潘明潔　劉　懿　周乙華

210008 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院

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STAT4基因多態(tài)性與乙型肝炎病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌易感性的關(guān)系

潘明潔劉懿周乙華

210008 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院

【摘要】目的分析信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子4(STAT4)基因多態(tài)性與中國人群肝細(xì)胞癌(HCC)易感性的關(guān)系。方法154例乙型肝炎病毒(HBV)感染相關(guān)HCC為肝癌組，135例性別及年齡匹配的HBsAg陽性患者為非肝癌組。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法(PCR-RFLP)，檢測STAT4 rs7574865位點(diǎn)的基因型，并經(jīng)測序分析驗(yàn)證。Logistic回歸分析比較不同基因型與HCC易感風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。結(jié)果STAT4 rs7574865 位點(diǎn)3種基因型TT、GT、和GG型在肝癌組的分布頻率分別是5.8%(9/154)、37.0%(57/154)和57.1%(88/154)，在非肝癌組分別是8.9%(12/135)、43.7%(59/135)和47.4%(64/135)。各基因型在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；以TT基因型作參照，攜帶rs7574865 GG型的個(gè)體HCC患病風(fēng)險(xiǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.833，95%CI=0.729～4.611，P=0.221)。結(jié)論STAT4 rs7574865多態(tài)性位點(diǎn)可能與中國人群HBV感染相關(guān)HCC易感性無明顯相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】肝細(xì)胞癌；乙型肝炎病毒；信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子4；單核苷酸多態(tài)性

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:704～706)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國常見惡性腫瘤[1]。文獻(xiàn)報(bào)道信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子4(signal transducer and activators of transcription 4，STAT4)單核苷酸多態(tài)性與多種自身免疫性疾病相關(guān)如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和原發(fā)性膽汁性肝硬化等[2]。Jiang等[3]全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)STAT4 rs7574865與HCC易感性有關(guān)，rs7574865位點(diǎn)G等位基因使HBV并發(fā)的HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。本文探討STAT4 rs7574865多態(tài)位點(diǎn)與慢性HBV感染并發(fā)HCC易感性的關(guān)系。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源

研究對(duì)象包括154例乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)陽性肝癌患者和135例HBsAg陽性非肝癌患者。肝癌組來自2008年11月至2013年4月南京鼓樓醫(yī)院肝膽外科住院治療的經(jīng)臨床和影像學(xué)和(或)病理診斷確診為HCC的患者。非肝癌對(duì)照組為年齡及性別匹配的無腫瘤病史的HBsAg陽性者。所有研究對(duì)象均為漢族。

1.2方法

1.2.1基因組DNA 提取研究對(duì)象外周血分離白細(xì)胞，白細(xì)胞經(jīng)蛋白酶K在55℃消化3 h。用酚/氯仿2次抽提DNA，無水乙醇沉淀獲得基因組DNA，提取的DNA用TE溶解。紫外分光光度計(jì)檢測DNA含量，放置-20℃冰箱保存。

1.2.2STAT4基因rs7574865 G>T 位點(diǎn)多態(tài)性分析

應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)對(duì)STAT4 rs7574865位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。根據(jù)參考文獻(xiàn)[4-7]合成引物，引物序列為：上游引物5′-AAA GAA GTG GGA TAA AAA GAA GTTTG-3′，下游引物5′-CCA CTG AAA TAA GAT AAC CAC TGT-3′，PCR擴(kuò)增片段為147 bp。

