林金杏楊遲，2馮麗萍胡建華

（1. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203；2. 東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

斑馬魚(yú)嗜水氣單胞菌的鑒定和人工感染組織病理學(xué)研究

林金杏1楊遲1，2馮麗萍1胡建華1

（1. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203；2. 東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

從患病斑馬魚(yú)體內(nèi)分離致病菌株并進(jìn)行鑒定，觀察人工感染分離菌株后組織病理學(xué)變化。通過(guò)對(duì)分離菌株ZF4形態(tài)特征、生理生化特性、保守基因和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)建立等綜合分析進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，ZF4為β溶血的革蘭氏陰性短桿菌，吲哚試驗(yàn)為陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖等糖類，AHA_0438、ASP、gyrB和16S rRNA等基因均為陽(yáng)性，基于gyrB、16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示ZF4為嗜水氣單胞菌。人工感染后斑馬魚(yú)臨床癥狀明顯，發(fā)生肝臟組織變性、腸道內(nèi)膜脫落、脾臟充血、胰腺間質(zhì)纖維組織增生等組織病理學(xué)變化。斑馬魚(yú)體內(nèi)分離的ZF4鑒定為致病性嗜水氣單胞菌，且斑馬魚(yú)對(duì)該菌敏感，因此斑馬魚(yú)可作為研究嗜水氣單胞菌的動(dòng)物模型。

斑馬魚(yú)；嗜水氣單胞菌；鑒定；人工感染；組織病理

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）屬于弧菌科（Vibrionaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），廣泛分布于自然界的各種水體及土壤中［1，2］。Ah是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性致病菌，也為條件致病菌，會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物的出血癥，病勢(shì)較猛，死亡率高，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［3］。此外，Ah可通過(guò)接觸被污染的水和水產(chǎn)動(dòng)物性食品、傷口或攝入感染人類，引起人類腹瀉、急性腸胃炎等，是典型的人-獸-魚(yú)共患病病原菌［2，4，5］。近年來(lái)，隨著水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的廣泛應(yīng)用，特別是國(guó)內(nèi)外眾多實(shí)驗(yàn)室以斑馬魚(yú)為模式動(dòng)物進(jìn)行大量科學(xué)研究，使Ah的檢測(cè)與控制研究顯得尤為重要，引起了生命科學(xué)界及水產(chǎn)學(xué)界科研工作者的廣泛重視［6，7］。

Ah可依據(jù)其是否具有致病性將其分為致病菌株與非致病菌株兩大類，而Ah的致病性則與其毒力因子密切相關(guān)［8，9］。現(xiàn)已有許多學(xué)者針對(duì)Ah病原的毒力因子開(kāi)展了大量研究，證實(shí)Ah所分泌的溶血素、氣溶素、胞外蛋白酶、絲氨酸蛋白酶等是Ah重要的毒力因子，與該菌是否具有致病性及致病性的強(qiáng)弱具有較高的相關(guān)性［10，11］。本研究從發(fā)病的斑馬魚(yú)組織中分離病原菌，對(duì)其生物學(xué)性狀、生理生化特性、致病力、保守基因、基于gyrB、16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以及人工感染Ah后斑馬魚(yú)主要器官的組織病理變化進(jìn)行研究，旨在為斑馬魚(yú)細(xì)菌質(zhì)量控制和實(shí)驗(yàn)人員防護(hù)提供重要的理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取本單位（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2013-0056）隔離飼養(yǎng)區(qū)的自然發(fā)病斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)樣本，其臨床病理特征主要表現(xiàn)為魚(yú)體消瘦，鰓部充血發(fā)紅，嚴(yán)重者爛鰓爛尾，魚(yú)側(cè)身體表潰瘍出血。此外，選取飼養(yǎng)于獨(dú)立水生動(dòng)物養(yǎng)殖系統(tǒng)（意大利TECNIPLAST公司）的體長(zhǎng)約4 cm、體重在0.6-0.9 g范圍內(nèi)，健康活潑、無(wú)異樣病癥的10月齡AB系野生型斑馬魚(yú)（其中雌雄各半）用于分離菌的人工感染致病性試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 羊血瓊脂平板、TSA、TSB、Rimler-Shotts（RS）培養(yǎng)基、MMA培養(yǎng)基，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Es Taq Master Mix、DNA純化回收試劑盒，蘇木素、伊紅、NaOH、無(wú)水乙醇、丙三醇、二甲苯、冰乙酸等。

