王　璐　張　煒

(復旦大學附屬婦產科醫(yī)院生殖內分泌科　上?！?00011)

胚胎著床內膜中半乳凝素-3的表達變化及其在母胎界面與配體的共定位

王璐張煒△

(復旦大學附屬婦產科醫(yī)院生殖內分泌科上海200011)

【摘要】目的探討半乳凝素-3(galectin-3,gal-3)在小鼠胚胎著床子宮內膜中的表達及其與子宮內膜容受性標志分子整合素(integrin) β3的共表達定位。方法分別采用real-time PCR、Western blot和免疫熒光技術檢測比較小鼠著床位點及非著床部位gal-3 mRNA和蛋白的表達及其與配體整合素 β3、纖連蛋白(fibronectin,FN)的免疫熒光共定位表達。結果小鼠著床處gal-3 mRNA和蛋白表達高于非著床部位(P<0.01)，其在著床位點主要與整合素β3共定位表達,而與FN的共定位極少。結論gal-3在著床位點處高表達提示其在胚胎與子宮內膜著床的過程中扮演重要角色,且在著床處gal-3主要通過與整合素β3共表達參與胚胎著床。

【關鍵詞】半乳凝素-3;胚胎著床;整合素β3;纖連蛋白

胚胎著床是處于活化狀態(tài)的胚泡與處于容受態(tài)的子宮內膜間相互作用并進入子宮內膜的復雜過程。在著床過程中,包含了相當復雜的形態(tài)學、生理學和生物化學的變化,通過胚胎和子宮內膜間的一系列的分子對話和信號轉導,最終啟動著床。半乳凝素-3(galectin-3,gal-3)是相對分子質量為29 000～35 000的可溶性β-半乳糖苷結合蛋白,屬于半乳糖凝集素家族的一員。它廣泛分布于不同的細胞和組織中,主要通過與配體結合參與細胞的生長、黏附、侵襲、凋亡等過程,其配體包括整合素(integrin)和細胞外基質蛋白如層黏連蛋白、纖連蛋白(fibronectin,FN)等。研究表明gal-3在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移等方面發(fā)揮著重要的生物學作用[1]。近年來發(fā)現(xiàn)該分子與胚胎早期發(fā)育和著床過程有關。最早發(fā)現(xiàn)人妊娠早、晚期的絨毛滋養(yǎng)細胞及絨毛外滋養(yǎng)細胞的胚胎滋養(yǎng)層中均有gal-3表達。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)其在人的子宮內膜著床窗口期高表達,并參與調節(jié)子宮內膜的生物學功能[2];在子宮內膜異位癥患者在位內膜中發(fā)現(xiàn)gal-3表達降低。進一步的體外研究發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細胞與子宮內膜細胞的gal-3表達與分泌受雌、孕激素的影響,且細胞內及細胞外的gal-3通過不同整合素配體的作用誘導子宮內膜細胞的增殖、黏附和凋亡行為,從而調節(jié)子宮內膜的容受性建立。前期的研究結果都提示gal-3參與胚胎著床,但其在子宮內膜與胚胎界面間有怎樣的改變以及作用的分子通路仍需要進一步的研究。

材 料 和 方 法

實驗動物及主要試劑SPF級昆明小鼠購于上海實驗動物中心;芝加哥天藍購于美國Sigma公司;總RNA提取試劑盒購于美國Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒購于北京天根生化科技公司;real-time PCR試劑盒購于大連Takara公司;單克隆小鼠抗gal-3、多克隆兔抗(FN)、HRP二抗及Alexa647羊抗兔二抗購于美國Abcam公司;單克隆大鼠抗gal-3和單克隆美洲倉鼠抗整合素β3購于美國Millipore公司;Alexa555羊抗大鼠二抗購于美國CST公司;FITC羊抗美洲倉鼠二抗購于美國eBioscience公司。

