權(quán)效珍　蘭艷麗

441021 湖北文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院

?

miR-296在卵巢癌中的表達(dá)及其靶基因的預(yù)測研究

權(quán)效珍蘭艷麗

441021 湖北文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院

【摘要】目的觀察miR-296在卵巢癌中的表達(dá)及其靶基因的預(yù)測。方法收集卵巢癌患者組織樣本22例和婦科活檢為正常的樣本22例，在提取RNA后進(jìn)行RNA純度檢測，進(jìn)而檢測miR-296在卵巢癌中的表達(dá)；在卵巢癌細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)入高表達(dá)miR-296的質(zhì)粒，miRNA芯片進(jìn)行靶基因檢測。結(jié)果卵巢癌組織中miR-296高表達(dá)，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。在卵巢癌細(xì)胞系中，當(dāng)高表達(dá)miR-296時，microRNA143和microRNA215在轉(zhuǎn)染組中高表達(dá)，microRNA96、microRNA551b、microRNA502-3p低表達(dá)。結(jié)論miR-296在卵巢癌中高表達(dá)，且其潛在的靶基因有可能作為臨床卵巢癌診斷的標(biāo)志。

【關(guān)鍵詞】miR-296；卵巢癌；靶基因

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:727～729)

卵巢癌被認(rèn)為是常見惡性腫瘤中致死率較高的腫瘤疾病，特別是在東亞和南非國家中尤為常見，且在發(fā)展中國家中，卵巢癌患者發(fā)病率和死亡率也明顯要高于其他發(fā)達(dá)國家[1-2]。卵巢癌患者的發(fā)病率是一個多因素，多步驟，復(fù)雜的過程，而且和各類婦科疾病及患者身體狀況有關(guān)系[3]，但是其潛在形成惡性腫瘤的機(jī)制還未被研究清楚。microRNA被報道是一個小的非編碼RNA，它可以調(diào)節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄功能，進(jìn)而促進(jìn)或者抑制腫瘤基因的表達(dá)[4]。到現(xiàn)在為止，超過1000個人類microRNA被確認(rèn)而且被報道在RNA數(shù)據(jù)庫中，而且有些被用來作為診斷、預(yù)后和治療的分子生物標(biāo)記物[5-6]。miR-296位于染色體20q13.32處，有研究報道m(xù)iR-296的分子作用是與血管生成有關(guān)，是一個比較好的腫瘤抑制劑，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞極性[7-8]。但是miR-296在卵巢癌中的研究較少，且關(guān)于其靶基因在卵巢癌中的研究在國內(nèi)外均未見報道。

1材料與方法

1.1臨床資料

收集我院腫瘤科卵巢癌患者樣本22例，將婦科活檢為正常的樣本22例進(jìn)行對照，患者各類臨床資料均良好保存。

1.2方法

1.2.1Q-PCR試劑及方法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，稱取等量組織或血清，加入同等比例的Trizol，12 000 r/min，4 ℃離心10 min；吸取上清液至一新的EP管中，靜置5 min，使之充分裂解；加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，然后放置3 min；12 000 r/min，4 ℃離心15 min，離心完后分為3層，取最上層(中間一層為蛋白)至一新的EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒數(shù)次，室溫沉淀10 min；12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液；加入75%乙醇(DEPC水溶解)，顛倒數(shù)次混勻；7 500 r/min，4 ℃ 5 min，棄上清液，小心吸盡液體(此時可以看到白色沉淀即為RNA)；RNA略干后加入20 μL DEPC水。用核酸染料法進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測miR-296在卵巢癌中的表達(dá)研究。引物序列為：miR-296，F(xiàn)-GCGAGCTACATTGTCTGCTGGGTT；R-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG。U6，F(xiàn)-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGATG；R-CCAGTCGAGGGTCCGAGGTATT。

1.2.2miRNA分子雜交方法采用(Ambion公司)小分子分離試劑盒分理處小分子RNA，將提取完的小分子RNA進(jìn)行Cy3標(biāo)記，進(jìn)而與miRNA芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，miRNA芯片購自于Affymetrix Human Geome公司。

1.2.3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達(dá)的miR-296的卵巢癌細(xì)胞株

