馮城婷　王　瑩　史　悅　袁高峰　李　偉　陶　敏　梁容瑞

215006 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院(馮城婷，史　悅，李　偉，陶　敏，梁容瑞)；215001 蘇州市立醫(yī)院(王　瑩)；223900 泗洪縣人民醫(yī)院(袁高峰)

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·基礎(chǔ)研究·

p-ERK1/2、CD34、層粘連蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)及其意義

馮城婷王瑩史悅袁高峰李偉陶敏梁容瑞

215006 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院(馮城婷，史悅，李偉，陶敏，梁容瑞)；215001 蘇州市立醫(yī)院(王瑩)；223900 泗洪縣人民醫(yī)院(袁高峰)

【摘要】目的探討p-ERK1/2、CD34、層粘連蛋白(LN)在乳腺癌中的表達(dá)及其意義。方法收集乳腺癌患者腫瘤組織蠟塊76例，行免疫組化染色，檢測(cè)乳腺癌患者癌組織標(biāo)本中p-ERK1/2的表達(dá)水平，分析p-ERK1/2水平與其臨床病理因素及CD34、LN的相關(guān)性。結(jié)果p-ERK1/2、CD34 、LN在乳腺癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤TNM分期顯著相關(guān)。CD34在乳腺癌組織中廣泛表達(dá)，與p-ERK1/2水平正相關(guān)。LN在乳腺癌組織中表達(dá)與TNM分期及p-ERK1/2水平均呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論ERK通路異?；罨c乳腺癌生長(zhǎng)和浸潤(rùn)有關(guān)，可能參與了乳腺癌的發(fā)展過程，ERK通路可能通過促進(jìn)血管生成及降解基底膜發(fā)揮促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展的作用。

【關(guān)鍵詞】p-ERK1/2；CD34；層粘連蛋白；乳腺癌

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:697～700)

乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是影響患者生存質(zhì)量和生存時(shí)間的重要因素[1]。MAPK-ERK信號(hào)通路異常活化可導(dǎo)致細(xì)胞分化、凋亡功能的喪失，引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，異常增殖、腫瘤發(fā)生，侵襲能力增強(qiáng)、腫瘤轉(zhuǎn)移等[2]，但其在乳腺癌中的作用及機(jī)制目前仍未闡明。本文擬采用免疫組織化學(xué)方法(S-P法)檢測(cè)p-ERK1/2、CD34與LN在乳腺癌組織中的表達(dá)及其變化特征，探討p-ERK1/2、CD34與LN三者與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的相關(guān)性，為臨床乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1組織來源

選取2012年1月至2013年9月泗洪縣人民醫(yī)院普外科手術(shù)切除前未經(jīng)過任何放化療治療的乳腺癌患者腫瘤組織蠟塊76例，年齡30～82歲，中位年齡為37歲，均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，分組資料采用國(guó)際抗癌聯(lián)盟分期(international union against cancer,UICC)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中Ⅰ期6例，Ⅱ期49例，Ⅲ期21例。

1.2免疫組化染色法

采用SP法行p-ERK1/2、CD34及LN免疫組化染色。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以己知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。采用雙盲法判斷結(jié)果。p-ERK1/2染色判定：以抗體在細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)。每張切片均隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為(-)，5%～25%為(+)，26%～50%為(++)，>50%為(+++)，以(+)～(+++)均視為陽(yáng)性表達(dá)，(-)視為陰性表達(dá)。CD34染色判定：參考Takahashi等[3]微血管計(jì)量方法，在雙盲法下進(jìn)行計(jì)數(shù)。LN染色判定：LN陽(yáng)性呈現(xiàn)為黃褐色或棕褐色顆粒，表達(dá)于上皮下基底膜。先在低倍(100倍)光學(xué)顯微鏡下觀察整張切片，隨機(jī)選擇間質(zhì)和癌巢中5個(gè)高倍視野(400倍)下觀察染色情況。上皮下無陽(yáng)性反應(yīng)為(-)，出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)帶呈淺棕色不連續(xù)為(+)，呈連續(xù)棕色細(xì)線為(++)，呈連續(xù)深棕色粗線為(+++)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)法作數(shù)據(jù)正態(tài)分布檢驗(yàn)，進(jìn)行卡方檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)及秩和檢驗(yàn)等分析。以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1p-ERK1/2、CD34、LN在乳腺癌組織中的表達(dá)情況

