陳緒勇 焦春雷 付康 馮晨釗 朱天琦 柯昌庶 馮杰雄

巨噬細(xì)胞表型改變在先天性巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎中的研究

陳緒勇 焦春雷 付康 馮晨釗 朱天琦 柯昌庶 馮杰雄

目的 通過檢測先天性巨結(jié)腸患兒結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞表型的改變，探討巨噬細(xì)胞活化與巨結(jié)腸相關(guān)性腸炎發(fā)病之間的關(guān)系。方法 收集先天性巨結(jié)腸患兒(腸炎組4例，非腸炎組6例)結(jié)腸遠(yuǎn)段及近段標(biāo)本，行HE染色、評估各段腸管炎癥損傷程度，CD68和iNOS免疫熒光雙染法評估M1型巨噬細(xì)胞活化狀況，CD68和Arg-1免疫熒光雙染法評估M2型巨噬細(xì)胞活化狀況，RT-qPCR檢測各組腸管iNOS及Arg-1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 免疫熒光染色顯示，腸炎組近段結(jié)腸iNOS/CD68陽性細(xì)胞的百分比(73.12±2.48)%明顯高于腸炎組遠(yuǎn)段結(jié)腸(54.19±1.98)%、非腸炎組近段結(jié)腸(49.35±2.70)%及遠(yuǎn)段結(jié)腸(43.18±4.21)%；而腸炎組近段結(jié)腸Arg-1/CD68陽性細(xì)胞的百分比(33.15±4.81)%明顯低于遠(yuǎn)段結(jié)腸(49.32±3.98)%；非腸炎組近段結(jié)腸Arg-1/CD68陽性細(xì)胞的百分比(45.23±1.95)%亦低于遠(yuǎn)段結(jié)腸(56.52±2.79)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-qPCR結(jié)果顯示，腸炎組近段結(jié)腸iNOS表達(dá)明顯升高，而Arg-1表達(dá)則在腸炎組及非腸炎組的遠(yuǎn)段結(jié)腸升高(P<0.05)。結(jié)論 先天性巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎的發(fā)生可能與巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化有關(guān)。

先天性巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎； 巨噬細(xì)胞表型

先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung’s disease，HD)是由于腸道神經(jīng)嵴細(xì)胞自近段向遠(yuǎn)段發(fā)生遷移失敗，導(dǎo)致結(jié)腸遠(yuǎn)段黏膜下層及肌間層缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，進(jìn)而引起腹脹及腸梗阻等癥狀[1]。巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎(Hirschsprung’s disease associated enterocolitis，HAEC)是HD最常見的并發(fā)癥，HAEC在術(shù)前發(fā)生率為6%～26%，在根治術(shù)后發(fā)生率為5%～42%[2-3]。HAEC具體發(fā)病機(jī)制不明確，可能與結(jié)腸近段腸管擴(kuò)張、腸壁黏膜屏障破壞、細(xì)菌移位及感染、黏蛋白改變、黏膜內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量減少、基因表達(dá)改變等有關(guān)[4-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在HAEC患兒腸道組織中，免疫球蛋白如IgA、IgM表達(dá)升高，CD68陽性的單核巨噬細(xì)胞、CD45RO陽性的中性粒細(xì)胞及CD57陽性的NK細(xì)胞表達(dá)均升高[6]。此外，我們對EdnrB基因敲除的HD模型小鼠研究發(fā)現(xiàn)，在3周齡發(fā)生腸炎的小鼠中，結(jié)腸近段CD68陽性的巨噬細(xì)胞比例明顯增加[7]。這些研究表明，腸道免疫細(xì)胞參與了HAEC的發(fā)生發(fā)展，但是巨噬細(xì)胞表型的改變在人類HD及其腸炎患兒的腸管中是否存在差異尚不明確，本文進(jìn)一步探討巨噬細(xì)胞在HAEC發(fā)病中的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、臨床資料

