羅六龍，黃冬妮，黃良宗，馬春全，梁梓森（.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州5064；.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山583）

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廣東省豬流行性腹瀉病毒S1基因的克隆與序列分析

羅六龍1，2，黃冬妮1，2，黃良宗2，馬春全2，梁梓森1
（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山528231）

摘要：為研究廣東省豬流行性腹瀉病毒S1基因的變異情況，于2012-2013年間從廣東省不同地區(qū)豬場采集56份腹瀉病仔豬樣本。通過PCR方法擴(kuò)增到12個(gè)樣本的PEDV的S1基因序列，并進(jìn)行序列比對(duì)及遺傳分析。結(jié)果12個(gè)樣本PEDV的S1基因序列之間的核苷酸同源性為91.1%～99.6%，氨基酸的同源性為88.5%～99.1%。12個(gè)樣本PEDV的S1基因序列與國內(nèi)參考毒株核苷酸的同源性為91.0%～99.9%，氨基酸的同源性為88.5%～99.7%。與國外參考毒株核苷酸的同源性為89.0%～99.7%，氨基酸的同源性為86.5%～99.4%。與經(jīng)典毒株CV777的核苷酸同源性為91.0%～100.0%，氨基酸的同源性為88.3%～99.9%。其中，僅GD-HY的S1基因與CV777的同源性達(dá)100.0%，其他同源性較低。表明近年廣東省的PEDV流行毒株以變異株為主，與疫苗株（CV777）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；S1基因；序列分析

豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由冠狀病毒科，冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的豬的一種急性接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉、脫水和哺乳仔豬高死亡率為基本特征。我國自20世紀(jì)80年代以來陸續(xù)有本病的報(bào)道，2010年底開始，該病的流行區(qū)域和流行強(qiáng)度有不斷擴(kuò)大和增強(qiáng)的趨勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1］。豬流行性腹瀉病豬的糞便呈淡黃色或青黃色，體溫基本正常，癥狀的輕重程度隨日齡的大小而有所差異，往往日齡越小，癥狀越嚴(yán)重，病死率越高［3-4］。本研究于2012-2013年間從廣東省不同地區(qū)豬場采集56份腹瀉病仔豬樣本進(jìn)行PEDV檢測(cè)，從中擴(kuò)增出12個(gè)PEDV的S1基因序列，并對(duì)其進(jìn)行克隆和序列分析。

1　材料與方法

1.1病料采集從廣東省發(fā)生仔豬腹瀉病豬的不同地區(qū)不同規(guī)模豬場隨機(jī)采集了56份發(fā)病仔豬的小腸樣本。仔豬均在1周齡內(nèi)，發(fā)病時(shí)間2～5 d不等。

1.2主要試劑TRIZol、DNA Marker（DL-2 000）、PrimeScript One Step RT-PCR Kit、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒等，購自TaKaRa公司；氯仿、無水乙醇和異丙醇均為國產(chǎn)分析純。

1.3引物設(shè)計(jì)參照GenBank提供的PEDV經(jīng)典毒株CV777的S基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了2對(duì)引物［3］，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

S1-F：5′-ATTTGTGGCTTTTCTAACA-3′，

S1-R：5′-GCACCACTAGTGACATTCTT-3′；擴(kuò)增目的片段約為2 107 bp。

1.4病毒總RNA提取取腸道樣本經(jīng)研磨稀釋后12 000 r/min（4℃）離心10 min。吸取研磨組織上清液250 μL，加入750 μL的TRIZol，振蕩混勻，室溫靜置10 min。加入200 μL氯仿，混勻后室溫靜置5 min，12 000 r/min（4℃）離心10 min。緩慢吸取上清600 μL轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，加入等量異丙醇，-20℃靜置20 min，12 000 r/min （4℃）離心10 min，棄上清。加入1 mL的75%乙醇進(jìn)行洗滌，并于7 500 r/min（4℃）離心15 min，棄上清，超凈臺(tái)干燥20 min，用30 μL DEPC水溶解沉淀，-20℃保存。

1.5S1基因擴(kuò)增、克隆及測(cè)序反應(yīng)體系如下：PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μL，2×1 Step Buffer 25 μL，上、下游引物各1 μL，Template RNA 5 μL，RNase Free dH2O up to 50 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共循環(huán)35次；72℃終延伸10 min，16℃保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳進(jìn)行電泳檢測(cè)，回收目的片段并連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，將陽性菌株送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交到NCBI BLAST進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)用DNAStar和MEGA 5對(duì)獲得的12個(gè)S1基因序列進(jìn)行序列分析。

