王為蘭 陳開旭 劉軍 段魏魏 徐亞楠 張富春

（新疆生物資源基因工程重點實驗室 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046）

阿魏菇醇提物抗腫瘤功效及三萜類成分的提取

王為蘭 陳開旭 劉軍 段魏魏 徐亞楠 張富春

（新疆生物資源基因工程重點實驗室 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046）

為探究阿魏菇醇溶性物質(zhì)（PFECs）抗腫瘤功效，優(yōu)化阿魏菇醇提物三萜類化合物（PFTPs）提取條件，獲取最大提取率。采用MTT法檢測PFECs對5種腫瘤細胞生長抑制活性；對兩種正常細胞無明顯抑制作用；采用超聲輔助、微波輔助熱水浸提法、單因素試驗與響應(yīng)曲面法相結(jié)合，對阿魏菇三萜類化合物提取工藝優(yōu)化。結(jié)果顯示，PFECs具有顯著的抗腫瘤活性；PFTPs提取的最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶19（g/mL）、提取溫度75℃、提取時間22 min（超聲40 min后），提取率為4.42%。

阿魏菇；醇提物；活性成分；抗腫瘤；三萜化合物；提取優(yōu)化；響應(yīng)曲面

阿魏菇（Pleurotus ferulae Lanzi）又稱為阿魏側(cè)耳，屬于擔子菌側(cè)耳科側(cè)耳屬，寄生在荒漠地區(qū)的一種藥用植物阿魏中，故而得名。阿魏菇富含人體必需的多種氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖等，是一種珍貴的食藥兩用菌，主要分布在我國新疆的伊犁、塔城、阿勒泰和木壘地區(qū)。

三萜類化合物廣泛存在于菌類、蕨類等植物之中，具有抗腫瘤［1-6］、抗炎殺菌［7-12］、抗氧化［13-15］、降血糖［16-20］等活性。前期系統(tǒng)預(yù)實驗結(jié)果表明，阿魏菇中含有萜類化合物、多糖類、多糖-蛋白復(fù)合物、蛋白質(zhì)類、脂肪與激素類、酚類化合物等成分。研究報道阿魏菇具有調(diào)節(jié)人體生理平衡、抗氧化［21］、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤［22］、降血脂［23］、調(diào)節(jié)血糖水平［24］、增強機體免疫［25］等功效；目前對阿魏菇藥理活性研究尚淺，生物活性成分有待深入探究；因此以阿魏菇為研究對象，檢測阿魏菇醇溶性物質(zhì)藥理功效，從阿魏菇中提取活性成分三萜類化合物，并通過單因素及響應(yīng)曲面法進行提取優(yōu)化，為阿魏菇三萜類化合物的藥理功效研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 阿魏菇子實體采購于新疆青河縣，色白均勻，每個子實體重量約為200-500 g之間。

1.1.2 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS），二甲基亞砜（DMSO），胰蛋白酶（Trypsin，0.25%），四甲基偶氮唑藍（MTT）購自于美國Sigma公司；胎牛血清（FBS，Gibco）購自于美國Gibco公司；乙酸乙酯、高氯酸、甲醇、香草醛、冰乙酸、多聚甲醛、無水乙醇購自天津市富宇精細化工有限公司；熊果酸標準品購于上海源葉生物科技有限公司；齊墩果酸標準品購于上海源葉生物科技有限公司；堿式醋酸鉛購于洛陽市化學(xué)試劑廠等；以上試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 Bio-Rad酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-Rad公司）HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠），SHB-IIIS循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（德國Heidolph公司），SB5200DT超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），F(xiàn)ree Zone 2.5冷凍干燥機（美國LABCONCO公司），Avanti J-E高速冷凍離心機（美國BECKMAN公司）等。

1.2 方法

1.2.1 阿魏菇真空冷凍干燥工藝 阿魏菇子實體清洗（蒸餾水沖洗，紗布擦拭）→切片（適量厚度）→裝入培養(yǎng)皿（200 g/盤）→保鮮膜封閉→-80℃冰箱冷凍過夜→真空干燥（冷阱溫度為-50℃，真空壓力為0.08 MPa）→完全凍干→粉碎，過40目篩→封入包裝袋，-20℃凍存。

