林艷梅 李瑞杰 張慧杰 秦秀林 馮家勛

（廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 5300 04）

纖維素酶高產(chǎn)菌株Tri choderma atroviride HP35-3原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化

林艷梅 李瑞杰 張慧杰 秦秀林 馮家勛

（廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 5300 04）

旨在優(yōu)化深綠木霉（Trichoderma atroviride）菌株HP35-3原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化條件，便于對(duì)該菌株進(jìn)行遺傳操作以提高其纖維素酶產(chǎn)量。分別對(duì)制備深綠木霉原生質(zhì)體的菌齡、酶解時(shí)間、酶組分及比例和轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，利用3 mg/mL蝸牛酶、3 mg/mL溶菌酶和3 mg/mL裂解酶酶組分酶解菌齡10 h的菌絲2 h，獲得的原生質(zhì)濃度達(dá)到3.5×107個(gè)/mL以上，原生質(zhì)體再生率為61%。利用原生質(zhì)體進(jìn)行PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，當(dāng)原生質(zhì)體濃度為1×108個(gè)/mL、外源DNA 為5 μg時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到35個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg DNA。建立的高效原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化體系可用于深綠木霉的遺傳轉(zhuǎn)化及菌株改造。

深綠木霉；絲狀真菌；原生質(zhì)體制備；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

原生質(zhì)體的制備是絲狀真菌遺傳操作中較為重要的環(huán)節(jié)［1］。原生質(zhì)體廣泛應(yīng)用于菌株生理、生化研究［2］；應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)可進(jìn)行遺傳育種和菌種改造［3，4］；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)可用于基因敲除和外源基因的導(dǎo)入等遺傳操作［5］。而這些技術(shù)的關(guān)鍵是制備一定數(shù)量再生率較高的原生質(zhì)體。

隨著絲狀真菌在工業(yè)酶生產(chǎn)中的應(yīng)用及其基礎(chǔ)研究的快速發(fā)展，絲狀真菌高效原生質(zhì)體制備方法的研究也與日俱增。通常情況下，酶解細(xì)胞壁所用的酶組成［6］、酶濃度和酶解時(shí)間［7］，菌絲的菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑［8］等都是制備高質(zhì)量原生質(zhì)體需優(yōu)化的因素。獲得一定數(shù)量（≥1.0×106個(gè)/mL）原生質(zhì)體后，其高效再生率對(duì)于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體融合等遺傳操作也至關(guān)重要。系統(tǒng)優(yōu)化原生質(zhì)體制備或（和）再生條件后，立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）［9］原生質(zhì)體再生率不到50%，短密青霉（Penicillium brevicompactum）［10］和深黃被孢霉（Mortierella isabellina）［11］原生質(zhì)體再生率只達(dá)到約25%，大部分真菌原生質(zhì)體再生率都較低，一定程度上制約了其在遺傳操作中的應(yīng)用。而應(yīng)用較為廣泛的木霉，其原生質(zhì)體再生率也較低，哈茨木霉（Trichoderma harzianum）［12，13］最適菌齡為15 h以上且再生率低于50%，綠色木霉（Trichoderma viride）［13-15］最適菌齡則多為24 h，原生質(zhì)體再生率不到35%。因此，優(yōu)化木霉原生質(zhì)體制備條件，提高其再生率并縮短原生質(zhì)體制備周期，對(duì)木霉進(jìn)行遺傳改造顯得極其重要。

深綠木霉（Trichoderma atroviride）菌株HP35-3是本實(shí)驗(yàn)室從原始森林篩選獲得的對(duì)結(jié)晶纖維素（Avicel）降解能力與美國(guó)工業(yè)生產(chǎn)菌株Trichoderma reesei Rut-C30相當(dāng)?shù)慕z狀真菌［16］。為了便于對(duì)T. atroviride HP35-3進(jìn)行遺傳改造以進(jìn)一步提高其纖維素酶產(chǎn)量，本研究對(duì)深綠木霉的原生質(zhì)體制備條件進(jìn)行了優(yōu)化并建立了其高效 的PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 與 質(zhì) 粒 深 綠 木 霉（Trichoderma atroviride HP35-3）菌株［16］為本實(shí)驗(yàn)室保存，為廣西花坪自然保護(hù)區(qū)采集得到的野生深綠木霉菌株。

