郭發(fā)爽,李慶華,淮宗讓,李席如

(1.解放軍159醫(yī)院乳腺外科,河南駐馬店 463000；2.解放軍301醫(yī)院乳腺外科,北京 100000)

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PI3K/AKT信號(hào)通路在三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468中的作用及三氧化二砷對(duì)其的干預(yù)作用

郭發(fā)爽1,李慶華1,淮宗讓1,李席如2

(1.解放軍159醫(yī)院乳腺外科,河南駐馬店 463000；2.解放軍301醫(yī)院乳腺外科,北京 100000)

[摘要]目的探討三氧化二砷通過(guò)磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468凋亡的影響。方法實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，三氧化二砷組(2、4、8 μmol/L)，LY294002組(25 μmol/L)，三氧化二砷(4 μmol/L)聯(lián)合LY294002(25 μmol/L)組(聯(lián)合組)；MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期；Western blot分析各組PI3K/AKT通路的激活狀況及其下游靶分子細(xì)胞周期蛋白A1(Cyclin A1)，Cyclin D1，Bax，Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果2、4、8 μmol/L三氧化二砷，LY294002都可顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05)，并且在48 h抑制程度最高；與對(duì)照組比較，4 μmol/L三氧化二砷及LY294002都可使細(xì)胞周期阻滯在G1期(P<0.05)，并降低AKT磷酸化水平(P<0.05)，進(jìn)而下調(diào)Cyclin A1，Cyclin D1，Bcl-2的表達(dá)(P<0.05)，上調(diào)Bax的表達(dá)(P<0.05)；三氧化二砷聯(lián)合LY294002處理MDA-MB-468細(xì)胞較藥物單獨(dú)作用效果增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論三氧化二砷及LY294002可通過(guò)阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468凋亡，二者具有協(xié)同作用。

[關(guān)鍵詞]三氧化二砷；三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468；凋亡；PI3K/AKT信號(hào)通路

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升。三陰性乳腺癌是指雌激素、孕激素及原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2均為陰性的乳腺癌，約占全部乳腺癌的三分之一，是預(yù)后最差的乳腺癌[1]。乳腺癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受多種信號(hào)通路調(diào)控。其中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)與多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PI3K/AKT可參與乳腺癌癌細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、凋亡，其活性異?？纱碳は掠涡盘?hào)分子細(xì)胞周期蛋白A1(Cyclin A1)、Cyclin D1、Bax及Bcl-2的持續(xù)表達(dá)，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的不可控制生長(zhǎng)增殖[2]。

三氧化二砷是傳統(tǒng)中藥砒霜的主要成分，已成為急性早幼粒細(xì)胞白血病臨床治療藥物，患者復(fù)發(fā)率低，不良反應(yīng)輕，與其他化療藥物無(wú)交叉耐藥。不僅如此，三氧化二砷還可抑制多種實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)，如消化系統(tǒng)腫瘤、呼吸系統(tǒng)腫瘤、婦科腫瘤等，其抑制腫瘤的重要機(jī)制就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。Guilbert等[4]研究進(jìn)一步表明二氧化二砷可抑制MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，并與雷帕霉素聯(lián)合使用下調(diào)AKT磷酸化水平有關(guān)。因此筆者在此基礎(chǔ)上，通過(guò)體外培養(yǎng)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468，利用三氧化二砷及LY294002聯(lián)合或單獨(dú)處理乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468，來(lái)探討三氧化二砷是否通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)MDA-MB-468細(xì)胞凋亡。

1材料與方法

1.1材料三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)TCHu136，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。三氧化二砷粉劑購(gòu)于北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，批號(hào)20101224。細(xì)胞周期試劑盒、β-actin、LY294002購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗AKT、p-AKT、Cyclin A1、Cyclin D1、Bax和Bcl-2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Techonology；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

表1　三氧化二砷及LY294002對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞活力抑制率的影響，%)

aa：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與4 μmol/L三氧化二砷組比較；c：P<0.05，與LY294002組比較。

表2　三氧化二砷及LY294002對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞周期的影響，%)