1.2.2 阿魏菇醇提取物（PFECs）的提取工藝流程 阿魏菇子實體凍干粉200 g→加適量濃度乙醇→超聲輔助20 min→60℃水浴浸提2 h→3 500 r/min離心10 min→反復(fù)浸提、至濾液澄清→合并上清液 濃縮至浸膏→真空冷凍干燥→阿魏菇醇提物（PFECs）。

1.2.3 阿魏菇醇提取物（PFECs）的抗腫瘤活性檢測 取對數(shù)生長期的人食管癌Eca109細胞，人宮頸癌HeLa細胞，鼠黑色素瘤B16F10細胞，人胚腎細胞293FT，人乳腺癌細胞MCF-7，0.25% 胰蛋白酶消化收集后，用新鮮的RPMI1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基分別稀釋成2×104/mL的細胞懸液，100 μL/孔接種于96孔板培養(yǎng)24 h。分別以0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 mg/mL的PFECs處理細胞，設(shè)置空白組、陰性對照組，各組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入20 μL MTT（5 mg/mL）溶液孵育4 h，棄去各孔殘液，200 μL DMSO溶解，室溫振蕩30 min，酶聯(lián)免疫吸附儀490 nm測定各孔吸光度值。

細胞存活率（%）=（試驗孔OD值/對照孔OD值）×100%

細胞抑制率（%）=（1-試驗孔OD值/對照孔OD值）×100%

同理，體外培養(yǎng)人胃癌細胞BGC823，人胃細胞GES-1，以0.4、0.8、1.6和3.2 mg/mL的PFECs處理，設(shè)置空白組，陰性對照組，分別作用24、48和72 h，加MTT溶液，酶標儀波長490 nm檢測。

1.2.4 阿魏菇醇提物中活性成分三萜類化合物的提取工藝（1）超聲輔助提取工藝流程：新鮮阿魏菇子實體→ 勻漿→按照一定料液比加提取溶劑→超聲輔助破碎→熱水浸提→離心→收集合并上清液→減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→定容→取樣檢測提取率。（2）微波輔助提取工藝流程：同上述方法1.2.4.1，輔助方法為微波破碎法。

1.2.5 阿魏菇醇提物中活性成分三萜類化合物（PFTPs）的定性檢測 各取0.1%、0.5%和1% 濃度的阿魏菇乙醇提取液1 mL，設(shè)置空白組、陰性對照組，水浴蒸干，分別加入1mL氯仿溶解殘渣，收集氯仿液于EP管中，再加入1 mL濃硫酸，樣液分為兩層：氯仿層和硫酸層；若觀察到氯仿層呈紅色或青紅色，硫酸層呈熒光綠色，表明乙醇提取液可能含有三萜類化合物。

1.2.6 阿魏菇醇提物中三萜類化合物（PFTPs）的含量測定 以齊墩果酸為標準品，選用香草醛-冰醋酸，高氯酸顯色法測定［26］。

齊墩果酸標準曲線的制作：準確稱取齊墩果酸標準品4 mg，用甲醇定容至10 mL配制成0.4 mg/mL標準溶液。分別取0.2、0.4、0.8、1.0、1.2和1.4 mL標準液，水浴加熱，除去溶劑后，加入0.5 mL新配制的5%香草醛-冰乙酸及1.4 mL高氯酸，60℃恒溫水加熱15 min，取出流水冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯定容至10 mL，搖勻，于550 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。以吸光度（y）為縱坐標，以齊墩果酸標準溶液的濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。

1.2.7 阿魏菇醇提物中三萜類化合物（PFTPs）提取的單因素試驗

1.2.7.1 提取次數(shù)的確定 準確稱取10 g阿魏菇干粉，料液比1∶30（g/mL），乙醇濃度70%，提取溫度為60℃，提取時間120 min，選擇提取次數(shù)分別為1次、2次、3次進行提取，測定吸光度值，計算三萜提取率。

1.2.7.2 提取時間的確定 選擇提取時間分別為30、60、90、120、150和180 min進行提取。

1.2.7.3 乙醇濃度的確定 選擇乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%和95%進行提取。

1.2.7.4 溫度的確定 選擇提取溫度為50℃、60℃、70℃、80℃和90℃進行提取。

1.2.7.5 微波時間的確定 選擇微波輔助提取時間分別為5、10、15、20、25和30 min，微波輔助后熱水浸提時間選擇為30、60和90 min進行提取。

1.2.7.6 超聲時間的確定 選擇超聲輔助提取時間分別為30、40、50和60 min，超聲輔助后熱水浸提時間選擇為10、20、30、40和50 min進行提取。

