于婧文　張輝　宋國斌　李自青　尉杰忠　劉春云　張海飛　劉建春王青　肖保國　李艷花　馬存根

037009 山西大同大學腦科學研究所(于婧文、張輝、宋國斌、李自青、尉杰忠、劉春云、肖保國、李艷花、馬存根)；037009 山西大同市第五人民醫(yī)院神經(jīng)科(張海飛)；030024 山西中醫(yī)學院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學研究中心 山西中醫(yī)學院(劉建春、王青、馬存根)；200025 復旦大學華山醫(yī)院神經(jīng)病學研究所(肖保國)

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于婧文張輝宋國斌李自青尉杰忠劉春云張海飛劉建春王青肖保國李艷花馬存根

037009 山西大同大學腦科學研究所(于婧文、張輝、宋國斌、李自青、尉杰忠、劉春云、肖保國、李艷花、馬存根)；037009 山西大同市第五人民醫(yī)院神經(jīng)科(張海飛)；030024 山西中醫(yī)學院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學研究中心 山西中醫(yī)學院(劉建春、王青、馬存根)；200025 復旦大學華山醫(yī)院神經(jīng)病學研究所(肖保國)

摘要：目的探討口服鹽酸法舒地爾(Fasudil)對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)小鼠巨噬細胞及TLR/NF-B通路的作用。方法采用小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白35-55 肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide，MOG35-55)誘導C57BL/6小鼠建立EAE模型，將EAE小鼠隨機分為EAE模型組和Fasudil治療組，免疫后第3天給予Fasudil治療組小鼠Fasudil灌胃干預，直到免疫后第27天，EAE模型組同樣處理給予等量生理鹽水。光鏡觀察脊髓組織CD4+T細胞/CD68巨噬細胞表達的變化，Western blot法測定脊髓誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg-1)、Toll樣受體2(TLR-2)、TLR-4和磷酸化核因子B(p-NF-B)蛋白的表達，ELISA法測定培養(yǎng)72 h脾細胞分泌細胞因子的含量。結果與EAE模型組比較，F(xiàn)asudil組CD4+T細胞數(shù)和CD68巨噬細胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，巨噬細胞M1表型iNOS表達減少(P<0.05)，M2表型Arg-1表達增加(P<0.01)，炎性通路蛋白p-NF-B、TLR-2和TLR-4表達減少(P<0.05)，外周細胞炎性因子白細胞介素-6(IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)和IL-17分泌減少(P<0.05)，而IL-10分泌增加(P<0.05)。結論口服Fasudil可抑制CD4+T細胞/CD68巨噬細胞的激活，促進巨噬細胞表型M1向M2轉化，抑制脊髓組織中p-NF-B、TLR-2和TLR-4的表達，抑制外周免疫細胞炎性因子分泌，而增加IL-10的分泌。

關鍵詞：腦脊髓炎，自身免疫性，實驗性；巨噬細胞；TLR/NF-B通路；神經(jīng)通路

實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)炎性脫髓鞘疾病的理想動物模型，它與多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)的臨床表現(xiàn)、免疫及病理特征相似[1]。

1材料和方法

1.1實驗動物選取C57BL/6雌性小鼠16只，鼠齡8～10周，體重18～20 g，購自北京維通利華公司。

1.2主要試劑及儀器包括小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白35-55 肽(MOG35-55，西安聯(lián)美生物科技有限公司合成)、完全福氏佐劑(Sigma公司)、結核分枝桿菌(TB，BD公司)、百日咳毒素(PTX，ENZO公司)、Bio-RAD凝膠成像分析(Bio-RAD 公司)、BCA蛋白定量試劑盒(欣科中晶生物技術有限公司)、ECL化學發(fā)光試劑盒(Millipore公司)、ELISA試劑盒(Peprotech公司)。

1.3方法

1.3.1模型制備及分組：將4 mg MOG35-55肽段溶于0.8 mL生理鹽水，4 mg TB溶于0.8 mL 完全福氏佐劑(含0.8 mg TB)；將兩種溶液用針管混合器等體積充分混合為油包水樣乳白色混懸液，取一滴乳劑滴于水上，若乳劑不擴散為合格。將實驗小鼠按體重18、19、20 g分層后再隨機分入EAE模型組和Fasudil治療組，每組8只。給予小鼠皮下注射MOG35-55福氏完全佐劑0.1 mL/只，于免疫后當天和48 h后注射PTX 300 ng。免疫后第3天Fasudil治療組小鼠給予5 mg/mL Fasudil灌胃200 μL(溶劑生理鹽水)直到免疫后第27天；EAE模型組以相同方式給予等量生理鹽水。模型制備成功的標準為：有EAE臨床癥狀且脊髓病理切片中有大量炎性細胞浸潤及髓鞘脫失。免疫后第10天EAE組小鼠開始陸續(xù)發(fā)病，在第14天進入發(fā)病高峰期，發(fā)病率達100%。