2　結(jié)果

被檢測(cè)的56份腸道樣本中有21份陽性樣品，陽性率37.5%，從中選出廣東省12個(gè)不同地區(qū)來源的陽性病料進(jìn)行S1基因擴(kuò)增，擴(kuò)增的S1基因片段大小約為2 107 bp（圖1）。測(cè)序結(jié)果獲得12個(gè)樣本PEDV的S1基因序列，命名為：GD-DG、GD-GM、GD-HY、GD-HZ、GD-JM、GD-MM、GDMZ、GD-NH、GD-QY、GD-SS、GD-YC、GD-ZQ。

圖1　豬流行性腹瀉病毒S1基因的PCR擴(kuò)增電泳圖M：DL-2 000 DNA Marker；1～12：S1基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；13：陰性對(duì)照

2.1S1基因的序列變化對(duì)12個(gè)樣本PEDV的S1基因序列與GenBank中登錄的部分PEDV的S1基因進(jìn)行比對(duì)分析［2-3］，利用DNAMAN軟件對(duì)12個(gè)樣本PEDV的S1基因序列與經(jīng)典毒株CV777進(jìn)行比對(duì)分析（12個(gè)樣本PEDV的S基因全長約4 150 bp，本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增到的S1基因長約2 107 bp，編碼約700個(gè)氨基酸）。結(jié)果顯示：與經(jīng)典毒株CV777相比，12個(gè)廣東病料樣本的S1基因的抗原表位區(qū)有多處核苷酸位點(diǎn)突變，氨基酸序列分析也顯示，被測(cè)樣本的S1蛋白的抗原表位區(qū)有多處氨基酸位點(diǎn)突變，GD-HY、GD-HZ、GD-MM 3個(gè)序列與CV777相似度較高，其余9個(gè)樣本的第84位由Y→H，第86位由D→R，第87、203位由S→G，第89位由Q→H，第120位由I→T，第130位由D→S，第131位由N→I，第138位由V→A，第161位由G→S，第163位由N→H，第164位由I→S，第179位由A→S，第184位由H→Y，第187位由I→F，第197位由R→K，第201位由K→S，第202位由R→G，第203位由S→G，第211位由T→E，其中第160位的D缺失等等。

2.2 S1基因的遺傳進(jìn)化用MEGA 5軟件進(jìn)行系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹分析（圖2），結(jié)果表明：PEDV毒株可分為3個(gè)群，而12個(gè)廣東病料樣本的S1基因序列中的9個(gè)屬于第3群，GD-MM、GD-HZ、GDHY這3個(gè)序列則屬于第1群。用DNAStar軟件對(duì)12個(gè)樣本S1基因序列與參考毒株的S1基因進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列的同源性比較分析，結(jié)果顯示：12個(gè)樣本PEDV的S1基因序列之間的核苷酸同源性為91.1%～99.6%，氨基酸的同源性為88.5%～99.1%。12個(gè)樣本PEDV的S1基因序列與國內(nèi)參考毒株S1核苷酸的同源性為91.0%～99.9%，其中，GD-YC的S1基因序列與CHS的核苷酸同源性最低，為91.0%，GD-HY的S1基因序列與CH4的核苷酸同源性最高，達(dá)99.9%。氨基酸的同源性為88.3%～99.7%，其中，GD-ZQ的S1基因序列與CH4的氨基酸同源性最低，為88.3%，GD-HY的S1基因序列與CH4的氨基酸同源性最高，達(dá)99.7%。與國外參考毒株S1基因核苷酸的同源性為89.0%～99.7%，其中，GD-HZ的S1基因序列與Chinju99的核苷酸同源性最低，為89.0%，GD-HZ的S1基因序列與83P-5的核苷酸同源性最高，達(dá)99.7%。氨基酸的同源性為86.5%～99.4%，其中，GD-HZ的S1基因序列與Chinju99的氨基酸同源性最低，為86.5%，GD-HY的S1基因序列與AmenutedDR13的氨基酸同源性最高，達(dá)99.4%。與經(jīng)典毒株CV777的S1核苷酸同源性為91.0%～100.0%，氨基酸的同源性為88.3%～99.9%。僅GD-HY的S1基因序列與CV777的核苷酸同源性為100.0%，氨基酸同源性為99.9%。