1.2.7.7 料液比的確定 選擇料液比為1∶20（提取1次），1∶20（提取2次），1∶20（提取3次），1∶30（提取1次），1∶30（提取2次），1∶30（提取3次）進行提取。

1.2.8 阿魏菇醇提物中三萜類化合物（PFTPs）提取條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗 綜合考慮單因素試驗結(jié)果，影響三萜類化合物提取的主要因素是提取溫度、超聲后的提取時間，料液比。根據(jù)Central-Composite設(shè)計原理，運用Design-Expert.8.0.6軟件設(shè)計三因素三水平的旋轉(zhuǎn)中心組合試驗。以三萜類化合物提取率為響應(yīng)值，確定提取三萜類化合物的最佳工藝參數(shù)。表1 為微波輔助法提取三萜時的因素水平表。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素及水平

1.2.9 阿魏菇醇提物中三萜類化合物（PFTPs）的提取率 提取率（%）=（C×V×n/W）×100%/10，其中，C：三萜類化合物濃度（μg/mL）；V：提取液的體積（mL）；n：稀釋倍數(shù)；W：樣品的質(zhì)量（μg）。

2 結(jié)果

2.1 阿魏菇醇提取物（PFECs）的抗腫瘤作用

PFECs均能夠顯著抑制4種腫瘤細胞增殖生長，且對人胚腎細胞293FT細胞生長活性無顯著性抑制作用（圖1-A）。與陰性對照組比較，PFECs對B16F10細胞增殖活性具有顯著性抑制作用。PFECs濃度為0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 mg/mL時，B16F10細胞增殖活性分別降低至79.26%、70.83%、60.24%、39.27%、36.96%（P＜0.05）。同理可證，當濃度為0.4 mg/mL和0.8 mg/mL 時，PFECs對Eca109細胞增殖呈顯著性抑制作用，濃度越高，抑制作用愈顯著。PFECs可顯著抑 制HeLa細胞增殖；濃度越大，抑制效果越顯著；但從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)0.8 mg/mL PFECs作用細胞后，抑制效果不顯著，這可能是由于細胞密度不均勻所致。PFECs對MCF-7細胞增殖抑制作用隨著濃度增加而逐漸顯著；細胞增殖相對活性明顯降低，分別為 69.99%、64.46%、63.49%、45.25%和36.56%。當PFECs濃度由0.2 mg/mL增大至1.6 mg/mL時，293FT細胞增殖相對活性均未受到抑制作用；但3.2 mg/mL PFECs作用48 h后，293FT細胞相對增殖活性受到顯著抑制（P＜0.05）；這是由于PFECs濃度過高，作用時間過長導(dǎo)致。結(jié)合以上結(jié)果，腫瘤細胞對PFECs敏感程度大小依次為B16F10細胞＞ MCF-7＞Eca109細胞＞HeLa細胞。

圖1 阿魏菇醇提取物（PFECs）抗腫瘤活性

通過PFECs對胃癌BGC-823細胞及正常胃GES-1細胞活性、增殖的抑制作用確定PFECs最適作用濃度及最佳作用時間，結(jié)果如圖1-B。PFECs呈時間-劑量依賴性抑制BGC-823細胞活性，且在24 h時，0.8 mg/mL、1.6 mg/mL PFECs對BGC-823細胞抑制顯著；對正常胃GES-1細胞無顯著性抑制作用。

綜合結(jié)果分析得知，適宜濃度的PFECs具有顯著抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤細胞增殖，并對正常細胞毒副作用較小，確定PFECs最佳作用時間為24 h，最適作用濃度范圍為（0.4、0.8和1.6 mg/mL）。

2.2 阿魏菇醇提物中三萜類化合物定性分析結(jié)果

氯仿-濃硫酸實驗結(jié)果（圖2）顯示，氯仿層呈紅色或磚紅色，硫酸層呈熒光綠色，證明阿魏菇醇提物中含有一定量的三萜類化合物。

圖2 阿魏菇醇提取液中三萜類化合物的定性分析

2.3 阿魏菇三萜類化合物提取單因素分析

2.3.1 提取次數(shù)對阿魏菇三萜類化合物提取率的影響 標準曲線的線性回歸方程（齊墩果酸）：y=0.023x+0.023，相關(guān)系數(shù)：R=0.9988。不同提取次數(shù)對齊墩果酸類三萜得率會有影響，且在第一次提取時得率最大，至第3次提取時，提取率變化緩慢，表明已提取完全（圖3）。因此提取次數(shù)確定為2次。