乳腺癌組織中p-ERK1/2陽(yáng)性率為43.4%，所有標(biāo)本中均檢測(cè)到CD34陽(yáng)性細(xì)胞，中位MVD為50.5個(gè)。LN中位陽(yáng)性率為84.2%(60/76)，其中LN(+)31例(40.8%)，LN(++)20例(26.3%)，LN(+++)13例(17.1%)。

2.2乳腺癌組織中p-ERK1/2的表達(dá)與其臨床病理因素的關(guān)系

分析發(fā)現(xiàn)：p-ERK1/2表達(dá)水平與腫瘤長(zhǎng)徑呈顯著正相關(guān)(P=0.000；γ=0.673)，p-ERK1/2表達(dá)水平與HER-2、ER、PR表達(dá)狀態(tài)等其它臨床病理因素未見明顯相關(guān)性(P>0.05)(表1)，p-ERK1/2陽(yáng)性率隨TNM分期升高而升高(γ=0.586，P=0.040，表2)。

2.3乳腺癌組織中 LN表達(dá)與其臨床病理因素的關(guān)系

LN(-～+)共33例，LN陽(yáng)性(++與+++)共43例，陽(yáng)性率為56.6%。分析結(jié)果顯示：LN表達(dá)水平與腫瘤長(zhǎng)徑呈顯著正相關(guān)(P=0.005；γ=0.342)，LN表達(dá)水平與HER-2、ER、PR表達(dá)狀態(tài)等其它臨床病理因素未見明顯相關(guān)(P>0.05，表3)，LN表達(dá)水平隨TNM分期升高而升高(γ=0.586，P=0.040，表4)。

2.4乳腺癌中p-ERK1/2與CD34表達(dá)的相關(guān)性

分析發(fā)現(xiàn)：p-ERK1/2表達(dá)與MVD水平呈正相關(guān)性(γ=0.284)，p-ERK1/2陽(yáng)性患者比陰性患者M(jìn)Vs細(xì)胞水平高，兩組間有顯著性差異(P=0.013，圖1)。 p-ERK1/2陰性組MVs均數(shù)為(42.23±25.52)個(gè)，中位數(shù)為48個(gè)；p-ERK1/2陽(yáng)性組MVs均數(shù)為個(gè)(62.36±23.22)個(gè)，中位數(shù)為58個(gè)。

表1　BC組織中p-ERK1/2表達(dá)與其臨床病理因素的

注：◇為應(yīng)用χ2檢驗(yàn)；□為應(yīng)用t檢驗(yàn)，*表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2　76例不同分期BC患者p-ERK1/2陽(yáng)性率比較(例，%)

表3　BC患者中LN表達(dá)水平與其臨床病理因素的

注：◇為應(yīng)用χ2檢驗(yàn)；□為應(yīng)用t檢驗(yàn)。*表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4　乳腺癌中LN水平與TNM分期相關(guān)性分析/例

圖1　不同p-ERK1/2水平乳腺癌標(biāo)本中MVs數(shù)量情況

2.5乳腺癌中p-ERK1/2表達(dá)與LN水平的相關(guān)性

p-ERK1/2表達(dá)水平與LN水平呈負(fù)相關(guān)(γ=-0.378)，p-ERK1/2陽(yáng)性患者LN水平較陰性患者低，兩組間存在顯著差異(P=0.000)，見表5。

3討論

MAPK/ERK信號(hào)通路是介導(dǎo)細(xì)胞外刺激從而引起細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，對(duì)于細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等方面具有重要作用[4]。其中，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)通路備受關(guān)注，也是迄今研究得較為透徹的重要 MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與了對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展及多藥耐藥等的調(diào)控[2]。ERK通路與乳腺癌的關(guān)系已越來越受到研究人員的關(guān)注，孟媛等[5]發(fā)現(xiàn)p-ERK過表達(dá)可能與乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)有關(guān)。曾憲旭等[6]發(fā)現(xiàn)p-ERK表達(dá)水平在一定程度上提示了乳腺導(dǎo)管非典型增生向乳腺癌的轉(zhuǎn)化潛能,并且ERK傳導(dǎo)路徑在乳腺癌癌變過程中具有重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中p-ERK1/2水平還與腫瘤大小正相關(guān)，且其陽(yáng)性率隨TNM分期升高而升高，這同樣支持ERK通路的活化可能促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)展。

乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移與微血管的生成密切相關(guān)。

新生血管為腫瘤組織的生長(zhǎng)不斷提供所需營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)了腫瘤的增長(zhǎng)，同時(shí)微血管的增加，腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)的可能性也增加，進(jìn)而侵入靶器官開始增殖[7-8]。CD34抗原被認(rèn)為是最敏感的內(nèi)皮細(xì)胞，能直接反映微血管生成情況。甄樂峰等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CD34在乳腺癌腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明原發(fā)腫瘤越大、組織學(xué)分級(jí)越高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多、pTNM分期越晚，乳腺癌中微血管的形成越多。我們的研究發(fā)現(xiàn)，p-ERK1/2陽(yáng)性組病例中CD34水平顯著高于p-ERK1/2陰性組，提示ERK活化程度高的乳腺癌中MVD水平也相應(yīng)升高，這可能是ERK通路促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制之一。

基膜是1種特化的細(xì)胞外基質(zhì),是腫瘤浸潤(rùn)過程中必須穿越的物理屏障。腫瘤細(xì)胞通過分泌基質(zhì)降解酶類破壞基膜的組織結(jié)構(gòu),同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)受體整合素的表達(dá),為穿過基膜和在靶器官粘附、增殖創(chuàng)造有利條件[10]。LN作為基底膜的主要成分，一方面起著支撐和連接細(xì)胞、維持器官形態(tài)的機(jī)械性作用;另一方面可調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和功能,在多種生理和病理過程中發(fā)揮作用。Molino等[11]發(fā)現(xiàn)乳腺癌的浸潤(rùn)可能跟LN的破壞降解有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到LN 在乳腺癌組織中表達(dá)失去連續(xù)性，甚至有明顯的斷裂，提示腫瘤組織中出現(xiàn)了明顯的基膜破壞，并且LN的表達(dá)水平還與腫塊長(zhǎng)徑及TNM分期成正相關(guān)，表明腫瘤的進(jìn)展與LN的破壞相關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)，ERK通路的激活使腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)[12]，微血管生成增加，CD34的表達(dá)亦增加。Park等[13]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞及肝細(xì)胞肝癌的細(xì)胞中ERK信號(hào)途徑的活化能使MMP-1、3基因轉(zhuǎn)錄；Kim等[14]研究表明，ERK的激活可誘導(dǎo)SKBR3乳腺癌細(xì)胞株內(nèi)MMP-9的分泌。MMP-9是MMPs家族中相對(duì)分子量最大的酶，主要功能是降解、破壞細(xì)胞外基質(zhì)中最主要的組份Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠，從而可以降解基膜。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌中p-ERK1/2陽(yáng)性患者比陰性患者CD34水平明顯升高，提示ERK通路的活化可能促使腫瘤微血管的生成；與此同時(shí)，對(duì)比p-ERK1/2陽(yáng)性組標(biāo)本與p-ERK1/2陰性組標(biāo)本，前者LN的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于后者，提示ERK通路的活化可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞對(duì)基膜的降解，從而致使腫瘤浸潤(rùn)進(jìn)展。

表5　乳腺癌中p-ERK1/2表達(dá)與LN水平相關(guān)性分析(例，%)

參考文獻(xiàn)

[1]Scully OJ,Bay B-H,Yip G,et al.Breast Cancer Metastasis〔J〕.Cancer Genomics & Proteomics,2012,9(5):311-320.

[2]McCubrey JA,Steelman LS,Chappell WH,et al.Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth,malignant transformation and drug resistance〔J〕.Biochim Biophys Acta,2007,1773(8):1263-1284.