實驗動物準備SPF級昆明小鼠,6～8周齡,體質量23～25 g,飼養(yǎng)溫度25 ℃,光照周期12/12。按雌雄比例3∶1合籠交配,次晨檢查陰栓,發(fā)現(xiàn)陰栓為妊娠D1。在D5晨8:00～11:00經(jīng)小鼠尾靜脈注射1% 芝加哥天藍,5 min后處死小鼠。在無菌條件下分別收集每只孕鼠的胚胎著床位點及非著床位點處組織,著床位點為芝加哥天藍染色處。而未孕小鼠同樣在無菌條件下收集子宮。從每只孕鼠一側子宮收集的標本迅速于-80 ℃凍存,另一側的標本經(jīng)固定和脫水后用OCT包埋,于-80 ℃保存。

real-time PCR檢測收集的標本利用Trizol法抽提組織總RNA。RNA提取后用0.01% DEPC水溶解,采用BioTek多孔酶標儀定量,逆轉錄成cDNA,按照熒光定量PCR方法進行基因的半定量分析。引物序列[3]:gal-3,上游5′-CAGGAAAATGGCAGACAGCTT-3′,下游5′-CCCATGCACCCGGATATC-3′;β-actin,上游5′-AGATTACTGCTCTGGCTCCT-3′,下游5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′。反應條件:95 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,29個循環(huán),末次循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

Western blot檢測將組織在RIPA和PMSF 裂解液中勻漿,冰上孵育30 min后高速離心,取上清即蛋白質溶液,BCA蛋白定量測定蛋白濃度。提取的蛋白質于-80 ℃保存。灌制SDS聚丙烯酰胺:15%分離膠和5%濃縮膠。取樣本蛋白50 μg加5×緩沖液混勻,95 ℃變性5 min,上樣。梯度蛋白作為分子量對照。濃縮膠電泳運行60 V,當?shù)鞍踪|進入分離膠后,把電壓加到120 V,繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部。切除濃縮膠后,將膠在轉移緩沖液中平衡15 min,剪取與分離膠大小相同的PVDF膜,用轉移緩沖液浸透>10 min。剪6塊大小相同的Whatman 3 mm濾紙用轉移液浸透。自下而上依次疊放3張濾紙、PVDF膜、凝膠、另外3張濾紙,穩(wěn)定電流270 mA轉移2 h。取出PVDF膜,0.1% PBST洗膜,放入5%封閉液中,室溫搖床震蕩1 h。將PVDF膜放入孵育盒,加入含單克隆小鼠抗小鼠gal-3(1∶1 000)和β-actin內參(1∶1 000)的封閉液,4 ℃震蕩過夜。取出PVDF膜,用PBST洗滌5 min×3次。將膜轉入另一孵育盒中,加入封閉液稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體(1∶3 000),室溫震蕩1 h,PBST洗滌20 min×3次。應用LI-COR Odyssey Infrared Imaging System掃描檢測,得出的IOD值經(jīng)內參β-actin校正后進行統(tǒng)計分析。

免疫熒光檢測用切片機將包埋好的組織塊切成厚度為4 μm的切片。用PBS洗去切片上OCT,放入盛有0.01 mol/L枸櫞酸鈉的容器中,98 ℃熱修復20 min,室溫冷卻,PBS洗5 min×3次。滴加10% 羊血清室溫封閉30 min。滴加一抗混合液，含有大鼠單克隆gal-3抗體(1∶200)、美洲倉鼠單克隆整合素β3抗體(1∶50)和兔多克隆FN抗體(1∶50)，4 ℃孵育過夜。PBS 洗去一抗, 10 min×3次,滴加二抗混合液，含有Alexa Fluor555羊抗大鼠IgG(1∶500)、FITC羊抗美洲倉鼠IgG(1∶100)和Alexa Fluor 647羊抗兔IgG(1∶200)，37 ℃孵育30 min。PBS洗去二抗,10 min×3次，滴加DAPI及抗熒光淬滅劑。用中性樹脂封片,利用Leica TCS SP5 MP共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光結果。

統(tǒng)計學處理采用單因素方差分析和LSD法檢驗兩組間均數(shù)的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

gal-3 mRNA在小鼠子宮著床位點與非著床位點的表達在小鼠子宮著床位點及非著床位點均可檢測到gal-3 mRNA的表達,且其表達明顯強于未孕小鼠子宮內膜(t=15.33和6.221,P<0.001)。著床位點gal-3 mRNA表達高于非著床位點,差異有統(tǒng)計學意義(t=8.645,P<0.001,圖1)。

(1)vs.Non-pregnancy,(2)vs. Implantation site.