嗜水氣單胞菌陽(yáng)性對(duì)照菌株由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）提供，菌株編號(hào)為：CGMCC 1.2017，配置批號(hào)：2012.11.21。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 以無(wú)菌操作方式解剖斑馬魚(yú)，取其體表病灶組織及腹腔器官團(tuán)進(jìn)行組織勻漿，接種于羊血瓊脂平板，30℃培養(yǎng)10-24 h，取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。本文分離的菌株為本實(shí)驗(yàn)室從斑馬魚(yú)體內(nèi)分離出的第4個(gè)菌株，編號(hào)為ZF4。

1.2.2 分離菌株形態(tài)觀察與生理生化特性鑒定 將純培養(yǎng)所獲得的病原菌接種于TSA平板培養(yǎng)基，30℃條件下培養(yǎng)18-24 h，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色及邊緣是否整齊、凸起等，并涂片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，進(jìn)行細(xì)菌的初步鑒定。根據(jù)染色結(jié)果，應(yīng)用細(xì)菌生化微量鑒定管進(jìn)行細(xì)菌的常規(guī)生理生化測(cè)定，并采用ID32E微量多項(xiàng)試驗(yàn)鑒定系統(tǒng)（ATB Expression 儀，法國(guó)生物梅里埃公司）進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.2.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增 分離菌及陽(yáng)性對(duì)照菌的DNA提取依細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用oligo 6軟件設(shè)計(jì)并合成4對(duì)保守基因引物（表1），PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min，94℃ 45 s，退火45 s，72℃ 1 min，35 C，72℃ 10 min。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序及分析 用DNA純化回收試劑盒對(duì)gyrB和16S rRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。獲得序列采用Blast進(jìn)行相似性比較，采用MEGA 5軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.5 分離菌株致病性實(shí) 驗(yàn)

1.2.5.1 平板計(jì)數(shù) 將陽(yáng)性菌株與ZF4同時(shí)進(jìn)行菌種復(fù)蘇，待傳代、培養(yǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。菌液按1∶100比例分別接種于TSB液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，在1、2、2.5、3、3.5、4、5和6h八個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取出對(duì)應(yīng)試管測(cè)OD值，并選取處于細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的中間6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.2.5.2 人工感染 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前2日將健康的斑馬魚(yú)隨機(jī)分為7組（6實(shí)驗(yàn)組+1對(duì)照組），每組6尾，雌雄各半，分別飼養(yǎng)于7個(gè)飼養(yǎng)缸內(nèi)，以適應(yīng)環(huán)境，感染實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前禁食24 h。按1∶100比例分別轉(zhuǎn)接陽(yáng)性菌株和分離菌株ZF4，30℃培養(yǎng)至3.5 h時(shí)，采樣測(cè)量?jī)煞N菌株的OD值，按平板計(jì)數(shù)所得的擬合曲線得出菌液濃度，并分別稀釋成3個(gè)梯度濃度的菌液。利用腹腔注射的方法分別對(duì)6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的每尾受試斑馬魚(yú)注射不同濃度梯度的菌液各10 μL，對(duì)照組每尾注射10 μL PBS，觀 察7 d內(nèi)受試斑馬魚(yú)的活力、攝食、發(fā)病癥狀和死亡情況。

1.2.6 組織切片的制作與病理學(xué)變化的觀察 選取人工感染后具有典型發(fā)病癥狀的瀕死斑馬魚(yú)，在立體顯微鏡（SZX7，Olympus）下進(jìn)行解剖，摘取感染病魚(yú)的鰓絲直接置于顯微鏡下觀察病理變化，取內(nèi)臟器官組織固定于10%甲醛溶液24 h后，脫水后以石 蠟包埋，切片厚4 μm，采用常規(guī)方法進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡（DP80，Olympus）下觀察拍照。