1.3.2免疫組化：免疫第28天處死動物，兩組小鼠各隨機選取4只，以4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛灌流進行體內(nèi)組織固定，分離脊髓，包埋后行冷凍切片，切片厚10 μm，切片以4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛固定10 min，PBS洗5 min×3次；分別加抗大鼠一抗CD68(1∶1000)和抗大鼠CD4(1∶1000)，4℃ 孵育過夜。次日PBS再次洗3次，分別加 DyLight 488熒光標記的抗大鼠的二抗(1∶1000)，室溫孵育2 h后，甘油封片，光鏡下觀察脊髓組織白質(zhì)區(qū)CD68和CD4陽性細胞熒光強度，并用Image pro plus 軟件計數(shù)小鼠脊髓白質(zhì)區(qū)陽性細胞數(shù)，結果取均值。

1.3.4ELISA檢測：取兩組各4只小鼠脾細胞，研磨制備單細胞懸液，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書，于492 nm波長測定細胞因子白細胞介素(IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-10、干擾素γ(IFN-γ)和IL-17吸光度。同時制作標準曲線，測定并計算各細胞因子分泌分泌水平。

1.4統(tǒng)計學處理采用GraphPad Prism5.0進行分析處理，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1兩組CD4+T細胞和CD68巨噬細胞表達Fasudil治療組小鼠脊髓CD4+T細胞與CD68巨噬細胞較EAE模型組明顯降低(P<0.01)。結果見圖1和表1。

表1　兩組小鼠脊髓CD4+T細胞與CD68

iNOS：誘導型一氧化氮合酶，Arg-1：精氨酸酶1，p-NF-B：磷酸化核因子B，TLR：Toll樣受體，表2同；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶圖2　Western blot檢測兩組小鼠脊髓各種蛋白表達

EAE：實驗性自身免疫性腦脊髓炎，表1～3、圖2同；右側圖分別為左側圖中方框部分的放大圖像圖1　兩組小鼠脊髓CD4+T細胞和CD68巨噬細胞表達(免疫熒光染色)

組 別iNOS蛋白Arg-1蛋白p-NF-B蛋白TLR-2蛋白TLR-4蛋白EAE模型組0.33±0.090.14±0.040.10±0.020.34±0.040.23±0.03Fasudil治療組0.19±0.030.39±0.060.07±0.010.25±0.040.14±0.03t值2.506.082.733.133.680P值0.030.000.030.040.012

表3　ELISA檢測兩組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清液中各細胞因子表達水平

注：IL：白細胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子α；TNF-γ：γ干擾素

2.3ELISA檢測兩組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清液細胞因子表達Fasudil治療組脾細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17和IFN-γ水平均低于EAE模型組(P<0.05)，而IL-10水平高于EAE模型組(P<0.05)。結果見表3。

3討論

目前針對MS的治療仍缺乏經(jīng)濟有效的手段，糖皮質(zhì)激素多用于MS 急性發(fā)作期的治療，但短期應用對MS長期功能恢復并無明顯療效；環(huán)孢素等免疫抑制劑對進展型MS 有一定治療作用，但長期應用不良反應較大；免疫球蛋白治療可縮短病程、加速神經(jīng)功能恢復，但價格昂貴且對多次復發(fā)者和進展型MS效果不理想[11-13]。MS屬慢性病，上述藥物的給藥方式多為皮下注射和靜脈點滴，長期用藥不便?？诜o藥是臨床上常用的給藥方式，具有方便安全的優(yōu)點。

在EAE發(fā)病情況下，CD4+T細胞通過血-腦脊液屏障進入CNS，經(jīng)抗原提呈激活CNS內(nèi)小膠質(zhì)細胞，在小鼠發(fā)病28 d左右，進入慢性損傷期，小膠質(zhì)細胞分泌TNF-α、IL-6 、IL-1等致炎性細胞因子，形成炎性微環(huán)境，更多的CD4+T細胞和巨噬細胞進入CNS，放大炎性反應，最終導致神經(jīng)元的變性死亡。而Fasudil可影響炎性細胞向CNS的移行[14]和改善血管內(nèi)皮細胞的完整性[15]。本研究結果顯示，F(xiàn)asudil組CD4+T細胞浸潤較少，外周巨噬細胞CD68進入CNS極少。