圖1gal-3 mRNA 在小鼠子宮著床處與

非著床處的表達比較

Fig 1Gal-3 mRNA expressions in implantation site,

inter-implantation site and non-pregnant endometria

gal-3蛋白在小鼠子宮著床位點與非著床位點的表達在著床位點和非著床位點,早孕小鼠子宮內膜上gal-3蛋白表達均強于未孕小鼠(t=11.029,P<0.001;t=3.878,P<0.05),而gal-3蛋白在著床位點的表達量明顯高于非著床位點(t=8.30,P<0.001,圖2)。

(1)vs. Non-pregnancy,(2)vs. Implantation site.

圖2gal-3在小鼠子宮著床處與非著床處的蛋白表達

Fig 2gal-3 expression in implantation site,

inter-implantation site and non-pregnant endometria

gal-3 及其配體整合素β3、FN在小鼠子宮著床位點的共定位早孕小鼠子宮著床位點及非著床位點處均有gal-3及其配體整合素β3、FN的表達,gal-3及其配體整合素β3主要定位于子宮內膜上皮細胞,而FN則主要定位于間質細胞及胚胎。著床位點gal-3及整合素β3的表達明顯強于非著床位點,而FN的熒光強度在著床位點及非著床位點無明顯區(qū)別(圖3)。gal-3及整合素β3的共定位表達結果顯示，在著床位點子宮內膜上皮細胞多處可見兩者共表達,而整合素β3是gal-3的主要配體,說明兩者在著床位點處可能廣泛結合(圖4A)。但gal-3、整合素β3和FN的共定位結果則提示FN未參與gal-3和整合素β3的結合(圖4B)。

討論

gal-3是一種多功能分子,其主要與細胞表面的糖基化蛋白或細胞外基質糖蛋白結合,包括整合素、細胞外基質分子(extracellular matrix,ECM)、信號分子ras等,gal-3通過與配體結合發(fā)揮多種生物學功能,如細胞生長、增殖、黏附、遷移及凋亡等[4-5]。已在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)gal-3高表達,發(fā)現(xiàn)該基因主要參與腫瘤的發(fā)展和轉移。gal-3通過與相應配體結合促進腫瘤細胞的增長、抑制其凋亡,誘導腫瘤細胞轉移。而胚胎著床與腫瘤種植轉移在生物學行為方面有高度的相似性,只是前者是有節(jié)制的,而后者是失去控制的無限擴張。

gal-3是相對分子質量為29 000～35 000的可溶性β-半乳糖苷結合蛋白。其結構在gal家族中很獨特,1條多肽鏈形成2個不同的結構域:富含甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸殘基的重復性膠原樣序列和羧基末端的CRD[6-8]。羧基末端的CRD是gal-3作為凝集素家族的標志性結構域,同時也是其發(fā)揮凝集素活性與特定配體結合的結構域。gal-3廣泛分布于分布于細胞內外,參與調節(jié)細胞的生長、黏附、侵襲、凋亡等過程。

我們的前期研究利用抑制性差減雜交技術篩選出一些與子宮內膜容受性建立相關的基因,gal-3是其中之一[9],進一步研究發(fā)現(xiàn)其表達在分泌中期子宮內膜達最高峰,且定位于子宮內膜上皮細胞[2],由此我們就gal-3對子宮內膜容受性形成的影響進行了研究,發(fā)現(xiàn)gal-3對子宮內膜上皮細胞的增殖、黏附和凋亡具有調節(jié)作用。gal-3可影響子宮內膜細胞上整合素β3的表達,利用整合素β3抗體可阻斷gal-3對子宮內膜上皮細胞的增殖及黏附的作用,提示gal-3通過整合素β3通路可能激活了細胞增殖和黏附的調控信號,以調節(jié)子宮內膜的生長和黏附[10]。子宮內膜異位癥患者在位內膜上gal-3表達降低,子宮內膜異位癥是引起不孕的原因之一,其中gal-3表達下調可能使子宮內膜容受性建立不全,引起胚胎著床失敗[11]，進一步提示該分子與子宮內膜容受性形成密切相關。但gal-3在子宮內膜與胚胎界面間產生了怎樣的影響仍需要進一步的研究。因此,我們對gal-3及其配體在著床期母胎界面的表達及定位進行了深入研究。