a:P<0.05，與對(duì)照組比較，aa：P<0.01；b：P<0.05，與4 μmol/L三氧化二砷組比較；c：P<0.05，與LY294002組比較。

1.2MTT法將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-468細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入含5% 胎牛血清的DMEM、三氧化二砷(終濃度2，4，8 μmol/L)及LY294002(25 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，加入MTT(5 mg/mL)20 μL，4 h后棄上清液，在每孔加入DMSO 150 μL，10 min后，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定光密度(OD)值。并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.3細(xì)胞周期檢測(cè)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-468細(xì)胞消化，濃度調(diào)整為8×103/mL，接種于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入含5% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、三氧化二砷(終濃度4 μmol/L)或與LY294002(25 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.4Western blot按1.3方法接種細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，裂解收獲蛋白樣品。BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度、上樣，進(jìn)行SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜。次日加二抗孵育后曝光。并用“Quantity one”軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.1三氧化二砷對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞活力的影響如表1所示，隨著作用濃度的增加，三氧化二砷對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞活力抑制作用逐漸增強(qiáng)，在8 μmol/L時(shí)，抑制程度最大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在同一濃度，隨著作用時(shí)間增加，三氧化二砷對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞活力抑制作用也逐漸增強(qiáng)，在72 h作用強(qiáng)度最大，但48 h與72 h作用程度較為一致；與對(duì)照組比較，隨著作用時(shí)間增加，LY294002組及聯(lián)合組對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞活力抑制作用也逐漸增強(qiáng)，48 h與72 h作用程度較為一致，因此筆者選取48 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間。同時(shí)發(fā)現(xiàn)與4 μmol/L 三氧化二砷組及LY294002組比較，聯(lián)合組作用效果更強(qiáng)。

2.2三氧化二砷及LY294002對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞周期的影響如表2所示，與對(duì)照組比較，LY294002組、4 μmol/L三氧化二砷組及聯(lián)合組G1期的細(xì)胞明顯增加，分別為(55.68±4.29)%、(69.51±4.32)%、(68.13±3.67)%、(73.45±6.04)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與LY294002組及4 μmol/L三氧化二砷組比較，聯(lián)合組G1期的細(xì)胞也明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3三氧化二砷及LY294002對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞中磷酸化AKT表達(dá)量的影響如圖1所示，與對(duì)照組相比，4 μmol/L三氧化二砷組及LY294002組中磷酸化AKT水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與三氧化二砷組及LY294002組比較，聯(lián)合組中磷酸化AKT水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

aa:P<0.01,與對(duì)照組比較；b:P<0.05,與4 μmol/L三氧化二砷組比較；c:P<0.05,與LY294002組比較。

圖1三氧化二砷及LY294002對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞中磷酸化AKT表達(dá)量的影響

2.4三氧化二砷及LY294002對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞中Cyclin A1和Cyclin D1蛋白水平的影響如圖2所示，與對(duì)照組相比，4 μmol/L三氧化二砷組及LY294002組中Cyclin A1和Cyclin D1表達(dá)量下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與4 μmol/L三氧化二砷組及LY294002組比較，聯(lián)合組中Cyclin A1和Cyclin D1表達(dá)量下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

a:P<0.05，aa:P<0.01,與對(duì)照組比；bb:P<0.01,與4 μmol/L三氧化二砷組比較；c:P<0.05,與LY294002組比較。

圖2三氧化二砷及LY294002對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞中Cyclin A1和Cyclin D1蛋白含量的影響

2.5三氧化二砷及LY294002對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞中Bax，Bcl-2蛋白含量的影響如圖3所示，與對(duì)照組相比，4 μmol/L三氧化二砷組及LY294002組Bcl-2表達(dá)量下降，Bax表達(dá)量上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與4 μmol/L三氧化二砷組及LY294002組比較，聯(lián)合組中Bcl-2表達(dá)量下降，Bax表達(dá)量上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

aa:P<0.01,與對(duì)照組比；b:P<0.05，bb:P<0.01,與三氧化二砷組比較；c:P<0.05，cc:P<0.01,與LY294002組比較。

圖3三氧化二砷及LY294002對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞中Bax，Bcl-2蛋白含量的影響

3討論

近年來(lái)研究表明，三氧化二砷除了能治療血液系統(tǒng)疾病，對(duì)多種惡性實(shí)體瘤也有強(qiáng)大的抗癌作用。如Kasukabe等[5]的研究結(jié)果表明三氧化二砷能抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7及MDA-MB--231生長(zhǎng)。Xia等[5]的研究結(jié)果表明三氧化二砷可通過(guò)下調(diào)Bcl-2表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。Guilbert等[4]研究進(jìn)一步表明三氧化二砷可抑制MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，并與雷帕霉素聯(lián)合使用下調(diào)磷酸化AKT水平有關(guān)。因此本研究在此基礎(chǔ)上，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三氧化二砷可顯著抑制MDA-MB-468細(xì)胞活力，其作用濃度范圍及時(shí)間與文獻(xiàn)報(bào)道較為一致[4-6]。