收集我院2015年1月至2016年1月診斷為HD并進(jìn)行手術(shù)治療、術(shù)后病理確診為無神經(jīng)細(xì)胞癥的病例，排除合并有其他先天性疾病及其他系統(tǒng)感染的病例。術(shù)中獲取結(jié)腸標(biāo)本，分為結(jié)腸近端擴(kuò)張段及遠(yuǎn)端狹窄段，結(jié)腸標(biāo)本一部分標(biāo)本置于-80℃冰箱保存以備RT-qPCR使用；另部分標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋、HE染色，在光鏡下觀察腸管組織形態(tài)學(xué)變化。采用文獻(xiàn)報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)評估腸道組織的炎癥損傷程度：0級，正常黏膜；Ⅰ級，隱窩擴(kuò)張或隱窩存在黏蛋白；Ⅱ級，隱窩炎或每高倍鏡下小于2個(gè)隱窩膿腫；Ⅲ級，每個(gè)高倍鏡下多個(gè)隱窩膿腫；Ⅳ級，腸管纖維素樣膿性壞死或黏膜潰瘍形成；Ⅴ級，腸壁全層壞死或穿孔，每個(gè)組織標(biāo)本觀察5個(gè)視野，病理評分大于或等于Ⅱ級判定為HAEC[8]，并用于實(shí)驗(yàn)。最終選取腸炎組(HAEC組)4例，非腸炎組(HD組)6例，男7例，女3例，平均月齡(10.8±2.7)個(gè)月，所有研究對象均征得患兒家屬同意并簽訂知情同意書。

二、主要試劑儀器

巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD68抗體購于Abcam公司(美國)，巨噬細(xì)胞M1型標(biāo)志物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抗體購于Santa Cruz公司(美國)，巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)志物精氨酸酶1(Arg-1)抗體購于武漢三鷹公司(中國)，熒光素FITC標(biāo)記的二抗及熒光素Cy3標(biāo)記的二抗購于碧云天生物技術(shù)公司(中國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qPCR試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司(中國)。倒置熒光顯微鏡NIKON ECLIPSE TI SR(日本尼康)，BIO-RAD C1000TM PCR儀(美國)。

三、免疫熒光雙染法

腸組織石蠟切片(5 μm)使用透明脫蠟劑脫蠟、不同梯度的乙醇水化。將切片置于含0.01 mol/L枸櫞酸鈉修復(fù)液的修復(fù)盒中采用微波爐加熱法進(jìn)行抗原修復(fù)15 min。3%過氧化氫孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。6%BSA封閉30 min，滴加1∶200稀釋的大鼠抗小鼠CD68抗體及1∶200稀釋的兔抗小鼠iNOS抗體(或兔抗小鼠Arg-1抗體)，4 ℃孵育過夜。滴加Cy3標(biāo)記的山羊抗大鼠熒光二抗及FITC標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗，室溫下孵育1 h，DAPI染核，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察，綠色激發(fā)光可激發(fā)Cy3發(fā)出紅色熒光，藍(lán)色激發(fā)光可激發(fā)FITC發(fā)出綠色熒光，紫外光可激發(fā)DAPI發(fā)出藍(lán)色熒光。使用Image-pro plus 6.0軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野下紅色熒光及綠色熒光陽性的細(xì)胞所占的比率，每個(gè)標(biāo)本取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)所有標(biāo)本，取其平均值。

四、RT-qPCR檢測

引物均由Invitrogen Biotechnology Co.,LTD中國公司設(shè)計(jì)合成，其中iNOS引物序列為5’-3’：TTCAGTATCACAACCTCAGCAAG；3’-5’：TGGACCTGCAAGTTAAAATCCC。Arg-1引物序列為5’-3’：GTGGAAACTTGCATGGACAAC；3’-5’：AATCCTGGCACATCGGGAATC。采用Trizol法提取各組病例結(jié)腸組織中的RNA，并使用酶標(biāo)儀檢測RNA的濃度，依照標(biāo)本最小濃度值為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整各組RNA的濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再依照qPCR試劑說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用ΔΔCT法計(jì)算。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、結(jié)腸組織病理學(xué)改變

結(jié)腸標(biāo)本采用HE染色(圖1)，鏡下見HAEC組結(jié)腸近段(圖1A)隱窩明顯增大，并有多個(gè)隱窩膿腫，黏膜固有層可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，病理評級為Ⅲ級；HAEC組結(jié)腸遠(yuǎn)段(圖1B)可見隱窩炎，固有層炎癥細(xì)胞浸潤等，病理評級為Ⅱ級。HD組近段結(jié)腸(圖1C)可見未見隱窩膿腫，病理評級為0級，HD結(jié)腸遠(yuǎn)段(圖1D)未見隱窩異常，黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，病理評級為0級。所有收集病例中，HAEC組結(jié)腸近段、遠(yuǎn)段病理評級均≥Ⅱ級，病理改變符合腸炎標(biāo)準(zhǔn)；HD組結(jié)腸近段、遠(yuǎn)段病理評級<Ⅱ級，不符合腸炎標(biāo)準(zhǔn)。

