王　益　張　晶　劉　蓓

430064 武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院

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血管表皮生長(zhǎng)因子對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響機(jī)制研究

王益張晶劉蓓

430064 武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院

【摘要】目的探討VEGF對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響機(jī)制研究。方法采用基因芯片方法，篩選大腸癌的相關(guān)因子。采用免疫組化方法檢測(cè)大腸癌組織、癌旁組織和正常組織中VEGF的表達(dá)。采用免疫熒光方法檢測(cè)三種組織內(nèi)淋巴管和血管中VEGF的 表達(dá)。結(jié)果基因芯片篩選結(jié)果顯示VEGF在大腸癌組織中呈高表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示22例大腸癌組織中VEGF呈高表達(dá)，與正常組織比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示在癌組織中呈高表達(dá)VEGF時(shí)其淋巴管和血管內(nèi)均增高(相比于正常組時(shí))，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，(分別為P<0.001和P<0.05)，在癌旁組織中VEGF呈低表達(dá)(相比于癌組織)時(shí)相對(duì)癌組織，淋巴管和血管內(nèi)均降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別為P<0.001和P<0.05)。結(jié)論VEGF可以通過(guò)調(diào)節(jié)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

【關(guān)鍵詞】血管表皮生長(zhǎng)因子；腸癌；淋巴管

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:737～739)

在西方國(guó)家中，結(jié)腸癌在腫瘤疾病中處于第二難治愈腫瘤。結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中上升至第三位，我國(guó)和全世界范圍的發(fā)病率和死亡率仍處于上升趨勢(shì)[1]。盡管預(yù)防措施和治療手段不斷改進(jìn)，但轉(zhuǎn)移患者5年的生存率低于10%[2-3]，及時(shí)控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展和抑制轉(zhuǎn)移是提高生存率的有效手段。它的擴(kuò)散有很多方式，淋巴管的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是其最為常見(jiàn)的方式[4-5]。

表皮生長(zhǎng)因子刺激增殖，促進(jìn)淋巴管的生成和血管新生。據(jù)研究表明，VEGF在腫瘤組織中的表達(dá)和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，早期的研究表明VEGF家族和其受體在腸癌中會(huì)引起腸癌細(xì)胞的浸潤(rùn)，而且有人證實(shí)VEGF的高表達(dá)是促進(jìn)了其腫瘤相關(guān)的淋巴管擴(kuò)張，因此在腸癌轉(zhuǎn)移抑制淋巴管的生成中成為一個(gè)很有效的方式[6]。所以我們需要證實(shí)在腸癌中是否VEGF會(huì)引起淋巴管和血管的變化，進(jìn)而引起腸道腫瘤的變化，因此我們對(duì)此展開(kāi)研究。

1材料與方法

1.1臨床資料

收集我院普外科大腸癌患者樣本22例，男性13例，女性9例，年齡35～78歲，平均(55.3±9.8)歲，高分化腺癌6例，中分化腺癌12例，低分化腺癌4例。分別取腫瘤組織相對(duì)應(yīng)的癌旁組織和正常組織作為對(duì)照，檢測(cè)VEGF的表達(dá)水平。

1.2方法

1.2.1RT-PCR試劑及方法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，稱(chēng)取等量組織或血清，加入同等比例的Trizol，12 000 r/min，4 ℃離心10 min；吸取上清液至一新的EP管中，靜置5 min，使之充分裂解；加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，然后放置3 min；12 000 r/min，4 ℃離心15 min，離完后分為3層，取最上層(中間一層為蛋白)至一新的EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒數(shù)次，室溫沉淀10 min；12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液；加入75%乙醇(DEPC水溶解)，顛倒數(shù)次混勻；7 500 r/min，4 ℃ 5 min，棄上清液，小心吸盡液體(此時(shí)可以看到白色沉淀即為RNA)；RNA略干后加入20 μL DEPC水。采用(Ambion公司)小分子分離試劑盒分理處小分子RNA，基因芯片購(gòu)自于Affymetrix Human Geome公司。

1.2.2免疫組化[7]①脫蠟：按照常規(guī)脫蠟方法，在二甲苯，無(wú)水乙醇，95%乙醇，90%乙醇，85%乙醇，80乙醇脫蠟，大約每次時(shí)間為10 min。② 抗原修復(fù)：PBS洗后，加入3%H2O2，37 ℃浸泡10 min，從而除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，PBS洗，再加入檸檬酸緩沖液，高溫高壓修復(fù)5 min，冷卻至室溫。③ 血清封閉： PBS洗，5 min，洗3次，擦干組織周?chē)腜BS液，然后10%BSA封閉，放入37 ℃溫箱中1小時(shí)。④ 加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周?chē)难?，加一抗，加完一?VEGF，購(gòu)自于santa)后于4 ℃冰箱中保存過(guò)夜。⑤ 加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干組織周?chē)腜BS后加上二抗，然后置于37 ℃溫箱中1 h。⑥ 加顯色劑：將片子從溫箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干組織周?chē)腜BS后加上DAB顯色劑。