用于驗(yàn)證原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的質(zhì)粒pESAY-kanr，具有kanr篩選標(biāo)記，轉(zhuǎn)化后使得轉(zhuǎn)化子具有G418抗性，該質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

1.1.2 工具酶和試劑 工具酶：蝸牛酶（Snailase），溶菌酶（Lysozyme enzyme），纖維素酶（Cellulase）購(gòu)自solarbio公司，裂解酶（Lysing enzyme）購(gòu)自Sigma公司。試劑：抗生素G418購(gòu)于Solarbio公司。培養(yǎng)基PDA購(gòu)自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司。其他培養(yǎng)基配制及原生質(zhì)體制備所需試劑均為國(guó)藥分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基和所需溶液 （1）產(chǎn)孢培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯，切碎后煮沸約40 min，使用8層紗布過(guò)濾取濾液，定容至1 L，分裝每200 mL至加有4 g葡萄糖、0.2 g酵母提取物和1.5 g瓊脂的500 mL三角瓶中，121℃，20 min滅菌備用。（2）菌絲生長(zhǎng)液體培養(yǎng)基CM：50 mL 20×硝酸鹽（NaNO3120 g/L，KCl 10.4 g/L，MgSO4.7H2O 10.4 g/L，KH2PO430.4 g/L），微量元素1 mL（ZnSO4.7H2O 22 g/L，H3BO311 g/L，MnCl2.4H2O 5 g/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 5 g/L，CoCl2.6H2O 1.7 g/L，CuSO4.5H2O 1.6 g/L，Na2MoO4.2H2O 1.5 g/L，Na4EDTA 50 g/L），復(fù)合維生素1 mL（Biotin 0.1 g/L，PABA 0.1 g/L，Pyridoxin 0.1 g/L，Riboflavin 0.1 g/L，Thiamine 0.1 g/L，Nicotinic 0.1 g/L），D-葡萄糖10 g，蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，酸水解酪蛋白1 g，水補(bǔ)足1 L，自然pH。（3）原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基OCM：酸水解酪蛋白1 g，酵母提取物1 g，蔗糖342 g，瓊脂15 g，水補(bǔ)足1 L，自然pH。（4）篩選培養(yǎng)基PDA：主要成分為馬鈴薯淀粉4 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L。

溶液參照相關(guān)文獻(xiàn)［17］配制：（1）0.6 mol/L MgSO4.7H2O，用于收集菌絲后清洗菌絲。（2）OM（1.2 mol/L MgSO4.7H2O，10 mmol/L NaH2PO4，pH 5.8），用于溶解所選用的酶，形成所需酶解液。（3）Trapping Buffer（0.4 mol/L Sorbitol，0.1 mol/L Tris-HCl，pH7.0），在菌體形成原生質(zhì)體后，滴加至酶解液中，離心時(shí)形成密度梯度使得原生質(zhì)體懸浮于酶解液與Trapping Buffer之間。（4）1 mol/L Sorbitol，清洗原生質(zhì)體。（5）STC（1 mol/L Sorbitol，0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L CaCl2，pH8.0），清洗并保存原生質(zhì)體。（6）PTC（40% PEG6000，0.1 mol/L Tris-HCl、0.1 mol/L CaCl2，pH8.0），保存原生質(zhì)體

1.2 方法

1.2.1 菌絲的培養(yǎng) 深綠木霉菌株T. atroviride HP35-3在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)6-7 d，收集孢子并用0.1%（W/V）Tween-80的滅菌水制備孢子懸浮液（108個(gè)/mL）。接種2 mL濃度為1×108個(gè)/mL新鮮孢子懸浮液于200 mL CM中，在28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 酶解液的配制 稱取適量的蝸牛酶、溶解酶、裂解酶、纖維素酶及其互配的酶組分，溶解于6 mL體積的OM中，振蕩搖勻約30 min，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌備用。