二、CD68及iNOS免疫熒光雙染法檢測M1型巨噬細(xì)胞在結(jié)腸組織中的分布

結(jié)腸組織CD68(紅色熒光)及iNOS(綠色熒光)免疫熒光雙染顯示(圖2)，HAEC組結(jié)腸近段可見大量的CD68陽性的巨噬細(xì)胞，并且iNOS陽性細(xì)胞數(shù)量增加(圖2A～D)；而HAEC組結(jié)腸遠(yuǎn)段CD68及iNOS陽性的細(xì)胞數(shù)量均減少(圖2E～H)。HD組結(jié)腸近段及遠(yuǎn)段CD68陽性細(xì)胞及iNOS陽性的細(xì)胞均明顯偏低(圖2I～P)。HAEC組結(jié)腸近段、遠(yuǎn)段CD68陽性的細(xì)胞占總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)分別為(19.61±1.78)%、(10.55±3.41)%；HD組結(jié)腸近段、遠(yuǎn)段CD68陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為(6.03±1.17)%、(6.42±0.98)%。HAEC組結(jié)腸近段、遠(yuǎn)段iNOS陽性的細(xì)胞占CD68陽性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為(73.12±2.48)%、(54.19±1.98)%；HD組結(jié)腸近段、遠(yuǎn)段iNOS陽性的細(xì)胞占CD68陽性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為(49.35±2.70)%、(43.18±4.21)%。與HAEC組結(jié)腸遠(yuǎn)段及HD組結(jié)腸近段、遠(yuǎn)段相比，HAEC組結(jié)腸近段CD68陽性巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，iNOS陽性的細(xì)胞百分比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

三、CD68及Agr-1免疫熒光雙染法檢測M2型巨噬細(xì)胞在結(jié)腸組織中的分布

結(jié)腸組織CD68(紅色熒光)及Arg-1(綠色熒光)免疫熒光雙染顯示(圖3)，HAEC組結(jié)腸近段可見明顯的CD68陽性的細(xì)胞浸潤，但Arg-1陽性的細(xì)胞數(shù)量偏低(圖3A～D)；HAEC結(jié)腸遠(yuǎn)段CD68陽性的細(xì)胞數(shù)量有所減少，而仍有一定量的Arg-1陽性的細(xì)胞(圖3E～H)。HD組結(jié)腸近段CD68陽性的細(xì)胞及Arg-1陽性的細(xì)胞明顯減少(圖3I～L)；HD組結(jié)腸遠(yuǎn)段CD68陽性的細(xì)胞較少，但仍有一定量的Arg-1陽性的細(xì)胞(圖3M～P)。HAEC組結(jié)腸近段、遠(yuǎn)段Arg-1陽性的細(xì)胞占CD68陽性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為(33.15±4.81)%、(49.32±3.98)%；HD組結(jié)腸近段、遠(yuǎn)段Arg-1陽性的細(xì)胞占CD68陽性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為(45.23±1.95)%、(56.52±2.79)%。HAEC組遠(yuǎn)段Arg-1陽性的細(xì)胞數(shù)較HAEC組近段Arg-1陽性的細(xì)胞數(shù)升高；HD組遠(yuǎn)段Arg-1陽性的細(xì)胞數(shù)亦較HD組近段Arg-1陽性的細(xì)胞數(shù)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

四、結(jié)腸組織iNOS及Arg-1 mRNA的相對表達(dá)量比較

采用RT-qPCR法檢測HAEC及HD結(jié)腸組織iNOS(圖4)、Arg-1(圖5)的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與HAEC組遠(yuǎn)段比較，iNOS的表達(dá)在HAEC組結(jié)腸近段明顯升高(P=0.007)；并且HAEC組近段iNOS的表達(dá)均較HD組近段(P=0.010)及HD組遠(yuǎn)段(P=0.008)升高。HAEC組結(jié)腸遠(yuǎn)段Arg-1的表達(dá)水平較HAEC組結(jié)腸近段明顯升高(P<0.000 1)；HD組中結(jié)腸遠(yuǎn)段Arg-1的表達(dá)量亦較HD組結(jié)腸近段升高(P=0.000 2)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A.HAEC結(jié)腸近段;B.HAEC結(jié)腸遠(yuǎn)段;C.HD結(jié)腸近段;D.HD結(jié)腸遠(yuǎn)段圖1 結(jié)腸組織病理學(xué)改變HE染色(×200)