1.2.3免疫熒光染色組織經(jīng)過(guò)固定后，蔗糖梯度脫水，冰凍切片，切片厚度為6 μm，高溫修復(fù)5 min，待其冷卻后，PBS洗滌(3次，每次5 min)，10%BSA封閉50 min，然后進(jìn)行一抗染色，過(guò)夜，第二天復(fù)溫40 min，PBS洗滌(3次，每次5 min)，然后進(jìn)行熒光二抗染色，一抗為VEGF(抗兔)，購(gòu)自于santa，1∶100，標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，LYVE-1(抗羊)，購(gòu)自于santa1∶100，二抗分別選用，抗兔(595 nm)，抗山羊(488 nm)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)分析，χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1血管表皮生長(zhǎng)因子在大腸癌組織中呈高表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)所提取的RNA純度較高，且未出現(xiàn)降解等情況。采取28 s和18 s的比例，28 s和18 s是真核生物rRNA(核糖體RNA)的兩個(gè)主要亞基，在體內(nèi)含量較多。28 s/18 s即為衡量提取的RNA完整性的指標(biāo)，如果28 s/18 s為1.8～2.0表明所提取RNA完整性較好，基本無(wú)降解發(fā)生。電泳條帶上應(yīng)是28 s在上，18 s在下，且亮度為28 s是18 s的兩倍，見(jiàn)圖1。將正常組織和大腸癌組織進(jìn)行基因芯片的篩選，在篩選中我們發(fā)現(xiàn)VEGF在大腸癌組織中呈高表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖1　電泳圖

圖2　基因芯片篩選出VEGF在大腸癌組織中的表達(dá)

2.2大腸癌組織和正常組織中VEGF的表達(dá)(圖3)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，22例大腸癌組織中VEGF呈高表達(dá)，與正常組織比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

圖3　大腸癌組織和癌旁組織中VEGF表達(dá)

2.3不同組織中VEGF的檢測(cè)

分別檢測(cè)正常組織、癌旁組織和大腸癌組織中的VEGF表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在癌組織中VEGF呈高表達(dá)時(shí)其淋巴管和血管內(nèi)表達(dá)水平均增高(相比于正常組織時(shí))，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別為P<0.001和P<0.05)，在癌旁組織中VEGF呈低表達(dá)(相比于癌組織)時(shí)相對(duì)癌組織，淋巴管和血管內(nèi)其表達(dá)水平均降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別為P<0.001和P<0.05)，見(jiàn)圖4。

a為正常組織，b為癌旁組織，c為癌組織。

3討論

大腸癌是人類(lèi)疾病中惡性程度較高的一類(lèi)疾病，其主要特點(diǎn)是易發(fā)生轉(zhuǎn)移，特別是淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移的腫瘤通過(guò)血液，淋巴管，進(jìn)而形成多種其他腫瘤，淋巴管的轉(zhuǎn)移包括一系列的復(fù)雜過(guò)程，包括，①原位癌惡性腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散至旁邊淋巴管；②腫瘤細(xì)胞通過(guò)淋巴管轉(zhuǎn)運(yùn)至鄰近的淋巴結(jié)；③腫瘤細(xì)胞在淋巴結(jié)中的著落；④轉(zhuǎn)移性的腫瘤在淋巴結(jié)中的擴(kuò)散[8]。

在最近的研究多集中在VEGF家族在大腸癌中的作用，特別是VEGF-C，VEGF-C是在1996年從人前列腺癌PC-3細(xì)胞株中分離出來(lái)，其位于染色體4q34，在其編碼外端有7個(gè)外顯子，是人類(lèi)第一格發(fā)現(xiàn)的具有促進(jìn)淋巴管生成的基因[9-10]。VEGF具有誘導(dǎo)淋巴管生成和血管新生的潛能，且能調(diào)節(jié)生理性的和病理性的血管新生，因此VEGF在腫瘤發(fā)生發(fā)展和生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要作用[11]。VEGF主要在血管中表達(dá)，它的主要作用就是集中在促進(jìn)血管新生方面，在腫瘤區(qū)域，血管新生是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要原因，所以研究VEGF在腸癌中的研究就顯得尤為重要。

基于此本研究展開(kāi)在大腸癌中進(jìn)行VEGF的研究，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織中高表達(dá)VEGF時(shí)其淋巴管和血管內(nèi)均增高(相比于正常組時(shí))，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，(分別為P<0.001和P<0.05)，為了證實(shí)這種結(jié)果是VEGF造成的，我們看到在癌旁組織中VEGF低表達(dá)(相比于癌組織)，果然在低表達(dá)VEGF時(shí)其相對(duì)癌組織，淋巴管和血管內(nèi)均降低，所以我們得出結(jié)果VEGF可以通過(guò)調(diào)節(jié)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

通過(guò)本研究其很多同仁的研究必將更加證實(shí)VEGF與大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系，筆者認(rèn)為在今后研究愈加深入后VEGF極有可能成為抑制大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的靶向藥物。

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(編輯：吳小紅)

Influence Mechanism of VEGF on Colorectal Cancer Cells Growth

WANGYi,ZHANGJing,LIUBei.

TianyouhospitalaffiliatedtoWuhanuniversityofscienceandtechnology,Wuhan,430064

【Abstract】ObjectiveTo investigate the influence mechanism of VEGF on colorectal cancer cells growth.MethodsThe related factors of colorectal cancer were screened by gene array.The expression of VEGF in colorectal cancer tissues,adjacent tissues and normal tissues were detected by immunohistochemical method.The expression of VEGF in lymphatic vessels and blood vessels of the 3 groups were detected by immunofluorescence assay.ResultsThe results of gene chip screening showed that VEGF was highly expressed in colorectal cancer tissues.The immunohistochemical results showed that VEGF was highly expressed in 22 cases of colorectal cancer tissues,compared with normal tissue,there had statistical difference,P<0.05.Immunofluorescence assay showed that the expression of VEGF lymphatic vessels and blood vessels of cancer tissues were significantly higher than that those of normal group,and there were statistically significant differences (P<0.05 and P<0.001).And VEGF was lower in tumor adjacent tissues,the lymphatic vessels and blood vessels decreased,there were significant differences(P<0.05 and P<0.001).ConclusionVEGF can regulate the endothelial lymphatic and promote colorectal cancer growth.

【Key words】VEGF;Colorectal cancer;Lymph vessel

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.05.012

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.3+4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)05-0737-03

(收稿日期2015-07-21修回日期 2015-12-21)