2.3.2 提取時間阿魏菇三萜類化合物提取率的影響 標準曲線的線性回歸方程（齊墩果酸）y=0.009 2x+0.009 6相關(guān)系數(shù)：R=0.998 0。從圖4可以看出，從 30-90 min之間PFTPs得率呈增加趨勢，在90-180 min時，PFTPs得率變化比較緩慢，隨著時間的延長三萜得率開始降低。因此，從節(jié)能經(jīng)濟的基礎(chǔ)上考慮，選用90 min為最佳提取時間。

圖3 提取次數(shù)對阿魏菇三萜類化合物（PFTPs）的影響

圖4 提取時間對阿魏菇三萜類化合物（PFTPs）的影響

2.3.3 乙醇濃度對阿魏菇三萜類化合物提取率的影響 標準曲線的線性回歸方程（齊墩果酸）：y=0.015 5x-0.003 1相關(guān)系數(shù)：R=0.995 9。圖5顯示，隨著乙醇濃度的增大，三萜得率也在逐漸增大，直到乙醇濃度為95%時，三萜得率最大，說明乙醇濃度對阿魏菇三萜得率的影響較大。

圖5 乙醇濃度對阿魏菇三萜類化合物（PFTPs）的影響

2.3.4 提取溫度對阿魏菇三萜類化合物提取率的影響 標準曲線的線性回歸方程（齊墩果酸）：y=0.0149x+0.0256，相關(guān)系數(shù)：R=0.9954。圖6顯示，溫度對PFTPs提取影響是顯著的；50℃-70℃時，隨著溫度升高得率增加；隨溫度升高（70℃-90℃），PFTPs得率反而下降。這可能是因為溫度較低時，三萜化合物不能充分浸出，得率較低；但溫度過高，又會使部分三萜化合物裂解，造成得率有所下降。因此選取70℃為PFTPs提取溫度。

圖6 提取溫度對阿魏菇三萜類化合物（PFTPs）的影響

2.3.5 微波輔助時間對阿魏菇三萜類化合物提取率的影響 標準曲線的線性回歸方程（齊墩果酸）y=0.011 5x+0.016 3，相關(guān)系數(shù)：R=0.995 8。圖7顯示，微波輔助15 min對阿魏菇三萜類化合物的提取影響較大。

圖7 微波輔助時間對阿魏菇三萜類化合物（PFTPs）的影響

2.3.6 超聲時間對阿魏菇三萜類化合物提取率的影響 標準曲線的線性回歸方程（齊墩果酸）：y=0.011 3x-0.007 3，相關(guān)系數(shù)：R=0.993 8。圖8顯示，超聲40 min時，PFTPs得率最高，隨著超聲和加熱時間的增多，使部分三萜裂解，三萜得率反而降低。因此確定超聲時間40 min為最佳。

圖8 超聲輔助時間對阿魏菇三萜類化合物（PFTPs）的影響

2.3.7 料液比對阿魏菇三萜類化合物提取率的影響 標準曲線的線性回歸方程（齊墩果酸）y=0.012 8x+0.054 3，相關(guān)系數(shù)：R=0.994 0。圖9顯示，在料液比為1∶20（g/mL），提取1次條件下，PFTPs得率最高，確定料液比為1∶20（g/mL）。

圖9 料液比例對阿魏菇三萜類化合物（PFTPs）的影響

2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝結(jié)果

經(jīng)多項式回歸分析得到一個關(guān)于響應(yīng)值（PFTPs提取率）與自變量關(guān)系的二價經(jīng)驗?zāi)Ｐ停汗?7個試驗點，確定阿魏菇三萜類化合物（PFTPs）最佳提取優(yōu)化工藝因素水平；試驗因素、設(shè)計水平取值如表1所示；響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面法設(shè)計與試驗結(jié)果

2.4.1 建立模型方程與顯著性檢驗 對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，進行顯著性檢驗。對X1：料液比（A）、X2：提取時間（B）、X3：提取溫度（C）與PFTPs提取率，由于方程變量間擬合度較差，需采用手動優(yōu)化的方法對回歸模型進行優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果見表4，經(jīng)優(yōu)化后的方程為：