1.2.3 原生質(zhì)體制備 將在CM中培養(yǎng)10 h的深綠木霉通過(guò)離心收集菌絲，使用0.6 mol/L MgSO4.7H2O清洗兩次，稱取0.1 mg濕重菌絲放入5 mL酶解液中，使用50 mL三角瓶盛放（加入少許的玻璃球用來(lái)打散菌絲），并使用移液器吹打使得菌絲盡量分開(kāi)，在28℃，180 r/min振蕩酶解。酶解結(jié)束后，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量。將酶解液倒入滅菌的50 mL離心管中，置于冰上，用巴氏吸管逐滴滴加Trapping Buffer至2倍體積的酶解液，在4℃，3 500 r/min離心30 min。離心結(jié)束后用巴氏吸管將懸浮于酶解液與Trapping Buffer之間的原生質(zhì)體層吸出并放入干凈的15 mL離心管，加入15 mL的1 mol/L Sorbitol清洗原生質(zhì)體，重復(fù)一次。接著使用STC清洗兩次后，按STC∶PTC為4∶1（V/V）比例重懸原生質(zhì)體，吸取每100 μL分裝于1.5 mL EP管中，即為深綠木霉原生質(zhì)體懸浮液，可用于原生質(zhì)體的再生與轉(zhuǎn)化。

1.2.4 原生質(zhì)體再生 原生質(zhì)體再生采用涂布法，首先在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板對(duì)原生質(zhì)體懸浮液進(jìn)行計(jì)數(shù)，取100 μL原生質(zhì)體懸浮液用STC進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以O(shè)CM作為再生培養(yǎng)基，吸取100 μL稀釋好的懸浮液涂布于培養(yǎng)基上。置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，對(duì)形成的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)（A）。為消除未除盡的菌絲片段或是萌發(fā)較晚的孢子再生出菌落所造成的誤差，同時(shí)采用涂布法，將原生質(zhì)體懸浮液用滅菌水進(jìn)行等梯度稀釋，并涂布于PDA培養(yǎng)基，其再生菌落數(shù)作為對(duì)照（B）。顯微鏡下觀察的原生質(zhì)體數(shù)計(jì)為（C）。再生率計(jì)算：原生質(zhì)體再生率=［（A-B）/C］×100%［18］。

1.2.5 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 取100 μL原生質(zhì)體懸浮液，加入適量的DNA，加入6 μL100 mmol/L的亞精胺混勻，冰浴30 min，然后緩緩加入1 mL PTC，混勻后，室溫放置25 min，再加入2 mL STC并混勻，最后將混合物倒入20 mL已融化并于55℃溫浴的OCM中，上下輕輕顛倒混勻后，按每個(gè)2-3 mL量倒到干凈的培養(yǎng)皿中，室溫放置1 h。

1.2.6 轉(zhuǎn)化子的篩選及驗(yàn)證 將上述在培養(yǎng)皿中再生約1 h的原生質(zhì)體，在其OCM上層覆蓋含200 μg/mL G418的PDA。在28℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)約3 d，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的菌落即為轉(zhuǎn)化子。

使用牙簽將培養(yǎng)基表面的單菌落挑取適量的菌絲于1.5 mL EP管中，加入適量的液氮并研磨成粉末，使用酚氯仿抽取的方法提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，并使用引物G418F（5'AGAAGATGATATTGAAGGAGCATT3'） 和G418R（5'CTAGAAAGAAGGATTACCTCT3'）進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

PCR體系及參數(shù)設(shè)置：2×Easy Tag Mix 12.5 μL，引物G418F和G418R各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL，共25 μL體系。參數(shù)為95℃，預(yù)變性5 min；95℃，變性30 s；55℃，退火15 s；72℃，延伸90 s；25個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。

2 結(jié)果

2.1 不同酶組分對(duì)T. atroviride HP35-3原生質(zhì)體產(chǎn)

量影響

選常用的商業(yè)化水解酶蝸牛酶、裂解酶、纖維素酶和溶菌酶來(lái)制備不同酶組分的酶解液。取生長(zhǎng)10 h濕重為1 mg菌絲至5 mL酶解液中，28℃，180 r/min酶解2 h，檢測(cè)所產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量，結(jié)果如表1所示。單獨(dú)使用纖維素酶（c組）酶解菌絲無(wú)原生質(zhì)體產(chǎn)生，其他組的酶解液酶解菌絲后都能產(chǎn)生原生質(zhì)體，其中3 mg/mL蝸牛酶、3 mg/mL溶菌酶和3 mg/mL裂解酶（i組）產(chǎn)生的原生質(zhì)體量最多，因此選用i組酶解液進(jìn)行后期的原生質(zhì)體制備。