PCR反應(yīng)體系總體積50 μL，內(nèi)含基因組DNA 100 ng，dNTP 2.5 mmol/ L，10×PCR 緩沖液(包含Mgcl2)5 μL，Taq酶2 U，上、下游引物各10 pmol。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切體系總體積10 μL，PCR產(chǎn)物5 μL，加入Hpa I內(nèi)切酶2U(NEB，北京)37 ℃水浴2 h后，用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后在紫外燈下判斷結(jié)果。酶切分型之后每種基因型各取3例PCR產(chǎn)物，DNA純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)純化后測序(ABI 3130，Applied Biosystems)，驗(yàn)證酶切方法的準(zhǔn)確性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入與統(tǒng)計(jì)分析?；蛐秃偷任换蚍植碱l率、研究對(duì)象是否符合Hardy-Weinberg 平衡采用四格表χ2檢驗(yàn)，Logistic單因素回歸分析計(jì)算比值比(odds rations，OR)，95%可信區(qū)間(CI)比較不同基因型與HCC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性意義。

2結(jié)果

2.1肝癌組和非肝癌組一般情況比較

肝癌組154例，其中男性 131例(85.1%)，女性23例(14.9%)；平均年齡(51.62±10.94)歲。非肝癌組135例，其中男性109例(80.7%)，女性26例(19.3%)；平均年齡(51.94±12.90)歲。兩組的性別構(gòu)成比、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2STAT4 rs7574865多態(tài)性位點(diǎn)等位基因及基因型分布頻率與HCC的關(guān)系

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小符合，酶切圖譜清晰。基因型G/G純合子酶切片段為147 bp； T/T純合子為122 bp和25 bp兩條帶；G/T雜合子酶切片段應(yīng)為147 bp、122 bp和25 bp三條帶，但25 bp片段已經(jīng)跑出膠外，因此電泳圖可見兩條帶(圖1)。每種基因型各取3例PCR產(chǎn)物測序，序列分析與酶切結(jié)果一致，證實(shí)酶切方法準(zhǔn)確，結(jié)果可靠。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，STAT4 基因rs7574865在非肝癌對(duì)照組的基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)，選取的標(biāo)本具有人群代表性。

M為Marker；1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2為T/T基因型；3為G/T

STAT4 rs7574865位點(diǎn)的3種基因型檢測結(jié)果見表1。T/T、G/T、和G/G基因型在肝癌組的分布頻率分別為5.8%(9/154)、37.0%(57/154)和57.1%(88/154)，在非肝癌組分別為8.9%(12/135)、43.7%(59/135)和47.4%(64/135)。各種基因型兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。等位基因T和G在肝癌組中的頻率分別為24.4%(75/308)和75.6% (233/308)，對(duì)照組中頻率分別為30.7%(83/270)和69.3%(187/270)，等位基因分布頻率兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.016，P=0.221)。

單因素Logistic回歸分析顯示，STAT4 rs7574865位點(diǎn)各基因型與HCC患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.223)。進(jìn)一步調(diào)整年齡及性別影響因素后其差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.218)。STAT4 rs7574865位點(diǎn)多態(tài)性可能與HCC易感無關(guān)。

表1　兩組STAT4 rs7574865基因型及等位基因分布(例，%)

3討論

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是指基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，人群中的發(fā)生頻率大于1%，是人類可遺傳的變異中最常見的一種。相關(guān)基因的單核甘酸多態(tài)性可影響基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，導(dǎo)致疾病易感性的差異[8]。本研究分析STAT4基因單核苷酸多態(tài)性多態(tài)性與中國人群HCC易感性的關(guān)系。

信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transciption，STAT)是一組能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，有40多種細(xì)胞多肽物質(zhì)可與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，從而引發(fā)胞漿中的STATs的激活。STAT4編碼的轉(zhuǎn)錄因子參與了多種重要細(xì)胞因子如IL-12、IFN-α/β和IL-23的信號(hào)傳導(dǎo)過程。 IL-12、IFN-α/β通過STAT4的信號(hào)傳導(dǎo)刺激幼稚CD4+ T細(xì)胞向Th1分化，刺激Th1產(chǎn)生IFN-γ[9]。IFN-γ是多效性細(xì)胞因子，在宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用[10]。STAT4基因多態(tài)性消弱IFN-γ的活性，從而可能降低機(jī)體抗病毒和抗腫瘤活性[11]，過表達(dá)IFN-γ可能導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[12]。