1.2.7 再次分離鑒定致病菌 將人工感染致死的斑馬魚(yú)在無(wú)菌條件下剖開(kāi)腹部，用接種環(huán)沾取腹腔積液接種至TSA培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)過(guò)夜后，挑選優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行分離純化后，轉(zhuǎn)接至RS、 MMA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，菌落鑒定的形態(tài)觀察、生理生化鑒定及分子生物學(xué)等方法，再次進(jìn)行分離菌落和分析鑒定。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)特征

取優(yōu)勢(shì)菌株ZF4的純培養(yǎng)物接種于TSA培養(yǎng)基分別培養(yǎng)18-24 h后，菌落邊緣光滑整齊，中央凸起，有光澤，帶特殊芳香氣味，β溶血。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為陰性短桿菌。

2.2 分離菌株生理生化指標(biāo)

分離菌株ZF4在所測(cè)項(xiàng)目中，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、阿拉伯糖和吲哚試驗(yàn)等項(xiàng)目為陽(yáng)性反應(yīng)，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、酚紅、α-半乳糖苷酶、鼠李糖、肌醇、山梨醇等項(xiàng)目的反應(yīng)為陰性。常規(guī)生理生化測(cè)定方法結(jié)合ATB系統(tǒng)細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀初步鑒定ZF4為Ah。

2.3 基因擴(kuò)增結(jié)果

將ZF4及陽(yáng)性對(duì)照菌株進(jìn)行菌種復(fù)蘇并培養(yǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)后，針對(duì)Ah的保守基因AHA_0438、ASP、gyrB、16S rRNA的引物進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖1）顯示以上4對(duì)引物均可在ZF4及陽(yáng)性對(duì)照菌株上擴(kuò)增出目的條帶，且與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物大小相符。

圖1 嗜水氣單胞菌PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果及16S rRNA、gyrB基因序列分析

為進(jìn)一步從分子水平上確認(rèn)ZF4在氣單胞菌屬中的分型位置，將Ah的保守基因進(jìn)行測(cè)序、同源性分析。結(jié)果顯示，ZF4的gyrB基因擴(kuò)增產(chǎn)物同源性與GenBank中登錄的Ah（KAE13、KY07）同源性最高（98.5%），與其 他Ah的同源性在93.4%以上（圖2-A）；16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的同源性與GenBank中登錄的其他Ah的均具有高同源性（97.7%以上），并與NQY 1、S5-41、Ah-13等Ah菌株同源性最高達(dá)99.6%（圖2-B）。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上可以看出，無(wú)論是基于gyrB基因還是16S rRNA基因的序列，結(jié)果均顯示ZF4與Ah聚為一簇。

2.5 致病性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 平板計(jì)數(shù)結(jié)果 將分離菌株ZF4和Ah陽(yáng)性菌株于30℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)取出對(duì)應(yīng)試管測(cè)得OD值繪制線性擬合曲線所對(duì)應(yīng)的關(guān)系式（圖3），培養(yǎng)至3.5 h時(shí)菌體生長(zhǎng)活性較好。陽(yáng)性對(duì)照菌株和ZF4對(duì)應(yīng)OD分別為0.607、0.731時(shí)，其所對(duì)應(yīng)的菌落形成單位分別為8.16×1010CFU/mL、7.66×1010CFU/mL。然后，將陽(yáng)性對(duì)照菌株稀釋成8.16× 1010、8.16×109和8.16×108CFU/mL，ZF4稀釋成7.66×1010、7.66×109和7.66×108CFU/mL注射，每尾注射菌液10 μL，對(duì)照組注射10 μL PBS。

