洪樂鵬　邵帥　汪光亮

511436 廣州醫(yī)科大學(xué)人體解剖教研室

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Purmorphamine對(duì)BV2細(xì)胞帕金森病相關(guān)基因Nurr1表達(dá)的影響

洪樂鵬邵帥汪光亮

511436 廣州醫(yī)科大學(xué)人體解剖教研室

摘要：目的探討Purmorphamine(PM)激活小膠質(zhì)細(xì)胞瘤BV2細(xì)胞中Sonic hedgehog(SHH)信號(hào)通路對(duì)帕金森病(PD)相關(guān)基因Nurr1表達(dá)的影響。 方法體外培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞并分為對(duì)照組、脂多糖(LPS)處理組、PM+LPS處理組以及PM處理組，運(yùn)用熒光定量PCR(Q-PCR)檢測(cè)經(jīng)LPS處理后BV2細(xì)胞中SHH信號(hào)通路Smoothened(Smo)、Gli1 及Nurr1 基因mRNA 表達(dá)情況；PM激活SHH信號(hào)通路后，Q-PCR檢測(cè)Nurr1 mRNA含量以及炎性反應(yīng)因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果(1)與對(duì)照組相比，LPS處理后4 h和24 h時(shí)Smo和Gli1 mRNA表達(dá)均升高(P<0.01，P<0.05)；(2)與對(duì)照組相比，PM處理組細(xì)胞Smo和Gli1 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，LPS組Nurr1、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)亦均升高(均P<0.01)；而PM+LPS組Nurr1、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)均較LPS處理組下降(均P<0.01)。結(jié)論P(yáng)M激活SHH信號(hào)通路能夠抑制BV2細(xì)胞中Nurr1的表達(dá)，并能發(fā)揮抑制炎性反應(yīng)作用。

關(guān)鍵詞：Purmorphamine；BV2細(xì)胞；帕金森?。籒urr1；炎癥

帕金森病(Parkinson disease，PD)多發(fā)生于中老年人，是第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元丟失、死亡，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體內(nèi)多巴胺(DA)含量下降，殘存神經(jīng)元內(nèi)形成以α-突觸核蛋白為主要成分的路易小體，其癥狀主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢(shì)平衡障礙，可伴有焦慮、抑郁、睡眠障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀[1]。其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，越來越多的證據(jù)顯示小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及其參與的神經(jīng)炎性反應(yīng)在PD的發(fā)病中扮演重要角色[2]，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可加速誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)以及促炎因子如白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)[3-5]，這些均與PD患者和PD模型黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的退變有關(guān)。孤核受體家族成員Nurr1 基因不僅在維持多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育和分化中起重要作用，而且在抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)基因表達(dá)以及在炎性反應(yīng)中保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)揮重要的作用[4]。

作為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要信號(hào)通路——Sonic hedgehog(SHH)信號(hào)通路對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育、分化具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[6]。體外研究表明SHH對(duì)氧化應(yīng)激損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用[7]。Purmorphamine(PM)作為SHH信號(hào)通路的激活劑，能夠與SHH通路中的Smo結(jié)合調(diào)控SHH信號(hào)通路的激活，但目前關(guān)于PM激活SHH通路對(duì)Nurr1基因表達(dá)的影響報(bào)道較少。

1材料和方法

1.1材料BV2細(xì)胞株由南方醫(yī)科大學(xué)人體解剖教研室惠贈(zèng)。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、青霉素、鏈霉素購自美國(guó)GIBCO公司，脂多糖(LPS，E.coli serotypeO55：B5)購自美國(guó)Sigma公司，PM購自美國(guó)Santa Cruz公司，Trizol 購自美國(guó)Invitrogen 公司。RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、RNase-free H2O購自TakaRa公司。

1.2方法

1.2.1BV2細(xì)胞培養(yǎng)：將小膠質(zhì)細(xì)胞瘤BV2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM(高糖)+10%胎牛血清+100 U/mL雙抗，置于37℃、含5% CO2空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合度達(dá)70%～80%左右，用胰酶消化，按1∶3傳代。

1.2.2細(xì)胞處理及分組：細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好后消化細(xì)胞，以1×105/ mL接種于6孔板培養(yǎng)，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2 天換液后將細(xì)胞分為4組：LPS處理組給予1 μg/mL LPS孵育，并于4 h和24 h提取RNA；PM處理組給予1.5 μmol/L PM孵育24 h后提取RNA；PM+LPS共孵育組給予1.5 μmol/L PM孵育24 h，然后加入1 μg/mL LPS繼續(xù)孵育24 h，提取RNA；對(duì)照組給予等量生理鹽水。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Smo、Gli1、IL-1β、TNF-α、Nurr1 mRNA表達(dá)水平。Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，添加表1中相關(guān)引物(Invitrogen 公司合成)擴(kuò)增各基因。用Nano-Drop-1000分光光度計(jì)、ABI 7500軟件檢測(cè)Smo、Gli1、IL-1β、TNF-α、Nurr1 mRNA表達(dá)水平。熒光定量PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，擴(kuò)增完畢后分析擴(kuò)增曲線和溶解曲線。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

表1　RT-PCR檢測(cè)引物

注：IL-1β：白細(xì)胞介素-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，兩均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1LPS對(duì)BV2 細(xì)胞SHH信號(hào)通路的影響LPS作用BV2細(xì)胞4、24 h時(shí)SHH通路相關(guān)基因Smo、Gli1 mRNA水平較生理對(duì)照組均明顯上調(diào)(P<0.01，P<0.05)，表明在LPS作用下小膠質(zhì)細(xì)胞中內(nèi)源性SHH信號(hào)通路激活(表2)。