2.2 菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備和再生率的影響

為了考察菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率的影響，接種2 mL濃度為1×108個(gè)/mL的T. atroviride HP35-3孢子懸浮液至200 mL的CM培養(yǎng)基中，置于28℃，180 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，取9、10、11、12和24 h的培養(yǎng)液鏡檢以觀察菌絲生長(zhǎng)情況，并用i組酶解液酶解不同菌齡的菌絲（濕重為1 mg）。圖1所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，孢子萌發(fā)、菌絲變長(zhǎng)分叉、菌絲量不斷增加；經(jīng)酶解后，菌齡為9、10 h的菌絲完全被酶解并釋放出原生質(zhì)體；菌齡為11、12 h的菌絲還殘余部分菌絲；24 h菌齡的菌絲幾乎沒(méi)有被酶解，基本無(wú)原生質(zhì)體產(chǎn)生。菌齡為10 h的菌絲經(jīng)酶解后釋放的原生質(zhì)體數(shù)量最多，再生率達(dá)到了60%以上（圖2），故產(chǎn)生原生質(zhì)體數(shù)量和質(zhì)量最適的菌絲菌齡為10 h。

表1 酶組分對(duì)深綠木霉原生質(zhì)體產(chǎn)量影響

2.3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率的影響

利用i組酶解液對(duì)菌齡為10 h的菌絲（1 mg濕重）分別進(jìn)行1 h、2 h、3 h和4 h酶解，結(jié)果如圖3所示。酶解1 h時(shí)，有較多的原生質(zhì)體產(chǎn)生，但菌絲體并沒(méi)有完全酶解；酶解2 h時(shí)，反應(yīng)體系中基本沒(méi)有菌絲體，原生質(zhì)體數(shù)量最多；酶解3 h和4 h時(shí)，原生質(zhì)體數(shù)量銳減，部分原生質(zhì)體已被降解。菌絲酶解2 h時(shí)，制備的原生質(zhì)體產(chǎn)量（1.5×107個(gè)/mL）和再生率均達(dá)到最高（69%）（圖4）。因此，制備T.atroviride HP35-3原生質(zhì)體的最佳酶解反應(yīng)條件為：利用3 mg/mL蝸牛酶、3 mg/mL溶菌酶、3 mg/mL裂解菌酶組分，取菌齡10 h的菌絲，酶解2 h。

原生質(zhì)體只有具備高效再生率才便于遺傳轉(zhuǎn)化。將優(yōu)化條件下酶解得到的原生質(zhì)體置于再生培養(yǎng)基OCM中培養(yǎng)36 h，其再生率達(dá)到69%。

圖1 菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

2.4 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率

為了驗(yàn)證所制備原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率，將帶有kanr篩選標(biāo)記的外源DNA片段經(jīng)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至T. atroviride HP35-3的原生質(zhì)體中。當(dāng)原生質(zhì)體數(shù)量為108個(gè)/mL，外源DNA片段為5 μg時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到35個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg DNA（表2）。隨機(jī)挑選其中7個(gè)轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA并PCR驗(yàn)證外源DNA片段是否整合至轉(zhuǎn)化子的基因組中，這7個(gè)轉(zhuǎn)化子基因組中均有目的片段的擴(kuò)增條帶（圖5），為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將其中3個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在無(wú)抗性培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5次，PCR驗(yàn)證均檢測(cè)到目的片段，表明外源DNA進(jìn)入深綠木霉原生質(zhì)體并得到穩(wěn)定傳代。

