毛明宇張文宇夏洪宇王洋李晶

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2. 東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，哈爾濱 150040）

擬南芥黑芥子酶TGG1對抗旱性的作用

毛明宇1張文宇1夏洪宇1王洋2李晶1

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2. 東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，哈爾濱 150040）

為闡明擬南芥中黑芥子酶TGG1對抗旱性的影響，構(gòu)建了35S啟動子驅(qū)動的TGG1過表達載體，并將其轉(zhuǎn)入擬南芥獲得了轉(zhuǎn)基因植株。以野生型和過量表達TGG1的轉(zhuǎn)基因植株為材料，進行干旱脅迫實驗，結(jié)果顯示，在甘露醇模擬的干旱脅迫下35S∶TGG1種子平均發(fā)芽率顯著高于野生型，平均相對電導(dǎo)率則顯著低于野生型；自然干旱脅迫下，35S∶TGG1的相對失水速率顯著慢于野生型，而干旱復(fù)水后的平均存活率則顯著高于野生型。對氣孔的觀察結(jié)果表明，過表達TGG1的轉(zhuǎn)基因植株氣孔對ABA處理具有更高的敏感性，氣孔關(guān)閉程度顯著高于野生型植株。以上研究結(jié)果表明，過量表達TGG1基因可顯著提高擬南芥的抗旱能力，而且其抗性機制很可能與氣孔在逆境下的關(guān)閉程度有關(guān)。

芥子油苷水解酶；TGG1；擬南芥；干旱脅迫；氣孔

芥子油苷是一種廣泛存在于十字花科植物中的次級代謝產(chǎn)物［1］，目前已發(fā)現(xiàn)的種類數(shù)量超過120種［2］。一般是由β-D-硫葡萄糖基、硫化肟基團和一源自氨基酸的側(cè)鏈組成［3］，其水解產(chǎn)物具有抵御病蟲害、形成獨特風味以及阻遏癌癥等作用［4-6］。但由于其本身是一種相對穩(wěn)定的物質(zhì)，故其大部分生物功能都是靠硫代葡萄糖苷酶—黑芥子酶系統(tǒng)經(jīng)降解作用來實現(xiàn)的［7］。這一系統(tǒng)又被稱為芥子油彈［8］，通常情況下芥子油苷與黑芥子酶存儲在植物細胞的不同位置，芥子油苷儲存于液泡內(nèi)，而黑芥子酶則儲存于細胞質(zhì)基質(zhì)。當植物遭受到外來損傷時，兩者之間的隔離遭到破壞繼而兩者相遇發(fā)生反應(yīng)［9］，無毒的芥子油苷被黑芥子酶降解成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物硫代氫肟酸磺酸酯，在不同的條件下轉(zhuǎn)化成不同的終產(chǎn)物［10］，由這些產(chǎn)物行使不同的生物學(xué)功能［11］。