表2　LPS作用不同時(shí)間BV2 細(xì)胞中Smo和

注：LPS：脂多糖

2.2PM對(duì)BV2 細(xì)胞SHH信號(hào)通路的影響PM處理24 h后Smo、Gli1 mRNA水平均較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，表明PM可激活SHH信號(hào)通路(表3)。

表3　PM作用24 h時(shí)BV2 細(xì)胞中Smo、Gli1 mRNA

注：PM：Purmorphamine

2.3PM 激活SHH信號(hào)通路對(duì)BV2細(xì)胞Nurr1基因表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，LPS處理后Nurr1 mRNA 表達(dá)上調(diào)(P<0.01)；與LPS組相比，PM預(yù)處理后能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的Nurr1 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，表明PM激活SHH信號(hào)通路后對(duì)Nurr1 mRNA表達(dá)有抑制作用(表4)。

表4　各組BV2細(xì)胞Nurr1、IL-1β、TNF-α mRNA

注：與對(duì)照組相比，aP<0.01；與LPS處理組相比，bP<0.01；與PM+LPS組相比，cP<0.05

2.4PM激活SHH信號(hào)通路對(duì)BV2細(xì)胞炎性反應(yīng)因子表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，LPS處理后IL-1β、TNF-α mRNA明顯增高(均P<0.01)；與LPS處理組相比，PM處理后能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)(均P<0.01)；與PM+LPS組相比，PM單獨(dú)處理后TNF-α mRNA明顯下調(diào)(P<0.05)，IL-1β有下調(diào)趨勢(shì)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明PM激活SHH信號(hào)可發(fā)揮抑制炎性反應(yīng)作用(表4)。

3討論

PD是世界上第二大與年齡有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于中老年人，65歲以上老年人患病率為1%，85歲以上者患病率為5%[8]。目前PD的治療方法主要針對(duì)伴隨癥狀，而不能干預(yù)其進(jìn)程，因此有關(guān)PD的發(fā)病機(jī)制及治療研究顯得更為重要。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并與PD的神經(jīng)退變極為密切。本研究選用BV2細(xì)胞作為研究PD的炎性反應(yīng)細(xì)胞模型，探討了PM激活BV2細(xì)胞中SHH信號(hào)通路對(duì)PD相關(guān)基因Nurr1表達(dá)的影響。

SHH信號(hào)通路是與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)的重要通路，在神經(jīng)損傷的修復(fù)過程中也起著一定的作用。有研究發(fā)現(xiàn)在PD模型中腦黑質(zhì)區(qū)存在SHH信號(hào)通路激活，可能與多巴胺能神經(jīng)元的損傷修復(fù)有關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，在LPS作用下BV2細(xì)胞Smo、Gli1 mRNA表達(dá)升高，提示在細(xì)胞炎性反應(yīng)狀態(tài)下導(dǎo)致了內(nèi)源性SHH信號(hào)通路的激活，但其具體機(jī)制不明，間接表明SHH信號(hào)通路與神經(jīng)炎性反應(yīng)在PD的發(fā)病機(jī)制中存在著一定聯(lián)系，共同影響疾病的發(fā)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PM激活SHH信號(hào)通路對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞中的Nurr1基因有抑制作用，其中抑制炎性反應(yīng)的具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究查證，這為從炎性反應(yīng)方向研究PD提供了新的思考，為PD的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

Effect of purmorphamine on Parkinson′s disease-related Nurr1 gene expression in BV2 cells

HONGLepeng*，SHAOShuai，WANGGuangliang.

*DepartmentofAnatomy，GuangzhouMedicalUniversity，GuangzhouGuangdong511436，ChinaCorresponding author：HONG Lepeng，Email：honglepeng@163.com

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the effect of Sonic hedgehog(SHH)signaling pathway activated by purmorphamine(PM)on the expression of Parkinson-related gene Nurr1 in BV2 microglial cells.Methods The routinely cultured BV2 microglial cells in vitro were divided into the control group，the lipopolysaccharide(LPS)group，the PM + LPS group and the PM group.Real time quantitative PCR was used to detect contents of SHH relevant gene Smoothened(Smo)，Gli1 and Nurr1 mRNA in BV2 cell after LPS stimulation.The contents of Nurr1 and the expression of inflammatory factor -1β(IL-1β)，tumor necrosis factor-α(TNF-α)mRNA were detected by real time quantitative PCR after SHH signaling pathway activation by PM. Results(1)Compared with the control group，the expression levels of Smo and Gli1 significantly increased 4 hours and 24 hours after LPS stimulation (P<0.01，P<0.05).(2)Compared with the control group，the expression levels of Smo and Gli1 significantly increased after PM treatment(P<0.01，respectively).The expression levels of Nurr1 and IL-1β，TNF-α also significantly increased in the LPS group(P<0.01，respectively).Compared with the LPS group，the expression levels of Nurr1，IL-1β and TNF-α decreased in the PM + LPS group(P<0.01，respectively). ConclusionsSHH signaling pathways activated by PM can inhibit the expression of Nurr1 in BV2 cells，and play a role in inhibiting inflammation.

Key words：purmorphamine；BV2 cell；Parkinson′s disease；Nurr1；inflammation

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.03.009

基金項(xiàng)目：廣東省科學(xué)技術(shù)廳資助項(xiàng)目(201301)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金廳資助項(xiàng)目(A2013239)

通訊作者：洪樂鵬，Email：honglepeng@163.com

中圖分類號(hào)：R741.05

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2963(2016)03-0195-04

(收稿日期：2015-12-01)