A.HAEC結(jié)腸近段CD68染色;B.HAEC結(jié)腸近段iNOS染色;C.HAEC結(jié)腸近段細(xì)胞核染色;D.HAEC結(jié)腸近段合成圖片;E.HAEC結(jié)腸遠(yuǎn)段CD68染色;F.HAEC結(jié)腸遠(yuǎn)段iNOS圖;G.HAEC結(jié)腸遠(yuǎn)段細(xì)胞核染色;H.HAEC結(jié)腸遠(yuǎn)段合成圖片;I.HD結(jié)腸近段CD68染色;J.HD結(jié)腸近段iNOS染色;K.HD結(jié)腸近段細(xì)胞核I染色;L.HD結(jié)腸近段合成圖片;M.HD結(jié)腸遠(yuǎn)段CD68染色;N.HD結(jié)腸遠(yuǎn)段iNOS染色;O.HD結(jié)腸遠(yuǎn)段細(xì)胞核染色;P.HD結(jié)腸遠(yuǎn)段合成圖片圖2 CD68及iNOS免疫熒光雙染(×200)

A.HAEC結(jié)腸近段CD68染色;B.HAEC結(jié)腸近段Arg-1染色;C.HAEC結(jié)腸近段細(xì)胞核染色;D.HAEC結(jié)腸近段合成圖片;E.HAEC結(jié)腸遠(yuǎn)段CD68染色;F.HAEC結(jié)腸遠(yuǎn)段Arg-1圖;G.HAEC結(jié)腸遠(yuǎn)段細(xì)胞核染色;H.HAEC結(jié)腸遠(yuǎn)段合成圖片;I.HD結(jié)腸近段CD68染色;J.HD結(jié)腸近段Arg-1染色;K.HD結(jié)腸近段細(xì)胞核I染色;L.HD結(jié)腸近段合成圖片;M.HD結(jié)腸遠(yuǎn)段CD68染色;N.HD結(jié)腸遠(yuǎn)段Arg-1染色;O.HD結(jié)腸遠(yuǎn)段細(xì)胞核染色;P.HD結(jié)腸遠(yuǎn)段合成圖片圖3 CD68及Arg-1免疫熒光雙染(×200)

注:與其他組比較,*P<0.05圖4 HAEC及HD結(jié)腸組織iNOSmRNA的相對表達(dá)量

注:與HAEC結(jié)腸近段比較,*P<0.05;與HD結(jié)腸近段比較,#P<0.05圖5 HAEC及HD結(jié)腸組織Arg-1mRNA的相對表達(dá)量

討 論

自從Harald Hirschsprung發(fā)現(xiàn)并報(bào)告首例HD以來，HD的發(fā)病機(jī)制已經(jīng)有了很深入的研究。尤其是影響神經(jīng)嵴干細(xì)胞發(fā)育的基因因素，編碼序列、非編碼序列的突變，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的分子機(jī)制研究，以及基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，使得進(jìn)行腸道干細(xì)胞移植并促使其發(fā)育為成熟腸道神經(jīng)元成為可能，但是，這些研究主要集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面[9-10]。目前，手術(shù)切除無神經(jīng)節(jié)段腸管仍然是治療HD最為有效的治療手段，而術(shù)后HD患兒仍會(huì)發(fā)生小腸結(jié)腸炎等，并且術(shù)前術(shù)后HAEC發(fā)病概率無明顯差異[2]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)HAEC的發(fā)生與手術(shù)本身無關(guān)[11]。這些研究提示我們，HAEC的發(fā)生可能與單純切除無神經(jīng)節(jié)段腸管并無直接聯(lián)系，而另有其他因素參與其中。