圖2 基于gyrB基因（A）和16S rRNA（B）序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5.2 分離菌株ZF4致病力 斑馬魚(yú)在經(jīng)人工感 染病原菌后，斑馬魚(yú)雌雄個(gè)體表現(xiàn)差異不明顯，ZF4感染組和陽(yáng)性對(duì)照組的表現(xiàn)癥狀基本一致，并且發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀也基本一致。初期均表現(xiàn)為食欲不振，游動(dòng)緩慢，體表粘液分泌增多，后期出現(xiàn)身體側(cè)翻，失去平衡、腹部紅腫及鰭條基部充血（圖4-A）等病癥，解剖可見(jiàn)肝臟腫大，腹腔積水（圖4-B）。將感染病魚(yú)的鰓絲置于顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，病魚(yú)鰓絲呈灰白色，末端彎曲伴有缺損現(xiàn)象，且附有大量粘液，鰓絲之間發(fā)生相互粘連現(xiàn)象，并有許多黑色附著物（圖4-D）。陽(yáng)性對(duì)照菌株感染的斑馬魚(yú)中，8.16×1010CFU/mL組，在實(shí)驗(yàn)3 d內(nèi)死亡率為50%；其他濃度注射組在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)未出現(xiàn)死亡，但部分魚(yú)體出現(xiàn)了食欲不振，腹部紅腫等病理癥狀。ZF4感染的斑馬 魚(yú)中，7.66×1010CFU/mL組，在實(shí)驗(yàn)3 d內(nèi)死亡率為50%；其他濃度注射組在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)未出現(xiàn)死亡，亦有個(gè)體出現(xiàn)相似的病癥表現(xiàn)。對(duì)照組在7 d內(nèi)活動(dòng)正常，未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和死亡。

2.6 斑馬魚(yú)人工感染Ah的組織病理變化

將斑馬魚(yú)肝臟、腸道、脾臟等內(nèi)臟器官組織固定后進(jìn)行HE染色切片，從病理切片來(lái)看，感染Ah陽(yáng)性菌株和分離菌株ZF4病魚(yú)的器官組織均發(fā)生了較為明顯的變化，其中肝臟變化最為普遍和明顯。肝臟中均可見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹變形，在血管周圍可見(jiàn)較多的含鐵血黃素沉積（圖5-B），部分細(xì)胞胞質(zhì)消失，結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞間界限不明顯，實(shí)質(zhì)中出現(xiàn)空泡變性甚至氣球性變性（圖5-C），在肝臟的邊緣可見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞增生（圖5-D）。與斑馬魚(yú)正常腸道結(jié)構(gòu)（圖6-A）相比，感染病魚(yú)腸黏膜上皮細(xì)胞變性（圖6-B），嚴(yán)重者腸絨毛萎縮、上皮細(xì)胞大量壞死并脫落（圖6-C）。脾臟表現(xiàn)為組織充血、水腫（圖6-E），正常結(jié)構(gòu)消失，部分感染者脾實(shí)質(zhì)存在增生性結(jié)節(jié)（圖6-F）。胰腺的 變化主要有內(nèi)外分泌部分界不清晰、正常結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)大量 的炎性細(xì)胞（圖6-H），個(gè)別個(gè)體出現(xiàn)胰腺間質(zhì)纖維組織增生（圖6-I）。

圖3 兩種菌株的線性擬合曲線

圖4 人工感染后斑馬魚(yú)臨床癥狀和鰓的變化

2.7 感染菌再分離鑒定

將ZF4人工感染實(shí)驗(yàn)發(fā)病致死的斑馬魚(yú)置于無(wú)菌條件下，從腸道中再次分離細(xì)菌，并進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和菌落鑒定，獲得與原感染菌ZF4形態(tài)及生理生化特征一致的細(xì)菌。