將處于對數(shù)期的SKOV3(購自于ATCC)種于六孔板中，保證每孔細(xì)胞量為3×105～8×105，lipo2000加入5 μl用100 μl無血清培養(yǎng)基混勻，靜置5 min，同時高表達(dá)的miR-296的質(zhì)粒12 μl于100 μl無血清的培養(yǎng)基中混勻，5 min后兩者混勻20 min，然后加入1 800 μl的無血清培養(yǎng)基，48 h后提取RNA進(jìn)行檢測。過表達(dá)miR-296序列合成于廣州銳博生物公司。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包處理，統(tǒng)計學(xué)方法采用t檢驗，Pearson相關(guān)分析，χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1標(biāo)本中RNA質(zhì)量檢測

在RNA檢測中會經(jīng)常出現(xiàn)RNA降解，所以在進(jìn)行microRNA檢測前我們進(jìn)行RNA純度的檢測，其檢測方法是RNA凝膠電泳檢測，采取28 s和18 s的比例，28 s和18 s是真核生物rRNA(核糖體RNA)的2個主要亞基，在體內(nèi)含量較多。28 s/18 s即為衡量提取的RNA完整性的指標(biāo)，如果28 s/18 s為1.8～2.0表明所提取RNA完整性較好，基本無降解發(fā)生。電泳條帶上應(yīng)是28 s在上，18 s在下，且亮度為28 s是18 s的2倍。結(jié)果見圖1。

圖1　RNA凝膠電泳檢測結(jié)果

2.2miR-296在卵巢癌中的表達(dá)

在22例卵巢癌患者和22例正常卵巢患者中檢測miR-296的表達(dá)，在提取RNA后進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測后，用U6作為內(nèi)參，將2組miR-296的表達(dá)內(nèi)參化后進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織中miR-296高表達(dá)，與正常卵巢組織比較，表達(dá)存在明顯差異，P<0.001，見圖2。

圖2　miR-296在卵巢癌組織中的表達(dá)

2.3在卵巢癌中miR-296靶基因檢測

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)我們所提取的RNA純度較高，且未出現(xiàn)降解等情況。SKOV3是臨床上經(jīng)常用于科學(xué)研究的卵巢癌細(xì)胞株，在我們轉(zhuǎn)染高表達(dá)的miR-296后，檢測其下游的靶基因。在我們的檢測中發(fā)現(xiàn)，microRNA143和microRNA215在miR-296轉(zhuǎn)染組中高表達(dá)，microRNA96、microRNA551b、microRNA502-3p在轉(zhuǎn)染組中低表達(dá)。見圖3。

中間線表示理想回歸線，上下線表示理想預(yù)測的1個對數(shù)單位

3討論

卵巢癌是1種高度惡性的腫瘤，其發(fā)病機(jī)理也比較復(fù)雜?；虻谋磉_(dá)異常產(chǎn)生了腫瘤，MicroRNA在卵巢癌中的研究越來越多，也越來越深入，在卵巢癌初期miRNA的篩查中發(fā)現(xiàn)很多基因表達(dá)異常，許多已經(jīng)被廣大研究者公認(rèn)為抑癌基因，當(dāng)然也有很多基因被認(rèn)為是促癌基因。有越來越多的microRNA被用來作為腫瘤標(biāo)記物應(yīng)用到臨床研究上[9]。miR-296早期被用來抗血管生成的研究，其主要是通過影響細(xì)胞極性進(jìn)而改變細(xì)胞運動狀態(tài)，如影響極性蛋白scrib。有研究報道，當(dāng)miR-296過表達(dá)時會增加腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤[10]。

但是關(guān)于miR-296的靶基因研究還未見過多報道，特別是在卵巢癌中的研究。有研究報道m(xù)iR-296可以調(diào)控VEGFR2和PDGFRβ信號通路進(jìn)而影響前列腺癌的腫瘤進(jìn)程，這一研究主要集中在通過miR-296的表達(dá)進(jìn)而影響血管的生成，達(dá)到影響腫瘤[11-12]。卵巢癌的致死率也逐漸引起廣大醫(yī)療科研工作者的重視，但是調(diào)控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制也相當(dāng)復(fù)雜，所以尋找一個好的基因靶點顯得尤為重要。