圖2 菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

圖4 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生的影響

表2 深綠木霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率

圖5 PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子

3 討論

原生質(zhì)體的制備是絲狀真菌遺傳操作中較為重要的環(huán)節(jié)［1］。絲狀真菌原生質(zhì)體的制備技術(shù)雖然比較成熟，相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道也較多［19，20］，但由于菌株間細(xì)胞壁成分存在差異，即便使用同一方法制備原生質(zhì)體，對(duì)于不同菌株取得的效果也不盡相同。因此，針對(duì)不同的絲狀真菌，必須對(duì)酶解反應(yīng)體系pH、滲透壓穩(wěn)定劑、酶組分、酶濃度、酶解時(shí)間和菌齡等條件進(jìn)行優(yōu)化［7，21，22］，以確定原生質(zhì)體制備的最佳條件。通常情況下，較中性或堿性條件，弱酸性（pH5.8）環(huán)境更有益于高質(zhì)量真 菌原生質(zhì)體的制備［22］。滲透壓會(huì)影響原生質(zhì)體的釋放、再生率及其結(jié)構(gòu)的完整性，而對(duì)絲狀真菌原生質(zhì)體而言，無(wú)機(jī)鹽溶劑0.6 mol/L MgSO4.7H2O是較好的滲透壓穩(wěn)定劑［20］。因此，將酶解體系中的緩沖體系和滲透壓穩(wěn)定劑分別定為OM溶液（1.2 mol/L MgSO4.7H2O，10 mmol/L NaH2PO4，pH 5.8）和0.6 mol/L MgSO4.7H2O，檢測(cè)了不同酶組分、菌齡、酶解時(shí)間對(duì)深綠木霉原生質(zhì)體制備產(chǎn)量和再生率的影響。

相對(duì)于單一酶，幾種酶配合使用時(shí)酶解T. atroviride HP35-3菌絲產(chǎn)生原生質(zhì)體的數(shù)量較多，最佳的酶組分為：3 mg/mL蝸牛酶、3 mg/mL溶菌酶、3 mg/mL裂解酶。張曉立等［23］的研究也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，黑曲霉原生質(zhì)體得率與酶解體系組成及配比關(guān)系密切，利用酶的混合液制備原生質(zhì)體比單獨(dú)使用一種酶的效果好。優(yōu)化酶組分后，一定程度上減少了原生質(zhì)體制備過(guò)程中酶的添加量，本研究中用于制備T. atroviride原生質(zhì)體的酶濃度均較低為3 mg/ mL，F(xiàn)eng等［9］制備立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）原生質(zhì)體所用酶的最低濃度為5 mg/mL，You等［14］制備綠色木霉（Trichoderma viride）原生質(zhì)體所用酶量為10 mg/mL。

絲狀真菌菌齡對(duì)于原生質(zhì)體的制備至關(guān)重要，酶解過(guò)程中，年輕的菌絲體比較老的菌絲體能更有效的釋放原生質(zhì)體，這可能是因?yàn)槟贻p菌絲對(duì)細(xì)胞壁裂解酶的作用更敏感［24］，且減少菌絲培養(yǎng)時(shí)間可利于縮短原生質(zhì)體的制備周期。Tmova等［25］發(fā)現(xiàn)，選用菌齡為15-18 h的綠色木霉（Trichoderma viride）菌絲制備原生質(zhì)體所得的數(shù)量最多。哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和長(zhǎng)梗木霉（Trichoderma longibrachiatum）［26］制備原生質(zhì)體的最適菌齡分別為18和24 h。也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）［7］、普爾頂粘束孢（Graphium putredinis）和哈茨木霉（T. harzianum）［22］制備原生質(zhì)體的最適菌齡均為24 h，而刺糙青霉（Penicillium echinulatum）［3］的為48 h。這些研究表明，不同真菌盡管同是木霉屬，菌種間制備原生質(zhì)體的最適菌齡也存在較大差異。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于T. atroviride HP35-3而言，菌齡10 h的菌絲體制備的原生質(zhì)體效果最佳，超過(guò)該菌齡（特別是菌齡為24 h）的菌絲原生質(zhì)體產(chǎn)量下降，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)菌絲較長(zhǎng)分叉較多易于結(jié)團(tuán)，導(dǎo)致酶解液無(wú)法充分接觸結(jié)球菌絲，酶解不完全；也可能是由于菌絲老齡化其細(xì)胞壁組成成分比例發(fā)生變化，酶解液無(wú)法有效降解細(xì)胞壁。相較于哈茨木霉（T. harzianum）［13，26］最適菌齡為16 h和18 h、綠色木霉（Trichoderma viride）［14，15］最適菌齡為24 h，T. atroviride HP35-3最適菌齡則為10 h，時(shí)間縮短6 h以上，并且原生質(zhì)體產(chǎn)量提高了約2倍，再生率也提高了約30%。