圖5 人工感染后斑馬魚(yú)肝臟的組織病理變化

圖6 人工感染后斑馬魚(yú)腸道、脾臟和胰腺的組織病理變化

3 討論

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）是氣單胞菌屬細(xì)菌中較早的成員，是一種在水體中廣泛存在的細(xì)菌，可引起魚(yú)類及其他水產(chǎn)動(dòng)物的多種病害，尤其對(duì)密集型養(yǎng)殖的水生生物危害更為嚴(yán)重［12］。而在實(shí)驗(yàn)室條件下，水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（以斑馬魚(yú)為代表）正是以密集方式養(yǎng)殖，微生物質(zhì)量控制是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的重要指標(biāo)，如何有效進(jìn)行微生物的檢測(cè)和控制已引起科研人 員的廣泛關(guān)注。本研究中從發(fā)病斑馬魚(yú)體內(nèi)分離到1株β溶血的革蘭氏陰性短桿菌ZF4，其菌落為光滑、微凸、圓整、無(wú)色或淡黃色，有特殊芳香氣味，與GB/T 18652-2002描述的一致［13］。經(jīng)生物學(xué)特性和生化特性分析，初步鑒定為Ah。

Ah物種的異質(zhì)性對(duì)用傳統(tǒng)生化方法來(lái)鑒別提出了挑戰(zhàn)［14］，分子生物學(xué)方法已被普遍應(yīng)用于Ah的鑒定。根據(jù)嗜水氣單胞菌的16S rDNA、外膜蛋白、溶血素及絲氨酸蛋白酶基 因，凌空等［15］建立了一種檢測(cè)大鯢致病性嗜水氣單胞菌的四重PCR法。本研究對(duì)分離菌ZF4進(jìn)行了Ah的氣溶素基因AHA_0438、胞外絲氨酸蛋白酶基因ASP、gyrB、16S rR NA的PCR鑒定，結(jié)果顯為陽(yáng)性，目的條帶與陽(yáng)性對(duì)照菌株的結(jié)果相符。識(shí)別Ah最準(zhǔn)確的方法是管家基因測(cè)序［16］，一般選用gyrB基因和16S rRNA［17，18］。gyrB即促旋酶（gyrase）的B亞單位基因，普遍存在于各種細(xì)菌中，其序列具有保守性和變異性，可作為系統(tǒng)發(fā)育的靶標(biāo)，廣泛應(yīng)用于以核苷酸序列為基礎(chǔ)的細(xì)菌分類及鑒別研究中［19］。此外，gyrB基因是否發(fā)生突變是在進(jìn)行研制Ah有效的疫苗時(shí)重點(diǎn)關(guān)注的［20］。以16S rRNA為目的基因的PCR鑒定方法最為成熟，Ah能在16S rRNA基因擴(kuò)增區(qū)得到有效擴(kuò)增，而非氣單胞菌屬的菌株，在此擴(kuò)增區(qū)都為陰性［21］。本研究選取了保守基因gyrB及16S rRNA對(duì)分離菌株ZF4進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，gyrB基因及16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的同源性與GenBank中登錄的其他Ah的同源性在分別在93.4%與97.7%以上。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育上可以看出，無(wú)論是基于gyrB基因還是16S rRNA基因的序列，聚類分析結(jié)果均顯示分離菌株ZF4與Ah聚為一簇。由此可以從分子水平確定分離的ZF4為Ah。

Ah感染臨床上以急性出血性敗血癥為主要特征，慢性感染則主要表現(xiàn)為皮膚 潰瘍或腸炎［13］。杜雄偉等［22］通過(guò)人工感染實(shí)驗(yàn)表明，嗜水氣單胞菌可使劍尾魚(yú)產(chǎn)生敗血癥，組織病理學(xué)變化以全身溶血性貧血和廣泛的組織細(xì)胞變性、壞死為主，各臟器均發(fā)生變質(zhì)性病變。徐祥等［23］對(duì)Ah感染的雜交鱘進(jìn)行了組織病理學(xué)研究，患病雜交鱘鰓絲腐爛、色淺或呈紫黑色，腹腔壁及內(nèi)臟器官可見(jiàn)出血斑；肝、腎、脾等內(nèi)臟器官均有組織病理變化。本研究選取健康的野生型斑馬魚(yú)進(jìn)行了Ah人工感染致病性實(shí)驗(yàn)，旨在確定Ah對(duì)斑馬魚(yú)的致病力以及組織病理學(xué)變化。Ah人工感染的斑馬魚(yú)出現(xiàn) 病變、死亡，組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)的主要器官（包括肝臟、腸道、脾臟、胰腺）均有明顯的病理變化，典型癥狀為肝臟組織變性、腸道內(nèi)膜脫落、脾臟充血。由此可見(jiàn)，斑馬魚(yú)對(duì)Ah菌株敏感，易病變。

