李 嶸 鄭昊林 田秀娟 馮世棟 李 莉 于 艷 趙麗娟 周美蘭 王漢民

microRNA-497在腎小球系膜細(xì)胞焦亡中的作用及機(jī)制

李 嶸1鄭昊林2田秀娟1馮世棟1李 莉1于 艷1趙麗娟1周美蘭1王漢民1

目的：探討microRNA-497(miR-497)對(duì)高糖和胰島素誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞焦亡的調(diào)控作用。 方法：高糖和胰島素處理人腎小球系膜細(xì)胞(HRMC)，在不同時(shí)間運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞焦亡，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HRMC細(xì)胞中miR-497表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染不同濃度miR-497 mimic，檢測(cè)細(xì)胞焦亡通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)水平，運(yùn)用Western印記檢測(cè)NLRP1蛋白的表達(dá)水平；運(yùn)用生物信息學(xué)和螢光素酶報(bào)告基因技術(shù)預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-497對(duì)炎性小體NLRP1基因的靶向結(jié)合作用；miR-497 mimic和pcDNA-NLRP1分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染后檢測(cè)細(xì)胞增殖。 結(jié)果：高糖和胰島素處理48 h以上HRMC細(xì)胞焦亡水平顯著增加(P<0.05)，miR-497表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；miR-497 mimic轉(zhuǎn)染顯著抑制HRMC細(xì)胞焦亡，和焦亡通路關(guān)鍵基因IL-1β、TNFα和caspase-1表達(dá)水平下降(P<0.05)；miR-497可直接靶向作用于NLRP1基因并抑制NLRP1蛋白的表達(dá)；NLRP1過(guò)表達(dá)可消除miR-497對(duì)細(xì)胞焦亡的抑制作用。 結(jié)論：miR-497 mimic抑制高糖和胰島素誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞焦亡。

細(xì)胞焦亡 高糖和胰島素 microRNA-497 NLRP1炎性小體 半胱氨酸天冬蛋白酶1

腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)具有收縮、支持、分泌和信息傳遞等作用[1]。在糖尿病腎病患者體內(nèi)，高糖和胰島素環(huán)境刺激腎小球系膜細(xì)胞發(fā)生一些列病理反應(yīng)包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線(xiàn)粒體損傷及各種類(lèi)型的細(xì)胞壞死和程序性死亡[2]。細(xì)胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡方式，依賴(lài)炎性小體調(diào)節(jié)的半胱氨酸天冬蛋白酶1(caspase-1)裂解激活，并伴隨白細(xì)胞介素(IL)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等促炎癥因子的大量產(chǎn)生[3-4]。

最近研究表明，microRNA(miR)可調(diào)控多種糖尿病并發(fā)癥/合并癥組織細(xì)胞焦亡的過(guò)程[5-7]，對(duì)疾病進(jìn)程有重要影響。最近研究表明miR-497表達(dá)水平的下調(diào)與早期腎癌的預(yù)后不良密切相關(guān)[8]，而且miR-497可靶定調(diào)節(jié)Toll樣受體4(TLR4)和核因子κB(NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子，抑制促炎因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)，從而起到抗炎的作用細(xì)胞焦亡是有特定蛋白符合物(即炎癥小體)介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程[9]，炎癥因子的大量釋放是其主要特征之一[10]。然而，miR-497對(duì)糖尿病腎病個(gè)體腎小球系膜細(xì)胞的影響并不清楚。本研究以高糖和胰島素培養(yǎng)基刺激人腎小球系膜細(xì)胞(HRMC)焦亡，探索miR-497在腎小球系膜細(xì)胞焦亡過(guò)程中的作用和可能的分子機(jī)制。研究結(jié)果將為糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的探索和糖尿病腎病的預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

