李偉劉春黃小惠史世鵬

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丙酮酸激酶M2在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)研究及臨床意義

李偉①劉春①黃小惠①史世鵬①

【摘要】目的：探討丙酮酸激酶M2（PKM2）在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其意義。方法：應(yīng)用免疫組化SP法，分別檢測50例膀胱尿路上皮細(xì)胞癌組織及15例正常膀胱組織中PKM2的表達(dá)，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果：PKM2在膀胱尿路上皮癌組織及正常膀胱組織中的陽性表達(dá)率分別為94.0% （47/50）和13.3%（1/15），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著膀胱尿路上皮癌病理分級及臨床分期的增高，PKM2的表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：PKM2在膀胱尿路上皮癌組織表達(dá)明顯高于非癌組織，表明其在膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，與膀胱尿路上皮癌的分期、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】能量代謝； 膀胱尿路上皮癌； 丙酮酸激酶M2； 免疫組化

①山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 山西 太原 030001

First-author’s address：The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其中以尿路上皮癌（TCC）最為常見。膀胱尿路上皮癌多見于中老年人，近年發(fā)病率有上升趨勢，其主要治療手段以手術(shù)為主，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高［1］。有文獻(xiàn)［2］報(bào)道，低中級別病患在經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后1年復(fù)發(fā)率為20%～40%，高級別的尿路上皮癌術(shù)后1～2年復(fù)發(fā)率可高達(dá)90%左右。目前，膀胱癌的診斷、術(shù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測主要依賴于膀胱鏡及尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查，膀胱鏡檢查為診斷膀胱癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但為侵入性操作有一定的創(chuàng)傷性，后者雖然特異性高且無創(chuàng)，但敏感性差，容易產(chǎn)生假陰性［3］。因此尋找敏感性及特異性均高的膀胱癌腫瘤標(biāo)記物作為膀胱腫瘤早期診斷、監(jiān)測及預(yù)后評估受到越來越多外界的關(guān)注。

丙酮酸激酶（PK）是細(xì)胞糖酵解反應(yīng)的關(guān)鍵酶，也是腫瘤細(xì)胞糖代謝異常的關(guān)鍵酶，丙酮酸激酶M2（PKM2）是丙酮酸激酶（PK）的同工酶之一，其在腫瘤細(xì)胞能量代謝過程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用［4］。目前研究證實(shí)，丙酮酸激酶M2（PKM2）水平的增高見于多種惡性腫瘤，已有研究證實(shí)，在胃癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、食管癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤患者的血漿、胸腔積液以及結(jié)腸癌患者的糞便中均檢測到PKM2含量的上升，是一種具有較好應(yīng)用前景的腫瘤標(biāo)記物［5］。本研究探討PKM2在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征間的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2012年1月-2014年12月本院50例膀胱尿路上皮癌患者的癌組織手術(shù)切除標(biāo)本，排除術(shù)前曾行放化療的患者，術(shù)后病理證實(shí)均為膀胱尿路上皮癌。其中男35例，女15例，年齡24～84歲，平均61歲。按1997年UICC修訂的膀胱癌TNM病理分期標(biāo)準(zhǔn)歸類，（1）分化類型：高分化19例，中分化14例，低分化17例；（2）臨床TNM分期：Ta～T1期者（非肌層浸潤性膀胱癌）33例，T2～T4期者（肌層浸潤性膀胱癌）17例。另取15例正常膀胱組織黏膜作對照組。

1.2試劑 兔抗人PKM2單克隆抗體及SP免疫組化試劑盒均購自博士德公司，一抗以1∶100稀釋使用，步驟按說明書。DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。其他試劑取自山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院病理教研室。

1.3免疫組織化學(xué)染色方法 標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，先行HE染色確定，選取無出血、無壞死區(qū)域，4 μm厚度組織連續(xù)切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，水化后在含1% H2O2的甲醇中浸泡10 min以阻斷內(nèi)源酶，枸櫞酸鹽微波高壓抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗過后加入用0.01 mol/L PBS稀釋至1∶100的一抗——抗M2-PK抗體，室溫下孵化60 min，二抗及過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素親和素抗體于37 ℃溫箱孵育30 min，PBS液洗滌3次，DAB底物顯色，蘇木素復(fù)染核，梯度酒精脫水，樹脂膠封片，顯微鏡下觀察。用PBS液代替一抗作陰性對照。