細(xì)胞凋亡障礙導(dǎo)致腫瘤的不可控制增殖，是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素。所以，通過(guò)某種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，則有可能抑制惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。PI3K/AKT通路是細(xì)胞內(nèi)重要的存活信號(hào)通路，它可以通過(guò)直接或間接調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡。AKT一旦活化即移動(dòng)到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核并調(diào)節(jié)許多下游靶點(diǎn)，如Cyclin A1，Cyclin D1，Bax，Bcl-2等蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能[2]。在人乳腺癌組織中磷酸化AKT蛋白表達(dá)明顯增高，且磷酸化AKT蛋白陽(yáng)性表達(dá)與乳腺癌惡性程度呈正相關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了此觀點(diǎn)，MDA-MB-468細(xì)胞中AKT磷酸化程度顯著。LY294002是廣泛應(yīng)用的一種PI3K小分子特異性抑制劑，能大部分抑制PI3K的活性，降低AKT的活化，從而抑制下游事件的發(fā)生，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖減少，并促進(jìn)其凋亡。LY294002對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468具有生長(zhǎng)抑制、凋亡誘導(dǎo)的效應(yīng)，是通過(guò)抑制PI3K和AKT活性實(shí)現(xiàn)的[8]。三氧化二砷可通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901[9]及人腎癌細(xì)胞786-O[10]增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)三氧化二砷及LY294002都可降低AKT磷酸化水平，且聯(lián)合給藥優(yōu)于單獨(dú)給藥。Szegezdi等[11]研究發(fā)現(xiàn)在三氧化二砷作用于細(xì)胞時(shí)，抑制PI3K可以增強(qiáng)三氧化二砷誘導(dǎo)的凋亡，從而進(jìn)一步說(shuō)明三氧化二砷與LY294002具有協(xié)同作用。

細(xì)胞癌變與細(xì)胞周期密切相關(guān)。多種抗腫瘤藥物對(duì)細(xì)胞周期有特異的阻斷作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞停滯在G1/M期而發(fā)揮治療作用。其中Cyclin D1是與細(xì)胞周期G1期緊密相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白，Cyclin D1過(guò)表達(dá)可縮短細(xì)胞周期G1期，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖而發(fā)生腫瘤。已報(bào)道MDA-MB-468細(xì)胞通過(guò)PI3K/AKT途徑上調(diào)Cyclin D1表達(dá)，Cyclin D1使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖[12]。Roszak等[13]研究表明三氧化二砷通過(guò)抑制磷酸化AKT水平而下調(diào)Jurkat白血病T細(xì)胞系中Cyclin D1表達(dá)。Wang等[14]的研究顯示三氧化二砷使MCF-7細(xì)胞阻滯在G1期而發(fā)揮其凋亡誘導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了三氧化二砷可通過(guò)抑制AKT磷酸化，下調(diào)Cyclin D1，并使細(xì)胞阻滯在G1期。Cyclin A是細(xì)胞進(jìn)入S期的關(guān)鍵細(xì)胞周期蛋白，其被抑制表達(dá)后，會(huì)使進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)目明顯減少。Yedjou等[15]研究顯示三氧化二砷可抑制人白血病細(xì)胞HL-60增殖與下調(diào)Cyclin A1表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了三氧化二砷可下調(diào)Cyclin A1表達(dá)。

分子生物學(xué)的手段發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的癌基因，抑癌基因多與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Bax、Bcl-2是目前公認(rèn)的參與細(xì)胞凋亡調(diào)控作用的主要基因。Bcl-2是第一個(gè)在淋巴細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的能阻斷細(xì)胞死亡的蛋白。Bax是促凋亡蛋白。研究發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌組織中高表達(dá)Bcl-2蛋白[16]。Bax在包括乳腺癌組織等多種腫瘤中表達(dá)下降[17]。本研究也證實(shí)MDA-MB-468細(xì)胞低表達(dá)Bax，高表達(dá)Bcl-2。三氧化二砷可通過(guò)調(diào)節(jié)Bax及Bcl-2的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)誘導(dǎo)骨髓增生異常綜合征(MDS)SKM-1細(xì)胞的凋亡[18]。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)三氧化二砷及LY294002作用MDA-MB-468細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)可顯著下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)，從而誘導(dǎo)MDA-MB-468細(xì)胞凋亡，且聯(lián)合給藥優(yōu)于單獨(dú)給藥。

綜上所述，三氧化二砷與LY294002可通過(guò)阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路，下調(diào)Cyclin A1，Cyclin D1，Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，從而誘導(dǎo)MDA-MB-468細(xì)胞凋亡，且二者具有協(xié)同作用。

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doi:·經(jīng)驗(yàn)交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.030

作者簡(jiǎn)介：郭發(fā)爽(1982-)，學(xué)士，主治醫(yī)師，主要從事乳腺相關(guān)疾病的研究。

[中圖分類號(hào)]R737.9

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)08-1091-04

(收稿日期：2015-09-16修回日期：2015-11-04)