主要材料和試劑 HRMC人腎小球系膜細(xì)胞株購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；PBS、青-鏈霉素、明膠購(gòu)自天津?qū)汌紊?；miR-497實(shí)時(shí)定量PCR引物、miR-497模擬物(miR-497 mimic，即人工合成的miR-497分子)序列(miR-497)和對(duì)照模擬物(對(duì)照mimic)由廣州瑞博公司合成并進(jìn)行有效性驗(yàn)證；PCR點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自Takara公司；脂質(zhì)體3 000轉(zhuǎn)染試劑、人胰島素、葡萄糖購(gòu)自Sigma公司1 g/L胰酶溶液、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清等購(gòu)自Invitrogen公司；總RNA提取試劑盒、總蛋白提取和定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司；用于細(xì)胞焦亡檢測(cè)的caspase-1活性檢測(cè)試劑盒和PI染色試劑盒分別購(gòu)自Bloomington和Life Techology公司；PVDF膜、ECL蛋白檢測(cè)試劑盒等購(gòu)自Millipore公司；兔抗小鼠NLRP1多克隆抗體、兔抗小鼠caspase-1多克隆抗體、兔抗小鼠IL-1β多克隆抗體、兔抗小鼠IL-18多克隆抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Abcam公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、耗材購(gòu)自Corning公司；實(shí)時(shí)定量PCR引物包括NLRP1基因、caspase-1基因(Pro-casp1)、IL-1β基因(Pro-IL-1β)和TNFα基因由南京金斯瑞公司設(shè)計(jì)并合成；pcDNA-NLRP1過(guò)表達(dá)載體由CellLab公司構(gòu)建并進(jìn)行有效性驗(yàn)證；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純化。

方法

細(xì)胞培養(yǎng)與高糖和胰島素處理 HRMC細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中。對(duì)照組，培養(yǎng)于含4.5 mg/ml葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中；處理組，即高糖、高胰島素組，培養(yǎng)于含5.4 mg/ml葡萄糖和10 μg/ml胰島素的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞每2d換液一次。分別于0h、48h、72h和96h檢測(cè)對(duì)照組和處理組焦亡細(xì)胞數(shù)目和miR-497表達(dá)水平。

miR-497 mimic和載體轉(zhuǎn)染 HRMC細(xì)胞接種于高糖和胰島素培養(yǎng)液中，待細(xì)胞匯合至70%左右，運(yùn)用脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同濃度(0、20 nmol/L、40 nmol/L、60 nmol/L、80 nmol/L、100 nmol/L、120 nmol/L和150 nmol/L)的miR-497 mimic，加入對(duì)照mimic作為對(duì)照。分別于0、48和72 h檢測(cè)轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞焦亡水平。分別轉(zhuǎn)染對(duì)照mimic和80 nmol/L miR-497 mimic，分別于0、48和72 h檢測(cè)Pro-IL-1β、TNFα和Pro-casp-1基因的mRNA表達(dá)水平，以及NLRP1蛋白的表達(dá)水平。

HRMC細(xì)胞接種于高糖和胰島素培養(yǎng)液中，待細(xì)胞匯合至70%左右，運(yùn)用脂質(zhì)體3 000轉(zhuǎn)染試劑向細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染對(duì)照mimic、80 nmol/L miR-497 mimic、2 μg/mL pcDNA-NLRP1過(guò)表達(dá)載體以及80 nmol/L miR-497 mimic 2 μg/ml pcDNA-NLRP1 (miR-497+NLRP1)，16h后更換新鮮培養(yǎng)基，分別于0、48h和72h檢測(cè)各種細(xì)胞焦亡數(shù)目。

實(shí)時(shí)定量檢測(cè)miR-497和NLRP1等基因的mRNA表達(dá)水平 運(yùn)用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中RNA，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，然后運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time qPCR)技術(shù)檢測(cè)miR-497、NLRP1、Pro-IL-1β、TNF-α和Pro-casp-1等的表達(dá)水平。反應(yīng)在25 μl體系中進(jìn)行，體系中包含1 μl的cDNA模板(約200 ng)、上下游引物各0.5 μl(終濃度為0.5 μmol/L)、12.5 μl實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)緩沖液(試劑盒中包含)和10.5 μl雙蒸水。反應(yīng)過(guò)程為：95℃預(yù)變性2 min,以95℃變性15s、60℃退火延伸55s的條件循環(huán)擴(kuò)增35次，羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀采集信號(hào)并分析計(jì)算擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Ct值，以2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

Western blot法測(cè)caspase-1等蛋白水平 處理后收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白。蛋白含量測(cè)定后，蛋白上樣于SDS-PAGE膠中，130V恒壓電泳2h；濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；室溫下以含50 mg/ml脫脂奶粉的Tris緩沖液封閉PVDF膜1h，裁剪后分別與兔抗小鼠NLRP1抗體(1∶ 300)、兔抗小鼠caspase-1抗體(1∶ 400)、兔抗小鼠IL-1β抗體(1∶ 500)、兔抗小鼠IL-18抗體(1∶ 500)孵育，4℃過(guò)夜；TBST清洗膜8 min×4次，加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶ 1 000)，室溫孵育2h；TBST清洗膜8 min×4次，ECL試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)，于凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像，重復(fù)3次以上，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