表3 響應(yīng)曲面回歸方程參數(shù)及顯著性檢驗

表3中回歸方差分析顯著性檢驗結(jié)果表明，模型F值為591 7.07，P為0.000 1，表明模型顯著。變量一次項X1（料液比）、X2（提取時間）、X3（提取溫度），二次項（X12、X2

2），表明料液比、提取溫度、提取時間（超聲40 min后）以及三者相互作用對三萜提取率都具有顯著影響。模型可信度分析統(tǒng)計結(jié)果（表4）表明，模型的復(fù)相關(guān)校正系數(shù)R2為0.999 8，C.V%=0.16，擬合程度比較好，誤差小，由此得知回歸模型擬合程度很好，響應(yīng)曲面法適合應(yīng)用于PFTPs提取率的分析及預(yù)測。

表4 模型可信度分析的統(tǒng)計檢驗結(jié)果

2.4.2 響應(yīng)曲面圖分析 以阿魏菇三萜類化合物（PFTPs）提取率為響應(yīng)量，由兩兩自變量為坐標的3D圖和等高線圖直觀反映料液比、提取時間和提取溫度對PFTPs提取率的影響。

圖10-a和圖10-b為料液比與提取時間交互作用對PFTPs提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖；PFTPs提取率隨著料液比的增加而減小，隨著提取時間的延長先增大后減??；圖10-c和圖10-d為料液比與提取溫度交互作用對PFTPs提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖；PFTPs提取率隨著料液比的增大而減少，隨著提取溫度升高而減少?？赡苁且驗闇囟冗^高后使浸出的PFTPs又再次溶解。圖10-e和圖10-f為提取時間與提取溫度交互作用對PFTPs提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖；PFTPs提取率隨著提取時間的延長先增大后減小，隨著提取溫度升高而增大。結(jié)合響應(yīng)曲面圖及顯著性檢驗結(jié)果可知三因素對三萜提取率影響顯著大小依次為料液比＞提取溫度＞提取時間。

2.4.4 數(shù)據(jù)點分布圖分析 預(yù)測值與實際值數(shù)據(jù)點分布圖（圖11）顯示，數(shù)據(jù)點幾乎全部分布在一條直線上；綜上分析三萜回歸方程擬合度顯著，響應(yīng)面模型建立成功，具備很高的可行性與準確性。

2.4.5 阿魏菇三萜最佳優(yōu)化提取條件的驗證 通過對回歸方程的求解，三萜提取優(yōu)化工藝條件為：料液比為1∶18.79（%），提取溫度為75℃，超聲時間為21.67 min；在此條件下三萜提取率達到4.16%。經(jīng)實際條件修正，實驗驗證發(fā)現(xiàn)，以料液比：1∶19（g/mL），提取溫度：75℃，超聲40 min后提取時間：22 min，PFTPs最大提取率4.42%。

3 討論

本研究將提取的阿魏菇醇提物（PFECs）進行腫瘤細胞增殖抑制檢測，抗腫瘤效果較顯著，這與相關(guān)的研究報道結(jié)果相一致［27］，2004年，研究者發(fā)現(xiàn)阿魏菇粗提物能夠顯著抑制人肝癌細胞（QCY-7703，Q3），人胃癌細胞（MGC-823）等多種細胞株的增殖，并發(fā)現(xiàn)影響細胞表面蛋白受體分子fas基因的mRNA水平表達。本研究的前期實驗結(jié)果也同樣證實阿魏菇醇提物可以影響細胞周期及細胞凋亡蛋白水平的表達［22，28］。經(jīng)研究者發(fā)現(xiàn)，阿魏菇的抗腫瘤機制有可能通過提高機體免疫功能抑制腫瘤生長等途徑實現(xiàn)［29］。楊琳等［24］發(fā)現(xiàn)阿魏菇主要通過增大免疫器官指數(shù)、激活巨噬細胞和T、B淋巴細胞、增強紅細胞免疫功能、誘生細胞因子等途徑，在提高機體免疫功能方面發(fā)揮重要作用。本研究也發(fā)現(xiàn)富含多糖的阿魏菇粗提物可顯著調(diào)節(jié)小鼠機體免疫，刺激TNF-α，CD40等因子水平［25］，但阿魏菇抗腫瘤的分子作用機制仍需要深入探討。目前阿魏菇醇溶性部位有效成分的提取及功能作用研究報道較少，根據(jù)阿魏菇乙醇、酸性乙醇溶液預(yù)試驗初步鑒定，阿魏菇醇溶性部位中存在三萜類等物質(zhì)；因此推測阿魏菇醇提物的抗腫瘤作用可能是由于萜類、生物堿等物質(zhì)在醇提物中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