圖2　PEDV的S1基因分子進(jìn)化樹

3　討論

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）為單股正鏈RNA，主要包括S基因、ORF3基因、M基因等，S基因編碼PEDV的S蛋白。S蛋白是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，在免疫反應(yīng)中有識(shí)別靶細(xì)胞、使病毒和細(xì)胞膜融合的作用［4］。根據(jù)冠狀病毒I群成員S蛋白S1和S2亞基之間的保守基因序列，PEDV S蛋白可分為兩個(gè)功能區(qū)，即S1和S2［5］，其中S1區(qū)包含PEDV主要的中和抗原表位和受體結(jié)合域。為研究廣東流行毒株S1基因的變異情況，本次研究收集2012-2013年間來自廣東不同地區(qū)發(fā)生仔豬腹瀉的豬場糞便樣本56份，經(jīng)RT-PCR方法確定PEDV陽性樣本21份，陽性率為37.5%，未檢測(cè)到TGEV和RV，說明這些豬場的腹瀉以PEDV感染為主。

通過PCR方法擴(kuò)增出12個(gè)來自不同豬場的PEDV樣本的S1基因。結(jié)果表明，在S1基因的抗原表位區(qū)，樣本序列GD-HZ的第115、118、119、121、138、139、141、144、162、173、181、188位氨基酸由N→D、T→A、N→G、T→V、T→S、A→G、D→G、T→S、G→R、N→S、D→N、F→P；GD-ZQ的第116、190、192、241位氨基酸由G→D、N→H、W→R、A→V；GD-MZ的第116、178、241位氨基酸由G→D、V→I、A→V；GD-QY的第224、247位氨基酸由G→D、T→S；GD-MM的第89位氨基酸由G→S；GD-GM的第127位氨基酸由C→R；GD-JM的第138位氨基酸由T→S；GD-DG的第148位氨基酸由N→K；GD-YC的第255位氨基酸由E→D。這些氨基酸位點(diǎn)的變異均不同于以往毒株，其中GD-HZ毒株的抗原表位區(qū)變異位點(diǎn)最多，12個(gè)樣本PEDV的S1基因之間的核苷酸同源性為91.1%～99.6%，氨基酸的同源性為88.5%～99.1%。這些S1基因變異結(jié)果提示，近年廣東省的PEDV流行毒株以變異株為主，與疫苗株（CV777）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。S基因是PEDV決定抗原表位的主要基因之一，這些變異可能是當(dāng)前傳統(tǒng)疫苗免疫效果不理想的主要原因。同時(shí)，該部位基因的變異性較強(qiáng)，變異情況復(fù)雜，為今后疫苗免疫防控該病增加難度。未來工作更需重視研究PEDV的變異及生物學(xué)作用，將研制變異毒株的高效疫苗作為防治豬流行性腹瀉病的重點(diǎn)。

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Cloning and Sequenceanalysis of S1 genes of porcine epidemic diarrhea virus in Guangdong Province

LUO Liu-long1，2，HUANG Dong-ni1，2，HUANG Liang-zong2，MA Chun-quan2，LIANG Zi-sen1
（1.College of Veterinary Medicine，South china Agrversity，Guangzhou 510642，China；2.Foshan University，F(xiàn)oshan 528231，China）

Abstract：To investigate the S1 genetic variation of porcine epidemic diarrhea virus in Guangdong Province，56 piglet diarrhea samples were collected from swine farms in different areas.S1 gene sequences of 12 PEDV strains were amplified by PCR and compared with different strains to analyze the genetic characteristics and evolution regularity .Result showed that the 12 S1 genes shared 91.1%～99.6%nucleotide homology and 88.5%～99.1%amino acid homology.The 12 S1 genes shared 91.0%～99.9%nucleotide homologyand 88.5%～99.1%amino acid homology with Chinese reference strains . The 12 S1 genes shared 89.0%～99.7%nucleotide homology and 86.5%～99.4%amino acid homology with foreign reference strains . The 12 S1 genes shared 91.0%～100.0%nucleotide homology and 88.3%～99.9%amino acid homology with classic strain CV777.Only GD-HY shared 100.0%homology with classic strain CV777，while the rest of the 12 S1genes shared lower homology with CV777.The results implicate that variations of Guangdong PEDV strains have occurred in recent years，and they are distant with CV777.

Key words：Porcine epidemic diarrhea virus；S1 gene；Sequence analysis Corresponding author：MA Chun-quan

中圖分類號(hào)：S852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）03- 0019- 03

收稿日期：2014-12-29

基金項(xiàng)目：廣東省現(xiàn)代生豬產(chǎn)業(yè)體系項(xiàng)目；廣東高校畜禽疾病診斷防控技術(shù)開發(fā)中心（GCZX-B1102）；廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B020202002）

作者簡介：羅六龍（1991-），男，碩士生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)病理學(xué)，E-mail：395280165@qq.com

通訊作者：馬春全，E-mail：machunquan@263.net