細(xì)胞焦亡水平檢測(cè) 分別以caspase-1活性檢測(cè)試劑盒和PI染色試劑盒標(biāo)記caspase-1陽(yáng)性(casp-1+)和PI陽(yáng)性(PI+)細(xì)胞。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)5×104個(gè)標(biāo)記過(guò)的細(xì)胞進(jìn)行篩選，統(tǒng)計(jì)雙陽(yáng)性(casp-1+PI+)細(xì)胞數(shù)目。重復(fù)4次以上，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

螢光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證miR-497對(duì)NLRP1的靶向關(guān)系 擴(kuò)增野生型NLRP1 mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)序列全長(zhǎng)，運(yùn)用PCR點(diǎn)突變?cè)噭┖蝎@得NLRP1 mRNA3′UTR突變體。雙酶切膠回收后分別連接于pGL3雙螢光素酶報(bào)告基因載體上，獲得野生型NLRP1-3′UTR報(bào)告基因載體(NLRP1-3′UTR-WT)和突變型NLRP1-3′UTR報(bào)告基因載體(NLRP1-3′UTR-MUT)；構(gòu)建好的WT或MUT載體單獨(dú)或與mimics共同轉(zhuǎn)染于細(xì)胞中，72 h后收集細(xì)胞，按熒光素酶報(bào)告基因試劑盒中所述步驟進(jìn)行處理，然后在多功能酶標(biāo)儀中檢測(cè)螢光素酶活性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。測(cè)量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)兩組間比較采用雙尾t檢驗(yàn)，多組間對(duì)比采用ONE-WAY ANOVA方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

高糖和胰島素誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞焦亡并抑制miR-497表達(dá) 正常培養(yǎng)基和添加高糖-胰島素的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)HRMC人腎小球系膜細(xì)胞株，不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞增殖水平變化和miR-497的表達(dá)水平。如圖1A所示，高糖-胰島素處理48h焦亡細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組無(wú)顯著變化(P>0.05)，處理72h和96h焦亡細(xì)胞數(shù)目分別約是對(duì)照組的2.5倍和3倍(P<0.05)；如圖1B所示，高糖-胰島素處理48h、72h和96h，miR-497的表達(dá)水平均較對(duì)照組有顯著下降(P<0.05)。

圖1 高糖和胰島素對(duì)HRMC焦亡和miR-497表達(dá)的影響miR-497:microRNA-497;HRMC:人腎小球系膜細(xì)胞；A:高糖和胰島素處理細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞焦亡數(shù)目變化；B:實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的miR-497表達(dá)水平；a：與對(duì)照組相比，P<0.05

miR-497轉(zhuǎn)染抑制人腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞焦亡和促炎癥因子基因的表達(dá) 高糖-胰島素處理的HRMC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染對(duì)照mimic和不同濃度的miR-497mimic，不同時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)細(xì)胞焦亡、caspase-1和促炎癥因子基因IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)水平。如圖2所示，不同濃度的miR-497mimic處理48 h和72 h，焦亡細(xì)胞數(shù)目均較對(duì)照組顯著減少(P<0.05)；隨著miR-497mimic濃度增加，抑制細(xì)胞焦亡的效果逐漸增強(qiáng)，濃度為80 nmol/L時(shí)達(dá)到峰值，60、80和100 nmol/L處理組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。以80 nmol/L miR-497mimic處理48 h和72 h，細(xì)胞焦亡關(guān)鍵調(diào)控基因caspase-1 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05，圖3A)，IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)水平也顯著下降(P<0.05，圖3B和C)，caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的水平也明顯下調(diào)(圖3D)。

圖2 不同濃度的miR-497 mimic對(duì)HRMC細(xì)胞焦亡的影響miR-497:microRNA-497;mimic:模擬物；HRMC：人腎小球系膜細(xì)胞；a:與對(duì)照組相比，P<0.05;b:與20 nmol/L處理組相比，P<0.05;c:與40 nmol/L處理組相比，P<0.05