4 結(jié)論

從患病斑馬魚(yú)體內(nèi)分離的致病菌株鑒定為致病性嗜水氣單胞菌，且人工感染后致病力和組織病理學(xué)研究顯示斑馬魚(yú)對(duì)該菌敏感，因此斑馬魚(yú)可作為研究嗜水氣單胞菌的動(dòng)物模型。

［1］陸承平. 致病性嗜水氣單胞菌及其所致魚(yú)病綜述［J］. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1992, 16（3）：282-288.

［2］楊守明, 王民生. 嗜水氣單胞菌及其對(duì)人的致病性［J］. 疾病控制雜志, 2006, 10（5）：511-514.

［3］Natrah FM, Pawar S, Alam MI, et al. The impact of quorum sensing on the virulence of Aeromonas hydrophila and Aeromonas salmonicida towards burbot（Lota lota L. ）larvae［J］. Vet Microbiol, 2012, 159（1-2）：77-82.

［4］Meng S, Wang Y, Liu D, et al. Development of cross-priming amplification assays for rapid and sensitive detection of Aeromonas hydrophila［J］. Lett Appl Microbiol, 2015, 61（2）：171-178.

［5］Sechi LA, Deriu A, Falchi MP, et al. Distribution of virulence genes in Aeromonas spp. isolated from Sardinian waters and from patients with diarrhoea［J］. J Appl Microbiol, 2002, 92（2）：221-227.

［6］Janda JM, Ab bott S L. Evolving concepts regarding the genus Aeromonas：an expanding Panorama of spe cies, disease presentations, and unans wered questions［J］. Clin Infect Dis, 1998, 27（2）：332-344.

［7］Wang G, Clark G, Liu C, et al. Detection and characterization of the hemolysin genes in Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria by multiplex PCR［J］. J Clin Microbiol, 2003, 41（3）：1048-1054.

［8］饒靜靜, 李壽崧, 黃克和, 等. 致病性嗜水氣單胞菌多重PCR檢測(cè)方法的建立［J］. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2007, 14（5）：749-755.

［9］付喬芳, 邱軍強(qiáng), 胡鯤, 等. 嗜水氣單胞菌國(guó)內(nèi)分離株的毒力因子分布與致病性相關(guān)性分析［J］. 生物學(xué)雜志, 2011, 28（6）：53-57.

［10］Chopra AK, Houston CW, Peterson JW, et al. Cloning, expression, and sequence analysis of a cytolytic enterotoxin gene from Aeromonas hydrophlia［J］. Canadian Journal of Microbiology, 1993, 39（5）：513-523.

［11］李蓮瑞, 羅紅斌, 盧強(qiáng), 等. 嗜水氣單胞菌Aer毒素的研究進(jìn)展［J］. 塔里木大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 16（3）：46 -50.

［12］張曉君, 陳翠珍, 房海. 草魚(yú)腸炎嗜水氣單胞菌分離株的主要特性及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析［J］. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2006, 22（4）：334-337.

［13］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. GB/T 18652-2002, 致病性嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)方法［S］. 北京：中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)出版社, 200 2.

［14］Persson S, Al-Shuwel i S, Yapici S, et al. Identification of clinical aerom onas species by rpoB and gyrB sequencing and development of a multiplex PCR method for detect ion of Aeromonas hydrophila, A. caviae, A. veronii, and A. media［J］. J Clin Microbiol, 2015, 53（2）：653-666.