本研究利用小鼠早期胚胎著床模型,在體研究了gal-3在著床位點和非著床位點的表達變化,首次揭示gal-3 mRNA及蛋白在孕小鼠子宮上表達增加,且著床部位的表達明顯高于非著床部位。gal-3可能在著床處內膜的容受性形成過程中扮演重要角色,它可能介導了著床局部子宮內膜與胚胎的黏附和植入。

胚胎著床過程首先由胚胎滋養(yǎng)細胞在子宮內膜上黏附,之后入侵并植入其中,母胎界面上的黏附分子相互作用介導母胎黏附。已證實整合素是與胚胎著床關系最為密切的一類黏附分子,研究發(fā)現(xiàn)其中的整合素13、v3、11在“著床窗口期”開放時表達,在“著床窗口期”關閉時消失,因此學者們普遍認為在胚胎和子宮內膜上皮細胞接觸早期,是整合素黏附分子和配體相互作用介導了母胎間的黏附,故整合素是調節(jié)子宮內膜容受性和胚胎著床的重要分子[12-14]。整合素和ECM都是gal-3的重要配體,同時整合素和ECM又互為配受體,gal-3可以與整合素/ECM單價結合抑制黏附,或雙價結合/多價結合形成多聚體復合物增強黏附;也可以改變整合素與ECM的親和力進而調節(jié)黏附;gal-3還可以調節(jié)整合素的表達和活性。那么,gal-3在著床位點的高表達是否通過整合素或ECM的分子通路調節(jié)母胎界面的黏附、侵襲和植入？為了探索gal-3在母胎界面作用的分子通路,我們觀察并比較了著床位點和非著床位點gal-3與配體整合素3、FN的免疫熒光共定位,結果顯示:gal-3與整合素3主要表達在著床期的子宮內膜上皮細胞,而FN則主要表達于間質細胞和胚胎上;gal-3與整合素3在著床位點的子宮內膜呈現(xiàn)大量的熒光共定位表達,強度遠超出非著床位點,但gal-3與FN的共定位表達無論在著床位點還是非著床位點都很少。gal-3與整合素β3而非FN共同在著床位點處介導母胎間對話,提示gal-3可能與整合素β3共同介導母胎間的黏附,參與內膜容受性的建立。

總之,gal-3在胚胎著床位點高表達提示其在胚胎著床位點處內膜容受性的建立中扮演重要角色,且gal-3及其配體整合素β3在著床位點處介導母胎間黏附。但gal-3與其配體整合素β3結合的具體機制和功能仍需進一步的研究。對gal-3的研究可能為某些原因引起的不孕的治療提供依據(jù),利用gal-3對著床過程的干擾也可能為計劃生育方法的研發(fā)提供新的思路。

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The expression change of galectin-3 and co-localization with its ligands in implantation site of endometrium

WANG Lu, ZHANG Wei△

(DepartmentofReproductiveEndocrinology,ObstetricsandGynecologyHospital,FudanUniversity,Shanghai200011,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the expression of galectin-3 (gal-3) in mouse′s implantation site of endometrium and the co-localization with integrin β3 ,which is the marker molecular molecular for the receptivity of endometrium.MethodsGal-3 mRNA and protein expressions were detected by real-time PCR and Western blot analysis.Immunofluorescence was used to detect the co-locatization of gal-3 and its ligands of integrin β3 and fibronectin(FN).ResultsCompared with inter-implantation site,gal-3 mRNA and protein expressions in mouse implantation site of endometrium were significantly increased (P<0.01).Moreover,the immunofluorescence intensity of the co-localization of integrin β3 and gal-3 was stronger in implantation site than that in inter-implantation site,while the co-localization of FN and gal-3 was very weak.ConclusionsGal-3 expresses highly in implantation site,and co-expresses with integrin β3 at maternal-fetal interface. It indicates that gal-3 plays an important role in the attachment between embryo and endometrium.

【Key words】galectin-3;embryo implantation;integrin β3;fibronectin

【中圖分類號】R321.3

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.03.008

(收稿日期:2015-08-18;編輯:段佳)

教育部博士點基金(20120071110074);上海市優(yōu)秀學術帶頭人計劃項目(12XD1401200)

△Corresponding authorE-mail:zhangwei623@hotmail.com

*This work was supported by the Ph.D Program Foundation of Ministry of Education,China (20120071110074) and the Program of Subject Chief Scientist of Shanghai (12XD1401200).