Fasudil不僅可抑制炎性細胞浸潤，而且可以調(diào)節(jié)M1和M2型巨噬細胞免疫應答的平衡。巨噬細胞根據(jù)其特有的表型和功能不同，分為經(jīng)典活化M1炎性巨噬細胞，以分泌IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS/CD11b+、CD16/32、iNOS、IL-12或IL-23增加為特征；替代性活化的M2抗炎巨噬細胞以分泌IL-10、Arg-1/CD11b+、CD206、IL-10、CD23或IL-4/13增加為特征。本研究選取iNOS和CD68為CNS M1型巨噬細胞的表型標志，Arg-1為M2型表型標志，結果顯示，F(xiàn)asudil可抑制CNS中iNOS和CD68表達，增加Arg-1表達，促使致炎性的M1型巨噬細胞向抗炎保護性M2型轉化，同時抑制外周免疫細胞分泌炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17和IFN-γ表達，增加 IL-10表達。

在MS急性期和復發(fā)期，TLR2能夠促進CNS大量的促炎性因子表達以及巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞表達[17]。TLR4與配體結合后，可導致CNS小膠質(zhì)細胞過度激活產(chǎn)生炎性因子，損傷神經(jīng)元。體外實驗證明，用丙泊酚或Fasudil干預經(jīng)過LPS刺激的BV2細胞，其TLR4蛋白表達和炎性因子表達受到抑制，推測Fasudil通過下調(diào)TLR4受體表達，從而抑制抗炎性反應因子(如IL-10)的過度釋放，發(fā)揮對小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)保護作用[18-19]。這與本研究的結果一致。

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(本文編輯：時秋寬)

YUJingwen，ZHANGHui，SONGGuobin，LIZiqing，YUJiezhong，LIUChunyun，ZHANGHaifei，LIUJianchun，WANGQing，XIAOBaoguo，LIYanhua，MACungen*.

*InstituteofBrainScience，ShanxiDatongUniversity，Datong037009，China；“2011”CollaborativeInnovationCenter/ReaserchCenterofNeurobiology，ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Taiyuan030024，ChinaCorresponding author：MA Cungen，Email：macungen2001@163.com

ABSTRACT：ObjectiveTo explore the effect and mechanism of oral fasudil on macrophages and TLR/NF-B pathway in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE) .MethodsEAE models were induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide(MOG35-55) in C57BL/6 mice.The models were randomly divided into the EAE group and the fasudil group.Mice in the fasudil group were intragastrically infused with fasudil one time every day from the 3rd day after immunization to the 27th day.Mice in the EAE group were treated with the same dosage of saline.CD4+T cells and CD68 macrophages expressions in the spinal cord tissue were observed by light microscope.The expression of iNOS，Arg-1，TLR -2，TLR-4 and p-NF-B in spinal cord were detected by western blot.The cytokine of splenocyte cells cultured for 72 h were analyzed by ELISA. ResultsThe number of CD4+T cells and CD68 macrophages decreased in the fasudil group(P<0.01).iNOS phenotype of macrophages M1 was inhibited(P<0.05)，and the expression of M2 phenotypic Arg-1 increased(P<0.01).The expression of inflammatory signaling pathway proteins including p-NF-B，TLR-2 and TLR-4 reduced(P<0.05).Macrophage inflammatory cytokines including IL-6，IL-1β and TNF-α decreased(P<0.05)，and secretion of IL-10 increased(P<0.05)，T cells inflammatory cytokine IL-17 and IFN-γ decreased(P<0.05).ConclusionsOral treatment with fasudil inhibits CD4+T cells/CD68 macrophages activation，improves the conversion from macrophage phenotype M1 to M2，and inhibits the expression of p-NF-B，TLR-2 and TLR-4 in spinal cord.Inflammatory cytokines secreted by macrophages and T cells in spleen are inhibited，and the secretion of IL-10 increases.

Key words：encephalomyelitis，autoimmune，experimental；macrophages；TLR/NF-B pathway；neural pathways

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.03.003

基金項目：國家自然科學基金2012年面上項目(81272163)；山西中醫(yī)學院“2011”培育計劃項目(2011PY-1)；山西省國際科技合作項目(2013081058)；山西省回國留學人員重點科研資助項目(2014-重點7)；大同大學?？蒲许椖?2015Q15)

通訊作者：馬存根，Email：macungen2001@163.com

中圖分類號：R744.5+1

文獻標志碼：A

文章編號：1006-2963(2016)03-0172-05

(收稿日期：2015-12-23)