酶解菌絲的時(shí)間，會(huì)影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量及質(zhì)量，酶解時(shí)間太短，菌絲酶解不完全，釋放的原生質(zhì)體數(shù)量少，而原生質(zhì)體的濃度又會(huì)影響其轉(zhuǎn)化效率；酶解時(shí)間太長(zhǎng)，釋放的原生質(zhì)體會(huì)被酶解破裂，導(dǎo)致原生質(zhì)體的質(zhì)量較差，影響原生質(zhì)體的再生。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于菌齡10 h的T. atroviride HP35-3菌絲，酶解2 h制備的原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率最高，酶解時(shí)間比Balasubramanian 等［13］、You等［14］和Savitha等［23］制備木霉原生質(zhì)體至少縮短1 h。

4 結(jié)論

本研究確立了深綠木霉T. atroviride HP35-3原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化最佳條件：利用3 mg/mL蝸牛酶、3 mg/mL裂解酶和3 mg/mL溶菌酶酶組分酶解菌齡10 h的菌絲2 h，獲得的原生質(zhì)濃度達(dá)到3.5×107個(gè)/mL以上，原生質(zhì)體再生率為61%。當(dāng)原生質(zhì)體數(shù)量為108個(gè)/mL，外源DNA片段為5 μg時(shí)，PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化率達(dá)到35個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg DNA。因此，所建立的高效原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化體系可用于深綠木霉的遺傳轉(zhuǎn)化及菌株改造。

［1］劉士旺, 王政逸, 郭澤建. 綠色木霉的原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化條件［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2004, 12（1）：96-101.

［2］Prabavathy VR, Mathivanan N, Sagadevan E, et al. Self-fusion of protoplasts enhances chitinase production and biocontrol activity in Trichoderma harzianum［J］. Bioresource Technology, 2006, 97（18）：2330-2334.

［3］Dillon AJP, Camassola M, Henriques JAP, et al. Generation of recombinants strains to cellulases production by protoplast fusion between Penicillium echinulatum and Trichoderma harzianum［J］. Enzyme and Microbial Technology, 2008, 43（6）：403-409.

［4］Lee KM, Yu J, Son M, et al. Transmission of Fusarium boothii mycovirus via protoplast fusion causes hypovirulence in other phytopathogenic fungi［J］. PLoS One, 2011, 6（6）：e21629.

［5］Jiang D, Zhu W, Wang Y, et al. Molecular tools for functional genomics in filamentous fungi：recent advances and new strategies［J］. Biotechnology Advances, 2013, 31（8）：1562-1574.

［6］De BC, Wiebenga A, Aguilar G, et al. An enzyme cocktail for efficient protoplast formation in Aspergillus niger［J］. Journal of Microbiological Methods, 2009, 76（3）：305-306.

［7］Liu TH, Lin MJ, Ko WH. Factors affecting protoplast formation by Rhizoctonia solani［J］. New Biotechnology, 2010, 27（1）：64-69.

［8］Patil NS, Jadhav JP. Penicillium ochrochloron MTCC 517 chitinase：An effective tool in commercial enzyme cocktail for production and regeneration of protoplasts from various fungi［J］. Saudi Journal of Biological Sciences, 2015, 22（2）：232-236.

［9］Feng HT, Sun ZG, Li HJ, et al. Preparation, purification and regeneration optimizing research of protoplasts from Rhizoctonia solani［J］. African Journal of Microbiology Research, 2012, 6（13）：3222-3230.

［10］任志紅, 蘇彩云, 閆敬, 等. 霉酚酸產(chǎn)生菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)基因方法的建立［J］. 微生物學(xué), 2013, 53（11）：1226-1232.

［11］徐新麗, 謝必峰. 深黃被孢霉3. 3410原生質(zhì)體的制備和再生研究［J］. 生物技術(shù), 2009, 19（2）：46-48.

［12］Tschen SM, Li IF. Optimization of formation and regeneration of protoplasts from biocontrol agents of Trichoderma species［J］. Mycoscience, 1994, 35（3）：257-263.

［13］Balasubramanian N, Lalithakumari D. Characteristics of protoplast inter, intra-fusant and regeneration of antagonistic fungi Trichoderma harzianum and Trichoderma viride［J］. African Journal of Biotechnology, 2008, 7（18）：3235-3243.

［14］You YR, Liu SW, Wu YF, et al. The Transformation in Trichoderma viride protoplasts by restriction enzyme mediated integration（REMI）［J］. Advanced Materials Research, 2012, 518-523：545-548.