1.4結(jié)果判定 免疫組化染色PKM2主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿，陽性著色為棕黃色顆粒狀，染色愈濃代表陽性表達(dá)愈強(qiáng)。由2名病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片的方式來評估免疫組化的結(jié)果。結(jié)果評定：根據(jù)陽性染色區(qū)域所占總區(qū)域的百分比分別計(jì)分：0分（0），1分（1%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%）和4分（76%～100%）。根據(jù)染色的程度不同分別計(jì)分：0分（陰性，無染色），1分（弱陽性，淺黃色），2分（中等陽性，棕黃色）和3分（強(qiáng)陽性，棕褐色）。兩者分值相加為最終分值（0～7分不等）：≤1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為中等陽性（++），6～7分為強(qiáng)陽性（+++）。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)將（-）和（+）計(jì)為陰性，將（++）和（+++）計(jì)為陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有資料均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用 X2檢驗(yàn)或四格表矯正 X2檢驗(yàn)，以及Fisher’s精確概率法檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PKM2在膀胱尿路上皮癌組織及正常膀胱黏膜組織中的表達(dá) 免疫組化染色PKM2主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿（圖1），棕黃色顆粒狀為陽性著色。PKM2在膀胱尿路上皮癌組織及正常膀胱組織中的陽性表達(dá)率分別為94.0%（47/50）和13.3%（1/15）。膀胱尿路上皮癌組織中PKM2陽性表達(dá)率明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　PKM2在正常膀胱組織黏膜及膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)（400×）

2.2PKM2的表達(dá)與患者臨床病理因素的關(guān)系 50例膀胱尿路上皮癌患者中，男性組中PKM2陽性表達(dá)率為57.7%（20/35），女性組中PKM2陽性表達(dá)率為88.0%（8/15），兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2=0.13，P＞0.05）；65歲以下組中的PKM2陽性表達(dá)率為62.0%（16/26），65歲以上組中PKM2陽性表達(dá)率為50.0%（12/24），兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2=0.67，P＞0.05）；組織學(xué)分級為Grade I 中PKM2陽性表達(dá)率為35.2%（6/17），Grade Ⅱ～Ⅲ中陽性表達(dá)率為66.7%（22/33），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2=4.48，P＜0.05）；臨床分期為Ta～T1期組中PKM2陽性表達(dá)率為42.4%（14/33），臨床分T2～T4期期組中PKM2陽性表達(dá)率為82.4% （14/17），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2=7.26，P＜0.05）。

3　討論

有關(guān)腫瘤代謝的研究始于1920年，德國生物化學(xué)家Warburg首次發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中存在的特殊代謝方式——腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)換大量的葡萄糖變?yōu)槿樗?，即使在氧存在的情況下。而正常分化組織細(xì)胞只有在缺氧的情況下才會進(jìn)行糖酵解反應(yīng)，即消耗葡萄糖，產(chǎn)生乳酸，這一理論被稱為Warburg效應(yīng)或有氧糖酵解［6-7］。丙酮酸激酶（PK）是糖酵解中的關(guān)鍵酶，也是腫瘤細(xì)胞糖代謝異常的關(guān)鍵酶，丙酮酸激酶催化其底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）去磷酸化生成丙酮酸及ATP。PK主要有4種同工酶，由于組織的不同代謝功能，不同的丙酮酸激酶同工酶在它們的動力學(xué)特征及調(diào)控機(jī)制上有很大的不同。PKM-L主要在糖異生表達(dá)活躍的組織中表達(dá)，如肝、腎和腸，PKM-L的表達(dá)受營養(yǎng)調(diào)控，在富含碳水化合物的飲食當(dāng)中增強(qiáng)；PKM-R被發(fā)現(xiàn)在紅細(xì)胞中表達(dá)，它和PKM-L的動力學(xué)特征和調(diào)控機(jī)制上非常相似；PKM1表達(dá)于需要提供大量能量及耗氧量大的組織中，如肌肉和腦；PKM2被表達(dá)于某些分化組織當(dāng)中，如脂肪組織、肺、視網(wǎng)膜、胰島等，并且是所有具有高比率核酸合成的細(xì)胞的特征同工酶，即所有增殖的細(xì)胞，如胚胎細(xì)胞、成體干細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞［8-9］。在胚胎發(fā)育過程中，PKM2同工酶逐漸被相應(yīng)的組織特異性同工酶所替代，相反，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，PKM2的表達(dá)逐漸上升，并取代組織中原有的同工酶類型，如L-PK在肝臟或M1-PK在大腦的消失和M2-PK同工酶開始表達(dá)［10］。PEP的親和力和M2-PK同工酶的酶活性依賴于酶的四級結(jié)構(gòu)并通過代謝中間體和原癌基因進(jìn)行調(diào)節(jié)［6-7］。