黑芥子酶是一類內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶，是一種典型的糖基化酶，屬于目前已知的135個糖苷水解酶家族之一［12］。根據(jù)已有的報道，擬南芥體內(nèi)編碼黑芥子酶的基因主要包括7種：TGG1、TGG2、TGG3、TGG4、TGG5、TGG6及PEN2。通過氨基酸序列的對比分析，發(fā)現(xiàn)TGG1與TGG2相似性很高，而TGG4與TGG5相似性極高，PEN2與經(jīng)典黑芥子酶基因（TGGs）差異較大，相似性都低于50%，其中TGGs主要響應(yīng)機械損傷對植物帶來的傷害，而PEN2則主要負責應(yīng)對病原菌的入侵［13］，且只作用于吲哚族芥子油苷［14］。目前擬南芥基因組中6個經(jīng)典黑芥子酶基因所在的染色體位置已得到確認，其中，TGG1、TGG2和TGG3位于染色體V上，TGG4、TGG5和TGG6三個基因則位于染色體I上［15］。宏觀組織定位結(jié)果顯示，TGG1和TGG2在植物的地上部分表達，TGG4和TGG5則在地下部位表達［16］，TGG3與TGG6是在花中特異性表達的假基因［17-19］。在黑芥子酶基因家族中，TGG1的表達量最多且表達范圍最廣，是最為重要的一個黑芥子酶基因。近年來有研究指出，TGG1的功能并不僅僅局限于水解芥子油苷，還與氣孔的發(fā)育和調(diào)控有關(guān)［20］，氣孔是調(diào)節(jié)植物體內(nèi)水分運動和保存的關(guān)鍵因素［21，22］，氣孔的閉合與開度的減小能降低植物體內(nèi)水分的損失從而增強植物對干旱脅迫的承受能力［23］。當植物受到干旱脅迫時，脫落酸（ABA）被干旱誘導(dǎo)而大量積累［24］，作為激素信號調(diào)控氣孔開度［25，26］，有研究表明TGG1處于脫落酸（ABA）和茉莉酸甲酯（MeJA）調(diào)控氣孔關(guān)閉的信號途徑的下游，且與TGG2存在功能冗余，在tgg1tgg2雙缺失的情況下氣孔不能閉合［27］。因此推測，TGG1也有可能參與調(diào)節(jié)植物對干旱脅迫的應(yīng)答，盡管已有研究證實TGG1處于ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉信號途徑的關(guān)鍵位置，但過量表達TGG1在植物對干旱脅迫的耐受性方面的影響尚沒有實驗證明。為了驗證這個假設(shè)，本研究構(gòu)建了35S∶TGG1過表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥獲得TGG1過表達植株，同時以野生型植株和35S∶TGG1植株為實驗材料，進行了干旱脅迫處理，分析了不同基因型植物對干旱脅迫的抗性差異。以往對于芥子油苷的研究往往局限在抗病抗蟲的方面，而對其在非生物脅迫中所起的作用缺失直接的證據(jù)，本研究旨在證明芥子油苷的水解酶基因TGG1參與植物的干旱應(yīng)答，以期為TGG1參與干旱脅迫的假設(shè)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 野生型擬南芥（哥倫比亞型）種子。

1.1.2 菌株與試劑 大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404；植物總RNA提取試劑盒（OMEGA biotek公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程公司）、膠回收試劑盒（Bioteke公司）、Not I和Pst I限制性內(nèi)切酶、pCambia 2300 6號User載體、其余 DNA Marker DL2000、dNTP、Hotmaster Taq DNA Ploymerase等購自TIANGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥葉片總RNA的提取和cDNA的合成 取3周齡的擬南芥葉片，加入液氮充分研磨后利用OMEGA biotek公司生產(chǎn)的植物總RNA提取試劑盒進行葉片總RNA的提取，提取完成后用大連寶生物工程公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取出的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作參看說明書。

1.2.2 擬南芥TGG1基因的克隆及測序 以上述獲得的cDNA為模板，5'-GGCTTAAUATGAAGCTTCT TATGCTCG-3'為上游引物序列，5'-GGTTTAAUTC ATGCATCTGCAAGACTC-3'為下游引物序列進行擴增，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，28次循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后按照Nour-Eldin等［28］的方法與User載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，37℃過夜培養(yǎng)，取PCR檢測呈陽性的菌落擴大培養(yǎng)送交測序。

1.2.3 根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與擬南芥的浸染 選取測序結(jié)果正確的大腸桿菌菌落擴大培養(yǎng)，利用試劑盒提取質(zhì)粒，使用凍融法將其轉(zhuǎn)入感受態(tài)農(nóng)桿菌。細胞懸浮液涂布在含卡那霉素100 mg/L、鏈霉素50 mg/L、利福平50 mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h，長出菌落后挑取菌落進行PCR驗證，以檢驗?zāi)康幕蚴欠褶D(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。選取檢驗呈陽性的農(nóng)桿菌菌落進行擴大培養(yǎng)，運用花序侵染法侵染擬南芥，收獲種子。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子的篩選及PCR檢測 收獲的種子于4℃春化3 d后，對種子進行表面消毒：用6%的NaClO與無菌水以4∶6的比例混合配制出消毒劑，加入盛有種子的EP管中振動4 min，倒出消毒劑并用無菌水洗滌6次，消毒后的種子播種于含卡那霉素50 mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上，16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)5 d［光強為90 μmol/（m2·s），相對濕度為70%］后將抗性幼苗轉(zhuǎn)移至蛭石與黑土比為1∶1的混合土中繼續(xù)培養(yǎng)3周，分別用相應(yīng)的試劑盒提取其DNA及RNA進行分子水平的檢測，利用半定量RT-PCR方法篩選TGG1過量表達的轉(zhuǎn)基因植株，純合兩代后獲得35S∶TGG1純合子。