預(yù)實驗結(jié)果表明傳統(tǒng)提取方法提取阿魏菇三萜類化合物（PFTPs）存在提取率低，活性差等特點。隨著新技術(shù)的發(fā)展，多種新型浸提方法如超聲輔助提取法［30，31］、微波輔助提取法［32］、超臨界流體萃取法［33］等被采用。超聲輔助浸提法是其中一種高效、成本低廉，簡單有效的技術(shù)方法，文獻報道它在提取工藝過程中可顯著增加提取成分得率，縮短提取時間，提高產(chǎn)量［34］，對提取物中不穩(wěn)定物質(zhì)損傷小，避免活性組分的降解［35，36］。因此本研究在維持醇溶組份活性穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，對阿魏菇醇溶性部位三萜類化合物（PFTPs）進行超聲輔助、微波輔助提取優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)超聲輔助效果較好，提取率較高；提取是研究中草藥等物質(zhì)活性組分的關(guān)鍵步驟。由于醇溶性部位的提取存在著提取率低，含量少的問題，結(jié)合響應(yīng)曲面法提取優(yōu)化工藝，對PFTPs進行了優(yōu)化提取，獲取最大提取率，保證了后續(xù)試驗的順利進行。阿魏菇醇提物的功效檢測及三萜類化合物（PFTPs）的提取優(yōu)化不僅篩選出阿魏菇顯著的生物活性物質(zhì)作用部位，也為深入研究其抗腫瘤作用分子機制奠定理論基礎(chǔ)；但仍需要對阿魏菇三萜類化合物的分離純化及功效驗證進一步深入研究。

圖10 響應(yīng)值與三個因素之間的響應(yīng)面圖（3D圖）和曲線圖（2D）

圖11 響應(yīng)面數(shù)據(jù)點圖（預(yù)測響應(yīng)值與實際檢測值的比較）

4 結(jié)論

初步證實阿魏菇醇提取物的抗氧化、抗腫瘤功效；通過氯仿-濃硫酸試驗初步鑒定阿魏菇中含有三萜類化合物；并采用超聲輔助提取法提取優(yōu)化三萜類化合物的最佳提取工藝條件為：提取溫度75℃、提取時間為22 min（超聲40 min后）、料液比為1∶19（g/mL），在此條件驗證結(jié)果為：三萜類化合物提取率為4.42%。

［1］Wu C, Zhang RL, Li HY, et al. Triterpenoid saponins from the root bark of Schima superba and their cytotoxic activity on B16 melanoma cell line［J］. Carbohydrate Research, 2015, 413：107-114.

［2］Li HF, Wang XA, Xiang SS, et al. Oleanolic acid induces mitochondrial-dependent apoptosis and G0/G1 phase arrest in gallbladder cancer cells［J］. Drug Design, Development and Therapy, 2015, 9：3017-3030.

［3］Li H, Wang XY, Wang XY, et al. Two new triterpenoid saponins from the aerial parts of Anemone taipaiensis［J］. Journal of Asian Natural Products Research, 2015, 17（5）：576-585.

［4］Zhang HY, Wang YW, Zhu PQ, et al. Design, synthesis and antitumor activity of triterpenoid pyrazine derivatives from 23-hydroxybetulinic acid［J］. European Journal of Medicinal Chemistry, 2015, 97：235-244.

［5］Li Y, Yang J, et al. Ilexgenin A inhibits endoplasmic reticulum stress and ameliorates endothelial dysfunction via suppression of TXNIP/NLRP3 inflammasome activation in an AMPK dependent manner［J］. Pharmacological Research, 2015, 99：101-115.

［6］Zong JF, Wang RL, Bao GH, et al. Novel triterpenoid saponins from residual seed cake of Camellia oleifera Abel show anti-proliferative activity against tumor cells［J］. Fitoterapia, 2015, 104：7-13.

［7］Liu CD, Dunkin D, Lai J, et al. Anti-inflammatory effects of ganoderma lucidum triterpenoid in human Crohn's disease associated with downregulation of NF-κB signaling［J］. Inflammatory Bowel Diseases. 2015, 21（8）：1918-1925.