[3]Takahashi Y,Cleary KR,Mai M,et al.Significance of vessel count and vascular endothelial growth factor and its receptor(KDR)in intestinal-type gastric cancer〔J〕.Clin Cancer Res,1996,2(10):1679-1684.

[4]Wada T,Penninger JM.Mitogen-activated protein kinases in apoptosis regulation〔J〕.Oncogene,2004,23(16):2838-2849.

[5]孟媛,董經(jīng)宇,甄娟,等.SIAH2與P-ERK在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2011,20(3):220-226.

[6]曾憲旭,關(guān)劍,韓艷春,等.p-Bad112/136、p-Akt、p-Erk在乳腺癌癌變過程中的表達(dá)及意義〔J〕.中國(guó)腫瘤臨床,2006,33(13):738-742.

[7]Chi Y,Huang S,Peng H,et al.Critical role of CDK11(p-58)in human breast cancer growth and angiogenesis〔J〕.Bmc Cancer,2015,15:701.

[8]Rykala J,Przybylowska K,Majsterek I,et al.Angiogenesis Markers Quantification in Breast Cancer and Their Correlation with Clinicopathological Prognostic Variables〔J〕.Patho Oncol Res,2011,17(4):809-817.

[9]甄樂鋒,葉長(zhǎng)生,劉民鋒,等.D2-40和CD34在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及其意義〔J〕.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(7):1548-1551.

[10]Fernandez-Perianez R,Molina-Privado I,Rojo F,et al.Basement Membrane-Rich Organoids with Functional Human Blood Vessels Are Permissive Niches for Human Breast Cancer Metastasis〔J〕.Plos One,2013,8(8):e72957.

[11]Molino A,Pedersini R,Micciolo R,et al.Prognostic significance of laminin,laminin receptor,and bone marrow micrometastases in breast cancer patients:are these markers of aggressive behavior and metastatic potential〔J〕.Appl Immunohistochem Mol Morphol,2003,11(4):311-318.

[12]Lee CC,Chen SC,Tsai SC,et al.Hyperbaric oxygen induces VEGF expression through ERK,JNK and c-Jun/AP-1 activation in human umbilical vein endothelial cells〔J〕.J Biomed Sci,2006,13(1):143-156.

[13]Park CH,Lee MJ,Ahn J,et al.Heat shock-induced matrix metalloproteinase(MMP)-1 and MMP-3 are mediated through ERK and JNK activation and via an autocrine interleukin-6 loop〔J〕.J Invest Dermatol,2004,123(6):1012-1019.

[14]Kim S,Choi JH,Lim HI,et al.EGF-induced MMP-9 expression is mediated by the JAK3/ERK pathway,but not by the JAK3/STAT-3 pathway in a SKBR3 breast cancer cell line〔J〕.Cell Signal,2009,21(6):892-898.

(編輯：吳小紅)

The Expression and Clinical Significance of p-ERK1/2,CD34,Laminin in Breast Cancer

FENGChengting,WANGYing,SHIYue,etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,215006

【Abstract】ObjectiveTo study the expression and clinical significance of p-ERK1/2,CD34 and laminin(LN)in breast cancer.Methods76 tumor tissue paraffin blocks were collected from patients with breast cancer,which were sliced into sections and immunohistochemically stained.Activated ERK expression levels were detected in cancer tissue specimens of breast cancer patients.The relationships among p-ERK1/2 level,clinical pathological factors,CD34 and LN were analyzed.ResultsThe expression of p-ERK1/2 、CD34 and LN in breast cancer tissues was significantly associated with the tumor TNM staging.CD34 was widely expressed in breast cancer tissues,which was positively associated with the p-ERK1/2 level.The expression of LN in breast cancer tissues was negatively associated with the TNM staging and the p-ERK1/2 level.ConclusionP-ERK1/2,which is associated with the development and invasion of breast cancer,may play an important role in promoting breast cancer progression by promoting the angiogenesis and the degradation of basement membranes.

【Key words】p-ERK1/2；CD34；Laminin；Breast cancer

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272542)

通訊作者：梁容瑞

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.05.001

中圖分類號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)05-0697-04

(收稿日期2015-07-09修回日期 2016-01-05)