［15］黃玉茜, 劉根, 程根武, 等. 木霉菌T23菌株原生質(zhì)體制備及再生研究［J］. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)科學(xué)報(bào), 2005, 23（3）：303-307.

［16］Zhang Z, Liu JL, Lan JY, et al. Predominance of Trichoderma and Penicillium in cellulolytic aerobic filamentous fungi from subtropical and tropical forests in China, and their use in finding highly efficient beta-glucosidase［J］. Biotechnology for Biofuels, 2014, 7（1）：1-14.

［17］Churchill ACL, Ciuffetti LM, Hansen DR, et al. Transformation of the fungal pathogen Cryphonectria parasitica with a variety of heterologous plasmids［J］. Current Genetics, 1989, 17（1）：25-31.

［18］呂天曉, 徐鳳花, 李世貴, 等. 生防木霉菌原生質(zhì)體的制備及再生研究［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2009（4）：130-134.

［19］Cartwright GM, Tanaka A, Eaton CJ, et al. Formation of arthroconidia during regeneration and selection of transformed Epichloe festucae protoplasts［J］. Fungal Biology, 2014, 118（5-6）：462-471.

［20］盧明, 張?jiān)陆? 絲狀真菌AL18的原生質(zhì)體制備和再生條件的優(yōu)化［J］. 生物技術(shù), 2012, 22（3）：86-89.

［21］Balasubramanian N, Juliet GA, Srikalaivani P, et al. Release and regeneration of protoplasts from the fungus Trichothecium roseum［J］. Canadian Journal Microbiology, 2003, 49（4）：263-268.

［22］Savitha S, Sadhasivam S, Swaminathan K. Regeneration and molecular characterization of an intergeneric hybrid between Graphium putredinis and Trichoderma harzianum by protoplasmic fusion［J］. Biotechnology Advances, 2010, 28（3）：285-292.

［23］張曉立, 鄭小梅, 滿云, 等. 黑曲霉檸檬酸工業(yè)菌株原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2015, 31（3）：171-177.

［24］Villanueva JR, Acha G. Chapter XXIV Production and use for fungal protoplast［J］. Methods in Microbiology, 1971, 4：666-718.

［25］Tamova G, Betina V, Farkas V. An efficient method for the preparation of protoplasts from Trichoderma viride［J］. Folia Microbiologica, 1993, 38（3）：214-218.

［26］Mrinalini C, Lalithakumari D. Integration of enhanced biocontrol efficacy and fungicide tolerance in Trichoderma spp. by electrofusion［J］. Journal of Plant Diseases and Protection, 1998, 105（1）：34-40.

（責(zé)任編輯 李楠）

Formation and Transformation of Protoplast of Trichoderma atroviride HP35-3 Highly Yielding Cellulase

LIN Yan-mei LI Rui-jie ZHANG Hui-jie QIN Xiu-lin FENG Jia-xun
（College of Life Science and Technology，State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Guangxi University，Nanning 530004）

The purpose of this work is to optimize the conditions of formatting and transforming the protoplast of Trichoderma atroviride HP35-3，aiming at genetically manipulating the strain for increasing the yield of cellulase. The individual condition for formatting the protoplast of Trichoderma atroviride，i.e.，mycelium age，hydrolysis time of enzyme，constituents and ratios of enzymes，as well as transformation conditions were optimized respectively. Results showed that the combination of 3 mg/mL snailase，3 mg/mL lysing enzyme，and 3 mg/mL lysozyme enzyme was effective in releasin g protoplasts from T. atroviride HP35-3 mycelium（at the age of 10 h）after digestion for 2 h，the concentration was ov er 3.5×107protoplasts/mL，and the regenerat ion rate was 61%. The protoplasts were mediated and transformed by PEG，and the transformation rate was 35 transformants/μg DNA when 1×108protoplasts were employed with 5 μg DNA. In conclusion，establishing efficient formation and transformation of protoplasts may be applied in strain improvement and gene transformation of T. atroviride in biotech industries and laboratories.

Trichoderma atroviride；filamentous fungi；formation of protoplast；transformation of protoplast

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.030

2016-01-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31300076），廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013GXNSFBA019096）

林艷梅，女，碩士，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：930231670@qq.com

秦秀林，女，副教授，博士，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：xiulinqin@gxu.edu.cn