［15］凌空, 詩(shī)華, 金娟, 等. 一種檢測(cè)大鯢致病性嗜水氣單胞菌的四重PCR法［J］. 生物技術(shù)通訊, 2014, 9：201-207.

［16］Shin HB, Yoon J, Lee Y, et al. Comparison of MALDI-TOF MS, housekeeping gene sequencing, and 16S rRNA gene sequencing for identification of Aeromonas clinical isolates［J］. Yonsei Med J, 2015, 56（2）：550-555.

［17］Abu-Elala N, Abdelsalam M, Marouf S, et al. Comparative analysis of virulence genes, antibiotic resistance, and gyrB based phylogeny of motile Aeromonas species isolates from Nile tilapia and domestic fowl［J］. Lett Appl Microbiol, 2015, 61（5）：429-436.

［18］Ghenghesh KS, Ahmed SF, Cappuccinelli P, et al. Genospecies and virulence factors of Aeromonas species in different sources in a North African country［J］. Libyan J Med, 2014, 9：25497.

［19］侯曉麗, 陳智. 分類及鑒別細(xì)菌的新靶標(biāo)——gyrB基因［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)（流行病 學(xué)傳染病學(xué)分冊(cè)）, 2005, 32（1）：38-41.

［20］Pridgeon JW, Yildirim-Aksoy M, Klesius PH, et al. Identification of gyrB and rpoB gene mutations and differentially expressed proteins between a novobiocin-resistant Aeromonas hydrophila catfish vaccine strain and its virulent parent strain［J］. Vet Microbiol, 2013, 166（3-4）：624-630.

［21］潘曉 藝, 沈錦玉, 郝貴杰, 等. 氣單胞菌和嗜水氣單胞菌雙重PCR檢測(cè)方法的建立［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 30（6）：759-763.

［22］杜雄偉, 常藕琴, 王曉輝, 等. 嗜水氣單胞菌對(duì)劍尾魚(yú)的致病性及組織病理學(xué)研究［J］. 長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2005, 2（2）：53-56.

［23］徐祥, 李華, 葉仕根, 等. 雜交鱘嗜水氣單胞菌病的組織病理學(xué)研究［J］. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 29（3）：227-231.

（責(zé)任編輯 李楠）

Identification of Aeromonas hydrophila and Histopathological Observation of Artificial Infected Zebrafish

LIN Jin-xing1YANG Chi1，2FENG Li-ping1HU Jian-hua1
（1. Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203；2. College of Chemistry，Chemical Engineering and Biotechnology，Donghua University，Shanghai 201620）

The aims of this paper are to isolate and identify pathogenic strain from diseased zebrafish，and to observe the histopathological changes of artificial infected zebrafish. The isolated strain ZF4 was identified by comprehensive analysis of its morphology，physiological and biochemical characteristics，conserved gene and phylogenetic tree. The results showed that the ZF4 was gram negative bacillus，positive in indole test，fermented glucose，sucrose sugars，etc. The gene AHA_0438，ASP，gyrB and 16S rRNA of ZF4 were all positive. Based on gyrB and 16S rRNA gene sequence，clustering analysis result showed that ZF4 was Aeromonas hydrophila. The infected zebrafish presented obvious clinical symptoms，and histopathological changes were observed，such as the liver tissue degeneration，intestinal lining shedding，hyperemia of the spleen，pancreas fibrous tissue hyperplasia.，etc. In conclusion，the ZF4 isolated from the diseased zebrafish was identified as pathogenicity A. hydrophila. Meanwhile，due to its susceptibility，zebrafish could be used as the animal model to study the A. hydrophila.

zebrafish；Aeromonas hydrophila；identification；artificial infection；histopathology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.032

2015-04-15

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2013BAK11B02），上海市科技發(fā)展基金項(xiàng)目（15140901000）

林金杏，女，博士，副研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)用魚(yú)質(zhì)量控制及形態(tài)學(xué)，E-mail：linjinxing83@163.com；楊遲同為本文第一作者

胡建華，男，研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制；E-mail：jhhu@live.cn