［8］Guo ZK, Yang T, Cai CH, et al. A new apotirucallanetype triterpenoid from Atalantia buxifolia［J］. Journal of Asian Natural Products Research, 2015, 28：1-6.

［9］Wang YY, Zhang CY, Ma YQ, et al. Therapeutic effects of C-28 methyl ester of 2-cyano-3, 12-dioxoolean-1, 9-dien-28-oic acid（CDDO-Me；bardoxolone methyl）on radiation-induced lung inflammation and fibrosis in mice［J］. Drug Design, Development and Therapy, 2015, 9：3163-3178.

［10］Probst BL, Trevino I, et al. RTA 408, a novel synthetic triterpenoid with broad anticancer and anti-inflammatory activity［J］. PLoS One, 2015, 21：10（4）：e0122942.

［11］Wang T, Wei ZF, Dou YN, et al. Intestinal interleukin-10 mobilization as a contributor to the anti-arthritis effect of orally administered madecassoside：a unique action mode of saponin compounds with poor bioavail ability［J］. Biochemical Pharmacology, 2015, 94（1）：30-38.

［12］Yang WS, Ko J, et al. 21-O-angeloyltheasapogenol E3, a novel triterpenoid saponin from the seeds of tea plants, inhibits macrophagemediated inflammatory responses in a NF-κB-dependent manner［J］. Mediators of Inflammation, 2014, 2014：658351.

［13］Feng SM, Luo ZS, Zhang YB, et al. Phytochemical contents and antioxidant capacities of different parts of two sugarcane（Saccharum officinarum L. ）cultivars［J］. Food Chemistry, 2014, 151：452-458.

［14］Liu X, Zhu LC, Tan J, et al. Glucosidase inhibitory activity and antioxidant activity of flavonoid compound and triterpenoidcompound from Agrimonia Pilosa Ledeb［J］. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2014, 14：12.

［15］Zhang YN, Song M, Ng TB, et al. Purification and characterization of antioxidant components from the fruiting bodies of Pleurotus abalonus including 9-beta-d-ribofuranosidoadenine, 5'-deoxy-5'-（methylthio）adenosine, and atriterpenoid［J］. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2013, 36（2）：689-696.

［16］Yuan HB, Meng SH, Wang GZ, et al. Hypoglycemic effect of triterpenoid-rich extracts from Euryale ferox shell on normal and streptozotocin-diabetic mice［J］. Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 2014, 27（4）：859-864.

［17］Qin JH, Ma JZ, Yang XW, et al. A triterpenoid inhibited hormoneinduced adipocyte differentiation and alleviated dexamethasoneinduced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes［J］. Natural Products and Bioprospecting, 2015, 5（3）：159-166.

［18］Koneri RB, Samaddar S, et al. Antidiabetic activity of a triterpenoid saponin isolated from Momordica cymbalaria Fenzl［J］. Indian Journal of Experimental Biology, 2014, 52（1）：46-52.

［19］Singh S, Farswan M, Ali S, et al. Antidiabetic potential of triterpenoid saponin isolated from Primula denticulate［J］. Pharmaceutical Biology, 2014, 52（6）：750-755.

［20］Yuan HB, Gong ZB, Meng SH, et al. Hypoglycemic and hypolipidemic effects of a triterpenoid-rich extract from Euryale shell on streptozotocin-induced diabetic mice［J］. Pharmazie, 2013, 68（3）：227-231.

［21］Alam N, Yoon KN, Lee JS, et al. Consequence of the antioxidant activities and tyrosinase inhibitory effects of various extracts from the fruiting bodies of Pleurotus ferulae［J］. Saudi Journal of Biological Sciences, 2012, 19（1）：111-118.

［22］Wang WL, Chen KX, Liu Q, et al. Suppression of tumor growth by Pleurotus ferulae ethanol extract through induction of cell apoptosis, and inhibition of cell proliferation and migration［J］. PLoS One, 2014, 9（7）：e102673.

［23］Alam N, Yoon KN, Lee TS. Antihyperlipidemic activities of Pleurotus ferulae on biochemical and histological function in hypercholesterolemic rats［J］. Journal of Research in Medical Sciences, 2011, 16（6）：776-786.

［24］楊琳, 鞏平, 王冬慧, 等. 阿魏菇增強免疫機制的研究進展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展, 2010, 20：3957-3959.