HAEC發(fā)病可能存在多種高危因素，包括HD家族病史、合并21-三聯(lián)體綜合征、Bardet-Biedl綜合征、長段型HD、HD確診時(shí)間延遲及反復(fù)發(fā)生過腸炎等[12]。腸道黏膜屏障功能、腸道微生物及腸道免疫功能在HAEC發(fā)病過程中亦起重要作用[13]。國外研究報(bào)道，HAEC病死率在1%～10%，并且大部分發(fā)生在新生兒期，但仍不清楚這部分患兒腸炎的發(fā)生是否與免疫系統(tǒng)不成熟相關(guān)[14]。我們前期研究表明，在HD動(dòng)物模型中，發(fā)生腸炎的小鼠結(jié)腸近端擴(kuò)張段巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量明顯增加并且炎癥因子TNF-α表達(dá)水平明顯升高[7]。巨噬細(xì)胞在維持機(jī)體功能中起重要作用，巨噬細(xì)胞活化可分為經(jīng)典活化(M1型)及替代活化(M2型)，M1型巨噬細(xì)胞可釋放炎癥因子(TNF-α，IL-1，IL-6，IL-12，IL-23)等，是機(jī)體宿主防御的有機(jī)組成成分，主要參與清除病原微生物等；M2型巨噬細(xì)胞主要參與組織的損傷修復(fù)及調(diào)節(jié)免疫功能等[15]。

本研究中，我們采用免疫熒光雙染法檢測人類HD結(jié)腸標(biāo)本中巨噬細(xì)胞表型的變化，結(jié)果表明，在HAEC組中，CD68陽性的巨噬細(xì)胞數(shù)量在結(jié)腸近段及遠(yuǎn)段均較HD組升高，并且HAEC組近段升高更為明顯。在對iNOS陽性的M1型巨噬細(xì)胞分析中發(fā)現(xiàn)，HAEC組近段結(jié)腸M1型巨噬細(xì)胞的百分比明顯增加，而HAEC組遠(yuǎn)段及HD組近段、遠(yuǎn)段M1型巨噬細(xì)胞均無明顯的差異，iNOS的mRNA表達(dá)水平亦證實(shí)上述結(jié)論。這些研究表明，HAEC發(fā)生可能與近端擴(kuò)張段結(jié)腸大量巨噬細(xì)胞浸潤及向M1型轉(zhuǎn)化相關(guān)。為進(jìn)一步研究M2型巨噬細(xì)胞在結(jié)腸的分布，我們采用CD68及Arg-1免疫熒光雙染法發(fā)現(xiàn)，HAEC組及HD組結(jié)腸遠(yuǎn)段的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量均較相應(yīng)組近段升高。由于M2型巨噬細(xì)胞主要參與組織的損傷修復(fù)，而且在結(jié)腸遠(yuǎn)段腸管中并無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存在，這些證據(jù)提示我們，結(jié)腸無神經(jīng)節(jié)段腸管的病理改變可能影響免疫細(xì)胞的功能。

腸道神經(jīng)系統(tǒng)由神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育分化而來，任何破壞神經(jīng)嵴細(xì)胞群數(shù)量、神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移行為及遷移速度的因素均可引起遠(yuǎn)端結(jié)腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥。目前已知基因突變、調(diào)控序列的作用、microRNA及環(huán)境因素等均可引起腸道神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂[16]。并且在人類HD中，乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶在無神經(jīng)節(jié)段腸管明顯升高而在有神經(jīng)節(jié)段降低，神經(jīng)元型一氧化氮合酶則在無神經(jīng)節(jié)段明顯降低有神經(jīng)節(jié)段升高，HD動(dòng)物模型亦證實(shí)這些神經(jīng)遞質(zhì)的改變[17-18]。另有研究報(bào)道，神經(jīng)遞質(zhì)能調(diào)控腸道免疫細(xì)胞的功能[19]。我們研究表明無論是否發(fā)生腸炎，HD遠(yuǎn)段結(jié)腸M2型細(xì)胞的比例增加，但是M2型細(xì)胞比例的增加是由無神經(jīng)節(jié)段腸管微環(huán)境改變引起的結(jié)局，還是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的主動(dòng)修復(fù)機(jī)制尚不清楚。