Jiang等[3]三階段包括七組病例對(duì)照(HBV感染并發(fā)肝癌+慢性HBV攜帶者)人群全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)STAT4 rs7574865位點(diǎn)G等位基因與HBV并發(fā)的HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=1.22，95%CI=1.15 ～1.29，P=1.66×10-11)。而且SNP rs7574865 GG基因型STAT4 mRNA在HCC腫瘤組織和非腫瘤組織的表達(dá)水平低于TG基因型和TT基因型，這與文獻(xiàn)報(bào)道STAT4 rs7574865 G等位基因降低各種自身免疫性疾病風(fēng)險(xiǎn)相一致，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和原發(fā)性膽汁性肝硬化等[2]。本研究發(fā)現(xiàn)rs7574865 GG基因型與HCC易感性無關(guān)，雖然GG基因型在肝癌組的頻率高于非肝癌組，增加HCC風(fēng)險(xiǎn)的趨勢與全基因組關(guān)聯(lián)分析[3]一致，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.572，95%CI=0.641～3.855，P=0.218)，與韓國對(duì)287例HBV感染并發(fā)肝癌和671例慢性HBV感染對(duì)照的研究結(jié)果類似[13]，同樣Chen等[14]比較506例HBV感染并發(fā)肝癌，和772例慢性HBV感染者，rs7574865位點(diǎn)基因型在兩組人群無顯著區(qū)別。Clark等[15]445例越南患者包括206例慢性HBV感染和239例肝癌研究中在HCC和慢性HBV感染組以G等位基因做參比，T等位基因風(fēng)險(xiǎn)降低(OR=0.84，95%CI =0.7～0.99，P=0.048)也就是G是危險(xiǎn)等位基因，結(jié)果與Jiang一致，但是2篇文獻(xiàn)OR值(比值比)即相對(duì)危險(xiǎn)度都接近1，說明rs7574865位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)HBV肝癌易感性的影響并不明顯。

本研究發(fā)現(xiàn)STAT4 rs7574865位點(diǎn)與肝癌易感性無明顯相關(guān)性。肝癌的發(fā)生是1個(gè)多基因、多途徑、由遺傳和環(huán)境因素等綜合影響的過程，有必要納入更多的位點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合分析，遺傳因素與環(huán)境因素的協(xié)同作用也值得更深入的研究。

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(編輯：吳小紅)

Relationship between Polymorphisms of STAT4 and the Susceptibility to Hepatocellular Carcinoma Associated with Hepatitis B Virus

PANMingjie,LIUYi,ZHOUYihua.

NanjingDrumTowerHospitalAffiliatedtoNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing,210008

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between single nucleotide polymorphism(SNP)of STAT4 and hepatocellular carcinoma(HCC)susceptibility in chinese population.Methods154 patients with hepatitis B virus(HBV)-related HCC and 135 age-and gender-matched non-HCC controls infected with HBV were enrolled.The genotypes of STAT4 rs7574865 were detected by polymerase chain reaction based restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)and verified by sequencing analysis.Logistic regression model was used to analyze the relationship between different genotypes and their susceptibility to HCC.ResultsThe frequencies of genotypes TT,GT and GG on STAT4 rs7574865 were 5.8%(9/154),37.0%(57/154),57.1%(88/154)in the HCC group,and 8.9%(12/135),43.7%(59/135),47.4%(64/135)in non-HCC group,respectively,showing no statistical significance(P>0.05).Compared with TT genotype,there was no significant association at rs7574865 GG in the susceptibility to HCC(OR=1.833，95%CI=0.729～4.611，P=0.221).ConclusionThe polymorphism of STAT4 rs7574865 is not associated with susceptibility to HCC in chinese population.

【Key words】Hepatocellular carcinoma;Hepatitis B virus;Signal transducer and activators of transcription 4;Single nucleotide polymorphism

通訊作者：周乙華

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.05.003

中圖分類號(hào)：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)05-0704-03

(收稿日期2015-08-07修回日期 2016-01-25)