［25］Li JY, Wang XH, Wang WL, et al. Pleurotus ferulae water extract enhances the maturation and function of murine bone marrowderived dendritic cells through TLR4 signaling pathway［J］. Vaccine, 2015, 33（16）：1923-1933.

［26］Pensec F, P?czkowski C, Grabarczyk M, et al. Changes in the triterpenoid content of cuticular waxes during fruit ripening of eight grape（Vitis vinifera）cultivars grown in the Upper Rhine Valley［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62（32）：7998-8007.

［27］王為蘭, 陳開旭, 鄭秀芬, 等. 阿魏菇藥理功能的研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41（21）：8827-8828, 8831.

［28］宋旭紅, 張月明, 劉金寶, 等. 新疆阿魏菇粗提物抗腫瘤效應(yīng)研究［J］. 營養(yǎng)學(xué)報, 2004, 26（2）：127-130.

［29］王冬慧, 鞏平, 楊琳, 等. 阿魏菇抗腫瘤作用的研究進展［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2010, 18（11）：2271-2273.

［30］Yang XD, Wu X, Hu LC, et al Effect of different solvents on extraction of effective components from Ligusticum chuanxiong［J］. Chin J Chin MaterMed, 2012, 37：1942-1945.

［31］Sun YY, Wang WH. Ultrasonic extraction of ferulic acid from Ligusticum chuanxiong［J］. J Chin Chem Eng, 2008, 39：653-656.

［32］Chi YS, Zhang ZD, Li CP, et al. Microwave-assisted extraction of lactones from Ligusticum chuanxiong Hort. using protic ionic liquids［J］. Green Chem, 2011, 13：666-670.

［33］Zhu JX, He W, Li Y, et al. Optimization extraction processes of ligustilide from Chuanxiong using RSM［J］. Chin Tradit Pat Med, 2011, 33：2172-2175.

［34］Yan YL, Yu CH, Chen J, et al. Ultrasonic-assisted extraction optimized by response surface methodology, chemical composition and antioxidant activity of polysaccharides from Tremella mesenterica［J］. Carbohydrate Polymers, 2011, 83：217-224.

［35］Chen XP, Wang WX, Li SB, et al. Optimization of ultrasoundassisted extraction of Lingzhi polysaccharides using response surface methodology and its inhibitory effect on cervical cancer cells［J］. Carbohydrate Polymers, 2010, 80：944-948.

（責任編輯 馬鑫）

Antitumor Activity of the Ethanol Extract of Pleurotus ferulae and the Extraction Procedure of Triterpenoid Components

WANG Wei-lan CHEN Kai-xu LIU Jun DUAN Wei-wei XU Ya-nan ZHANG Fu-chun
（Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

This work aims to explore the antitumor activity of alcohol soluble components from Pleurotus ferulae（PFECs），and to optimize the extraction condition of triterpenoids from P. ferulae（PFTPs）for maximum extraction yield. MTT was used to detect the inhibitory activity of PFECs to 5 kinds of tumor cells，no significant inhibition to 2 kinds of normal cells was observed. Ultrasonic-assisted，hot-water leaching with ultrasonic-assisted，single-factor experiment，and response surface methodology were jointly employed to optimize the extraction process of PFTPS. The results showed that PFECs presented significant antitumor activity. The optimal process parameters for the PFTPs extraction were：the ratio of ethanol to material 1∶19（g/mL），extraction time 22 min and extraction temperature 7℃，and the extracting yield of PFTPs was 4.42%.

Pleurotus ferulae；ethanol extracts；active components；antitumor activity；triterpenoids；optimization of extraction；response surface methodology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.030

2015-07-14

國家自然科學(xué)基金項目（31260267），新疆自治區(qū)動物學(xué)重點學(xué)科資助（2011001），新疆大學(xué)天山學(xué)者特聘教授科研項目資金，新疆生物資源基因工程重點實驗室開放課題（XJDX0201-2014-08），新疆大學(xué)博士啟動資金項目（210-61287）

王為蘭，女，博士，研究方向：功能性食品的開發(fā)與應(yīng)用，E-mail：wwlbiology@163.com

劉軍，男，博士，研究方向：功能性食品的開發(fā)與應(yīng)用，E-mail：105506757@qq.com；張富春，男，博士，研究方向：生物資源的開發(fā)及分子生物學(xué)，E-mail：zfcxj@sina.com