與45℃回軟保存的完整DNA量次之，且55℃與45℃回軟對標本整體總DNA量的影響幾乎沒有差別；而85℃回軟保存的完整DNA量較少，說明標本回軟過程中，并非溫度越低，保存的完整DNA越多?；剀洔囟鹊拇_定既要考慮高溫造成的化學損傷，也應注意適當?shù)母邷乜梢酝ㄟ^抑制酶的活性減弱酶降解反應從而對DNA起到一定的保護作用。

4 結(jié)論

通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)從不同方式保存的蜜蜂標本中均可提取到較高質(zhì)量的總DNA。同自然干燥法相比，回軟操作明顯破壞了蜜蜂DNA的穩(wěn)定性，但65℃對DNA的破壞性最小。蜜蜂DNA提取的最佳部位為足部，DNA保存最完整。通過線粒體基因16S rDNA和CO I保守片段的擴增，進一步證實本實驗提取的總DNA質(zhì)量較好。

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（責任編輯 馬鑫）

The Effects of Preservation Methods and Temperature of Softening Specimens on DNA Extraction from Apis mellifera

ZHANG Hong-li JIA Xin-lei LIU Jian-xia ZHANG Yong-fang
（School of Life Sciences，Datong University，Datong 037009）

This work aims to explore the effects of preservation methods and temperature while softening specimens before drying the specimen on DNA from different parts of bees. The phenol - chloroform method was used to extract the total DNA from bee specimens preserved in different methods and from those dried bee specimens softened at different temperatures. The extracted DNA was analyzed and identified using agarose gel electrophoresis and the PCR amplification. The electrophoresis images showed that fine-quality DNA was extracted from all specimens，including specimens collected freshly，specimens soaked with alcohol， and specimens dried under natural conditions，and the quality of genomic DNA from the head and the leg of these specimens was better than that from other parts. The total extracted DNA results from dried bees softened under different bath temperatures and preserved half year showed that 65℃ was the optimal softening temperature，and the damages to bee’s DNA was the least，and the ideal part for extracting DNA was the bee’s leg. The results of orthogonal experiment also revealed that the leg and softened at 55℃ was the optimal combination for extracting DNA from the dried specimen. Furthermore，the results of PCR amplification confirmed that these DNA extracted in our experiment were used to successfully amplify mitochondrial 16S rRNA and CO I fragments. In summary，DNA extraction was explored from the three aspects：preservation methods，extracted parts and softening operations，which could provide better alternative proposals for collecting DNA from bees.

bee；dried specimens；softening；DNA extraction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.035

2015-10-21

博士科研啟動基金（2013-B-08）

張紅利，女，博士研究生，研究方向：昆蟲分子生物學；E-mail：bonus0301@163.com