在前人的研究中已經(jīng)有學(xué)者報道m(xù)iR-296與腫瘤之間的關(guān)系，但是卵巢癌中的研究還未見報道。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)在 RNA純度等多方面均完好的情況下miR-296在卵巢癌中高表達(dá)，且存在明顯差異。當(dāng)我們轉(zhuǎn)染高表達(dá)的miR-296的卵巢癌細(xì)胞系時，發(fā)現(xiàn)microRNA143和microRNA215在轉(zhuǎn)染組中高表達(dá)，microRNA96、microRNA551b、microRNA502-3p低表達(dá)。這些基因的表達(dá)差異是我們研究的創(chuàng)新點，據(jù)我們的實驗觀察可得出，這些微小RNA有可能作為卵巢癌診斷分子標(biāo)記物。

參考文獻(xiàn)

[1]朱皓皞.卵巢癌預(yù)后評估相關(guān)因素的研究進(jìn)展〔J〕.實用癌癥雜志,2011,26(4):429-431.

[2]Nimmo RA,Slack FJ.An elegant miRror:microRNAs in stem cells,developmental timing and cancer〔J〕.Chromosoma,2009,118(4):405-418.

[3]Folini M,Gandellini P,Longoni N,et al.miR-21:an oncomir on strike in prostate cancer〔J〕.Mol Cancer，2010,9:12.

[4]Xi Y,Shalgi R,Fodstad O,et al.Differentially regulated micro-RNAs and actively translated messenger RNA transcripts by tumor suppressor p53 in colon cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2006,12(7 Pt 1):2014-2024.

[5]Lee YS,Dutta A.MicroRNAs in cancer〔J〕.Annu Rev Pathol,2009,4(2):199-277.

[6]Yamakuchi M,Ferlito M,Lowenstein CJ.miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2008,105(36):13421-13426.

[7]Wei JJ,Wu X,Peng Y,et al.Regulation of HMGA1 expression by microRNA296 affects prostate cancer growth and invasion〔J〕.Clin Cancer Res,2011,17(6):1297-1305.

[8]Osmani N,Vitale N,Borg JP,et al.Scrib controls Cdc42 localization and activity to promote cell polarization during astrocyte migration〔J〕.Curr Biol,2006，16(24):2395-2405.

[9]孫彩霞,宋藏珠,徐慶,等.卵巢癌組織和細(xì)胞株中 miR-141表達(dá)水平與卡鉑耐藥性的關(guān)系〔J〕.實用癌癥雜志,2014,29(11):1364-1368.

[10]Nagasaka K,Pim D,Massimi P,et al.The cell polarity regulator hScrib controls ERK activation through a KIM site-dependent interaction〔J〕.Oncogene,2010，23(38):5311-5321.

[11]Bilder D,Li M,Perrimon N.Cooperative regulation of cell polarity and growth by Drosophila tumor suppressors〔J〕.Science,2000,289(5476):113-116.

[12]Hanahan D,Weinberg RA.The hallmarks of cancer〔J〕.Cell,2000,100(1):57-70.

(編輯：甘艷)

Expression of miR-296 in Ovarian Cancer and Prediction of Its Target Gene Research

QUANXiaozhen,LANYanli.

XiangyangCentralHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofArtsandScience,Xiangyang，441021

【Abstract】ObjectiveTo observe the expression of miR-296 expression in ovarian cancer and prediction of its target gene research.MethodsCollect our oncology patient samples 22 cases of ovarian cancer tissues,and 22 cases of normal tissues were collected.After testing the purity of RNA,we screen the expression of miR-296,in ovarian cancer were detected,and test the target gene were tested after transferred with high miR-296 by genechip technology.ResultsWe found that the miR-296 had high expression in ovarian cancer,and compared with the control had statistical significance normal,P<0.001.When transferred with high miR-296 in ovarian cancer cell lines(SKOV3),we found that that microRNA143 and microRNA215 were upregulated in the group with high expression miR-296,and microRNA96、microRNA551b and microRNA502-3p were down-regulated expression.ConclusionThe miR-296 are highly expressed in ovarian cancer,and the potential target gene may as ovarian cancer molecular marker in clinic.

【Key words】miR-296;Ovarian cancer;Target gene

通訊作者：蘭艷麗

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.05.009

中圖分類號：R737.31

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)05-0727-03

(收稿日期2015-07-21修回日期 2015-12-10)