圖3 miR-497對(duì)腎小球系膜細(xì)胞焦亡通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響miR-497:microRNA-497;mimic:模擬物；A:80 nmol/L miR-497mimic轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)caspase-1 mRNA水平的變化；B:miR-497 mimic轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β mRNA水平的變化；C:miR-497 mimic轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β mRNA水平的變化；D:miR-497 mimic轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白水平的變化水平的變化;C:對(duì)照mimic組;T:miR-497 mimic處理組;*:與對(duì)照mimic組相比，P<0.05

miR-497直接靶定結(jié)合炎性小體NLRP1基因 NLRP1炎性小體在焦亡通路中承擔(dān)著激活caspase-1的作用[11]。TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR-497與NLRP1基因的3′UTR(圖4A)；螢光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示miR-497 mimic可顯著降低野生型NLRP1-3′UTR報(bào)告基因的螢光素酶活性(P<0.05，圖4B)，但對(duì)突變型NLRP1-3′UTR報(bào)告基因的螢光素酶活性無(wú)顯著影響(P>0.05，圖4B)。Western印記分析結(jié)果顯示，miR-497可顯著抑制NLRP1蛋白的表達(dá)(P<0.05，圖4C)。

為驗(yàn)證miR-497抑制細(xì)胞焦亡是通過(guò)靶定炎性小體NLRP1實(shí)現(xiàn)，在HRMC人腎小球系膜細(xì)胞中分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-497、pcDNA-NLRP1或共轉(zhuǎn)染miR-497和pcDNA-NLRP1，細(xì)胞焦亡檢測(cè)結(jié)果顯示，pcDNA-NLRP1轉(zhuǎn)染可消除miR-497對(duì)細(xì)胞焦亡的抑制作用(圖5)。

圖4 miR-497直接靶定結(jié)合炎性小體NLRP1基因并抑制NLRP1蛋白的表達(dá)miR-497:microRNA-497;mimic:模擬物；A:TargetScan預(yù)測(cè)miR-497與NLRP1基因的靶定結(jié)合關(guān)系；B:螢光素酶報(bào)告基因分析驗(yàn)miR-497與NLRP1基因的靶定結(jié)合關(guān)系；C:轉(zhuǎn)染miR-497 mimic對(duì)NLRP1蛋白表達(dá)水平的影響;*:miR-497mimic組與mimic對(duì)照組熒光素酶活性相比,P<0.05;a:與mimic對(duì)照組相比，P<0.05

圖5 pcDNA-NLRP1轉(zhuǎn)染可消除miR-497對(duì)細(xì)胞焦亡的抑制作用miR-497:microRNA-497;mimic:模擬物；a：與mimic對(duì)照組相比，P<0.05

討 論

高糖和胰島素對(duì)腎小球系膜細(xì)胞肥大、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等過(guò)程都有一定的作用。最近研究表明，高糖和炎癥誘導(dǎo)劑脂多糖共處理導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)炎性小體水平上升，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)增加[12-13]，是細(xì)胞焦亡在分子和亞細(xì)胞水平的典型表現(xiàn)，提示高糖和炎癥誘導(dǎo)劑共處理可能促進(jìn)細(xì)胞焦亡。本研究中，高糖和胰島素處理腎小球系膜細(xì)胞導(dǎo)致焦亡細(xì)胞數(shù)目增加，證實(shí)高糖和炎癥誘導(dǎo)劑胰島素長(zhǎng)時(shí)間處理可促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡。

焦亡細(xì)胞的典型表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)炎性小體NLRP1或NLRP3等表達(dá)上升，活性caspase-1水平增加及IL-1和TNFα等促炎癥因子的大量表達(dá)，其鑒定標(biāo)準(zhǔn)為caspase-1表達(dá)和PI染色的雙陽(yáng)性[3,14-16]。最近一項(xiàng)研究報(bào)道證實(shí)，糖尿病腎病個(gè)體中caspase-1主導(dǎo)了腎臟組織細(xì)胞的損傷[2]，提示細(xì)胞焦亡可能是促進(jìn)腎病糖尿病進(jìn)程的關(guān)鍵機(jī)制。本研究中，高糖和胰島素處理的腎小球系膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同濃度的miR-497 mimic后，caspase-1和PI雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均顯著下降。以篩選的最適濃度(80 nmol/L)的miR-497 mimic處理細(xì)胞后，細(xì)胞中caspase-1、IL-1β和TNFα等標(biāo)志基因的表達(dá)水平顯著受到抑制，表明miR-497具有抗細(xì)胞焦亡的作用。