此外，在腸道特殊的微環(huán)境及腸道菌群共同進(jìn)化作用下，腸道巨噬細(xì)胞在定居成熟過程中低表達(dá)多種先天性免疫反應(yīng)相關(guān)分子，如LPS識別受體CD14，F(xiàn)cα識別受體CD89，F(xiàn)cγ識別受體CD64、CD32、CD16，CR3識別受體CD11b/CD18，CR4識別受體CD11c/CD18，共刺激因子CD40、CD80、CD86，髓樣細(xì)胞1觸發(fā)受體(TREM1)等，因此腸道巨噬細(xì)胞保持較弱炎癥反應(yīng)性，但仍保留吞噬功能[20-21]。我們在對HAEC近段結(jié)腸研究中發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞比例明顯增多，并且大部分巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，即表現(xiàn)為強(qiáng)炎癥反應(yīng)性，而沒有發(fā)生腸炎時(shí)，巨噬細(xì)胞數(shù)量則偏低；并且HAEC小鼠結(jié)腸近段炎癥因子如TNF-α等高表達(dá)[7]，這些研究表明HAEC中巨噬細(xì)胞的表型及功能存在改變。另有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病中CD14陽性的巨噬細(xì)胞明顯增多，并且有可能來源于外周血中的單核細(xì)胞[22]。但是，HAEC近段結(jié)腸中升高的巨噬細(xì)胞是來源于血液，還是巨噬細(xì)胞在遷移過程中發(fā)育不成熟，亦或是腸道微環(huán)境改變從而影響巨噬細(xì)胞的表型變化，尚不清楚。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)有必要對HAEC結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞表面分子的表達(dá)差異及腸道微環(huán)境對巨噬細(xì)胞的影響等作進(jìn)一步研究。

總之，HAEC發(fā)病過程中可能有多種機(jī)制的參與，包括黏膜屏障、腸道微生物及免疫功能的變化等。在本研究我們分析了巨噬細(xì)胞在HD中的分布，發(fā)現(xiàn)在HAEC近段結(jié)腸巨噬細(xì)胞明顯浸潤，并且大部分向M1型活化，這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞表型變化及HAEC的治療提供了新的思路。

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Phenotypic changes of macrophages in Hirschsprung’s disease associated enterocolitis

ChenXuyong,JiaoChunlei,FuKang,FengChenzhao,ZhuTianqi,KeChangshu,FengJiexiong.

DepartmentofPediatricSurgery,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

Correspondingauthor:FengJiexiong,Email:fengjiexiong@126.com

Objective To investigate the phenotypic changes of macrophages in patients with Hirschsprung disease,and to explore the role of macrophage activation in Hirschsprung’s associated entercolitis.Methods The distal segment of colon and proximal segments of the colon specimens in 10 patients with Hirschsprung’s disease (Entercolitis group: 4 cases; non-entercolitis group: 6 cases) were collected.HE staining was used to assess the degree of bowel inflammation injury.CD68 and iNOS immunofluorescence double staining was used to assess M1 macrophages,and CD68 and Arg-1 immunofluorescence double staining was used to assess M2 macrophages.The mRNA expression levels of iNOS and Arg-1 were detected by RT-qPCR.Results Immunofluorescence staining showed that the percentage of iNOS/CD68 positive cells in proximal segments of HAEC group [(73.12±2.48)%] was higher than that of distal segments of HAEC group [(54.19±1.98)%],proximal segments of HD group [(49.35±2.70)%] and distal segments of HD group [(43.18±4.21)%].But the percentage of Arg-1/CD68 positive cells in proximal segment colon of HAEC group [(33.15±4.81)%] was lower than in distal segment of HAEC group [(49.32±3.98)%],and percentage of Arg-1/CD68 positive cells in proximal segment colon of HD group [(45.23±1.95)%] was also lower than in distal segment of HD group [(56.52±2.79)%] (P<0.05).RT-qPCR results showed that the expression of iNOS was significantly increased in proximal segments of colon in HAEC group,but that of Arg-1 was higher in distal segment of HAEC group (P<0.05).Conclusions The occurrence of Hirschsprung’s associated entercolitis may be associated with the activation of M1 macrophages.

Hirschsprung’s associated entercolitis; Microphage phenotype

·論 著·(實(shí)驗(yàn)研究)

國家自然科學(xué)基金(81270441)

430030 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院小兒外科(陳緒勇、焦春雷、付康、朱天琦、馮杰雄)，病理科(柯昌庶)；武漢外國語學(xué)校(馮晨釗)

馮杰雄，Email：fengjiexiong@126.com

R656.9

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2016.06.018

2016-07-26)