PKM2有四聚體及二聚體兩種不同的構(gòu)象，并且在癌細(xì)胞當(dāng)中PKM2四聚體與二聚體可以相互轉(zhuǎn)換。PKM2兩種構(gòu)象的動力學(xué)特征表明，四聚體形式的特征在于它對它的底物PEP有很高的親和力，而二聚體形式對PEP的親和力則很低，在生理狀態(tài)下的PEP濃度只有四聚體形式是高活性的，而二聚體幾乎不活動［11］。PKM2四聚體對PEP的高親和力以及它和其他糖酵解酶類緊密的空間鄰近關(guān)系，使得它能高度有效的將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸。但在腫瘤細(xì)胞中PKM2被發(fā)現(xiàn)主要以幾乎無活性的二聚體形式存在［12］。因此，有推測表明當(dāng)PKM2在腫瘤細(xì)胞當(dāng)中以二聚體形式存在時(shí)，高PKM2表達(dá)導(dǎo)致葡萄糖代謝主要用于生物大分子的合成，而不是用于氧化代謝能源的產(chǎn)生，這促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長［13］。近年來研究表明，PKM2翻譯后修飾（包括脯氨酸羥基化、賴氨酸乙?；?、酪氨酸磷酸化、半胱氨酸氧化和泛素化）在癌癥的代謝及細(xì)胞的發(fā)展當(dāng)中起到至關(guān)重要的作用［14-18］。

PKM2二聚體又被稱為腫瘤PKM2，研究發(fā)現(xiàn)PKM2在多種惡性腫瘤當(dāng)中表達(dá)異常，部分研究表明PKM2的上升水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、分化、轉(zhuǎn)移、分期及預(yù)后密切相關(guān)［5］。本研究結(jié)果顯示，PKM2在TCC組織中的表達(dá)率正常膀胱組織明顯增高，并隨著分化程度的降低而表達(dá)增高。PKM2在臨床分期T2～T4（肌層浸潤性膀胱癌）組中的陽性表達(dá)率高于Ta～T1（非肌層浸潤性膀胱癌）組，有研究表明，PKM2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，而敲低PKM2可抑制腫瘤細(xì)胞的成瘤能力和生長速率［19］。

綜上，筆者推測PKM2的表達(dá)可能對膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。PKM2可能作為膀胱癌惡性程度的腫瘤標(biāo)記物。因本次實(shí)驗(yàn)未涉及到其他腫瘤標(biāo)記物，尚不能說明在膀胱癌中PKM2有最佳的敏感性，有待進(jìn)一步研究觀察，在膀胱尿路上皮癌中PKM2是否有必要與其他腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測，以提高其敏感性及特異性。

參考文獻(xiàn)

［1］那彥群，葉章群，孫穎浩.中國泌尿外科疾病診斷治療指南［M］.2014版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：21.

［2］Sylvester R J，van der Meijden A P，Ooster linck W，et al.Predicting recurrence and progress ion in individual patients with stage Ta-T1bladder cancer using EORTC risk tables：A combined analysis of 2596 patients from seven EORTC trials［J］.Eur Urol，2006，49（3）：466-477.

［3］Shelley M D，Mason M D，Kynaston H.Intravesical therapy for superficial bladder cancer： a systematic review of randomised trials and meta-analyses［J］.Cancer Treat Rev，2010，36（3）：195-205.

［4］Eigenbrodt E，Basenau D，Holthusen S，et al.Quantification of tumor type M2 pyruvate kinase （Tu M2-PK） in human carcinomas［J］.Anticancer Research，1997，17（4B）：3153-3156.

［5］詹成，時(shí)雨，王群.丙酮酸激酶M2型應(yīng)用于腫瘤診斷與治療研究進(jìn)展［J］.中華腫瘤防治雜志，2013，20（13）：1043-1046.

［6］Mazurek S.Pyruvate kinase type M2：A key regulator of the metabolic budget system in tumor cells［J］.International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2011，43（7）：969-980.