眾所周知，miRNA的生物學(xué)功能決定于其靶基因的具體作用。炎性小體是由細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體參與組裝的多蛋白復(fù)合物，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。炎癥小體能夠識(shí)別病原相關(guān)分子模式或者宿主來(lái)源的危險(xiǎn)信號(hào)分子，招募和激活促炎癥蛋白酶caspase-1，在細(xì)胞焦亡的激活過(guò)程中起主導(dǎo)作用[17-18]。目前已發(fā)現(xiàn)的炎性小體有NLRP1、NLRP3、IPAF和AIM2[18]。近年來(lái)研究表明miRNAs多通過(guò)直接或間接調(diào)節(jié)炎性小體或caspase-1水平調(diào)控細(xì)胞焦亡。如miR-7和miR-20a等均可通過(guò)靶定NLRP3炎性小體抑制神經(jīng)細(xì)胞或心肌細(xì)胞的焦亡[19-20]；miR-30d可促進(jìn)活性caspase-1的表達(dá)，促進(jìn)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞的焦亡[21]；miR-9和miR-223則通過(guò)間接調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體抑制神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞焦亡[22-23]。然而，調(diào)節(jié)NLRP1的miRNA的報(bào)道并不多見(jiàn)，本研究預(yù)測(cè)并證實(shí)miR-497可直接靶定NLRP1基因并抑制NLRP1蛋白的表達(dá)，從而引起抑制高糖和胰島素誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞的焦亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)高糖和胰島素引起腎小球系膜細(xì)胞焦亡水平增加并伴隨miR-497水平的下調(diào)。miR-497可直接靶向結(jié)合并抑制NLRP1炎性小體的表達(dá)水平，降低細(xì)胞中caspase-1表達(dá)和促炎癥因子的分泌，減少高糖和胰島素誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)。本研究有望為糖尿病腎病的防治研究尋找新的途徑。

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(本文編輯 青 松)

Potential role and mechanism of microRNA-497 in the glomerular mesangial cell pyroptosis

LI Rong1,ZHENG Haolin2,TIAN Xiujuan1,FENG Shidong1,LI Li1,YU Yan1,ZHAO Lijuan1,ZHOU Meilan1,WANG Hanmin1

1Department of Nephrology,First Affiliated Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China23rd battalion the nine,grade 2011,Fourth Military Medical University,Xi’an 710032,China

Wang Hanmin(E-mail：whm@medmail.com.cn)

Objective：To explore the potential role and mechanism of microRNA-497 in the glomerular mesangial cell pyroptosis induced by high glucose and insulin. Methodology：High glucose and insulin was used to treat human renal mesangial cells (HRMC). At various time points, cell pyroptosis was detected with flow cytometry, and real-time qPCR was used to detect miR-497 levels in HRMC. Then, various concentrations of miR-497 mimic were transfected to HRMC. The mRNA levels of key genes in pyroptotic pathway, including IL-1β, TNF-α and caspase-1 were detected. Bioinformatics and Luciferase Reporter Gene assay were used to predict and verify the target of miR-497 to nucleotide-binding oligomerization domain receptor P1 (NLRP1) inflammasome. The miR-497 mimic and pcDNA-NLRP1 expression vector were transfected individually or co-transfected to HRMC. Western blotting was used to detect the levels of NLRP1 protein, and cell pyroptosis were detected. Results：HRMC treated with high glucose and insulin for more than 48h, HRMC pyroptosis was significantly increased, and the expression level of miR-497 was decreased (P<0.05). After transfected with miR-497 mimic, the pyroptosis of HRMC was significantly ameliorated, and the mRNA expression of IL-1β, TNFα and caspase-1 were downregulated (P<0.05). miR-497 directly targeted at NLRP1 gene and suppressed NLRP1 protein expression. NLRP1 overexpression completely rescued the inhibition of cell pyroptosis caused by miR-497. Conclusion：The HRMC pyroptosis was suppressed miR-497, and inflammation response was induced by high glucose and insulin.

pyroptosis high glucose and insulin microRNA-497 NLRP1 inflammasome caspase-1

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.06.006

國(guó)家自然科學(xué)基金(81400699)，陜西省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2014JZ007)

1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院腎內(nèi)科(西安，710032)；2第四軍醫(yī)大學(xué)2011級(jí)學(xué)員旅三營(yíng)九連

王漢民(E-mail：whm@medmail.com.cn)

2016-05-18

? 2016年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有