［7］Bayley J P，Devilee P.The Warburg effect in 2012 ［J］.Curr Opin Oncol，2012，24（1）：62-67.

［8］Clower C V，Chatterjee D，Wang Z，et al.The alternative splicing repressors hnRNP A1/A2 and PTB influence pyruvate kinase isoform expression and cell metabolism［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（5）：1894-1899.

［9］Mazurek S，Boschek C B，Hugo F，et al.Pyruvate kinase type M2 and its role in tumor growth and spreading［J］.Semin Cancer Biol，2005，15（4）：300-308.

［10］Bluemlein K，Grüning N M，F(xiàn)eichtinger R G，et al.No evidence for a shift in pyruvate kinase PKM1 to PKM2 expression during tumorigenesis［J］.Oncotarget，2011，2（5）：393-400.

［11］Mazurek S.Pyruvate kinase type M2：A key regulator within the tumour metabolome and a tool for metabolic profiling of tumours ［J］.Ernst Schering Found Symp Proc，2007，4（4）：99-124.

［12］Mazurek S，Zwerschke W，Jansen-Durr P，et al.Effects of the human papilloma virus HPV-16E7 on coprotein on glycolysis and glutaminolysis：Role of pyruvate kinase type M2 and the glycolytic-enzyme complex ［J］.Biochem J，2001，356（Pt 1）：247-256.

［13］Weibo L，Gregg L，Semenza G L.Emerging roles of PKM2 in cell metabolism and cancer progression.Trends in Endocrinology and metabolism［J］.November，2002，23（11）：560-566.

［14］Luo W，Hu H，Chang R，et al.Pyruvate kinase M2 is a PHD3-stimulated coactivator for hypoxia-inducible factor 1［J］.Cell，2011，145（5）：732-744.

［15］Zhao D，Lin R，Chu Y，et al.Acetylation targets the M2 isoform of pyruvate kinase for degradation through chaperone-mediated autophagy and promotes tumor growth［C］//“細(xì)胞活動 生命活力”——中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會全體會員代表大會暨第十二次學(xué)術(shù)大會論文摘要集，2011：719-730.

［16］Dimitrios A，George P，Asara J M，et al.Inhibition of pyruvate kinase M2 by reactive oxygen species contributes to cellular antioxidant responses［J］.Science，2011，334（6060）：1278-1283.

［17］Taro H，Sumin K，Heiden M G V，et al.Tyrosine phosphorylation inhibits PKM2 to promote the Warburg effect and tumor growth［J］.Science Signaling，2009，2（97）：ra73.

［18］Spoden G A，Dieter M，Daniela E，et al.The SUMO-E3 ligase PIAS3 targets pyruvate kinase M2［J］.Journal of Cellular Biochemistry，2009，107（2）：293-302.

［19］Dhar D K，Olde D S，Brinaley J H，et al.Pyruvate kinase M2 is a nocel diagnostic marker and predicts tumor progression in human biliary tract cancer［J］.Cancer，2013，119（3）：575-585.

Expression and Significance of Pyruvate Kinase M2 in Bladder Urothelial Carcinoma

LI Wei，LIU Chun，HUANG Xiao-hui，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：012-015

【Abstract】Objective：To study the expression and significance of PKM2 in bladder urothelial carcinoma.Method：The expression of PKM2 was detected by immunohistochemistry in tissue sections from 50 cases of bladder urothelial carcinoma and 15 cases of normal bladder mucosa，and their correlation with clinical data features were analyzed.Result：The PKM2 expression rate in bladder urothelial carcinoma and normal bladder tissues were 94.0% and 13.3%，the difference was statistically significant （P＜0.05）.With the increase of pathological grade and clinical stage in bladder urothelial carcinoma，the expression of PKM2 was increased，the difference was statistically significant （P＜0.05）.Conclusion：The expression of PKM2 was higher in the bladder urothelial carcinoma than those in the noncancerous bladder tissue，which indicates that it may play an important role during the development of bladder urothelial carcinoma.And relationship to bladder urothelial carcinoma pathological grade，clinical stage and metastasis.

【Key words】Energy metabolism； Bladder urothelial carcinoma； Pyruvate kinase M2；Immunohistochemical stain

通信作者：劉春

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.004

收稿日期：（2015-10-29） （本文編輯：蔡元元）