1.2.5 35S∶TGG1轉(zhuǎn)基因幼苗抗旱性的鑒定 為模擬干旱脅迫，在1/2 MS培養(yǎng)基中加入甘露醇，設(shè)置兩個濃度，分別含150 mmol/L和250 mmol/L甘露醇。將WT，35S∶TGG1兩種基因型的種子經(jīng)表面消毒后種在1/2 MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d，然后將幼苗轉(zhuǎn)移到含150 mmol/ L甘露醇和250 mmol/L甘露醇的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，8 d后，采用電導(dǎo)法測量3種幼苗的相對電導(dǎo)率［29］。

將消毒后的野生型與35S∶TGG1的種子分別播在含0 mmol/ L和150 mmol/ L甘露醇的1/2MS固體培養(yǎng)基上，統(tǒng)計相對發(fā)芽率并比較其生長情況。

1.2.6 35S∶TGG1轉(zhuǎn)基因成株的抗旱性鑒定 將WT，35S∶TGG1兩種基因型的種子消毒后種在1/2 MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d后移栽至黑土與蛭石比例為1∶1的土壤環(huán)境中培養(yǎng)，每盆移5顆，培養(yǎng)3周后，取葉片進行離體葉片相對失水率的統(tǒng)計，8片葉子為一組，3次重復(fù)，統(tǒng)計失水速率；對干旱處理組進行停止?jié)菜?4 d的處理，至葉片呈萎縮干癟狀，復(fù)水培養(yǎng)7 d，觀察表型，統(tǒng)計幼苗存活率。

1.2.7 35S∶TGG1氣孔的開度觀察 分別剪取同為3周齡的過表達植株和野生型同等位置的蓮座葉，浸泡于配方為30 mmol/L KCl，0.1 mmol/L EGTA，10 mmol/L MES-KOH（pH6.15）的opening buffer中，光照2.5 h后轉(zhuǎn)移至含10 μmol/L ABA，30 mmol/L KCl，0.1 mmol/L CaCl2，10 mmol/L MES-KOH（pH6.15）的溶液之中浸泡2.5 h［30］。用95%酒精定型，葉片上表面帖附于透明膠上，刀片刮去葉肉，置于光學(xué)顯微鏡下10倍目鏡×40倍物鏡進行觀察。用軟件Image J測量氣孔長寬比，取100個氣孔進行統(tǒng)計，以長寬比為依據(jù)衡量氣孔開度的大小。

圖1 TGG1的克隆

2 結(jié)果

2.1 擬南芥TGG1基因的克隆與過表達植株的獲得

利用RT-PCR方法擴增獲得TGG1基因的CDS序列（圖1-A），經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定得到一段約1 600 bp長短的條帶，與目的基因長度相符。擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收進行純化后，與pCambia 2300 User載體連接，獲得TGG1的過表達載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂布到含有100 mg/L卡那霉素的LB平板上過夜后，選取菌落進行PCR驗證（圖1-B）。挑取PCR檢測呈陽性的1、4、5、7、8、9、10菌落擴大培養(yǎng)，送交測序，測序結(jié)果用軟件DNAMAN進行比對分析。將序列完全正確的7號菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，挑取菌落進行PCR驗證（圖1-C），條帶大小約1 600 bp，與預(yù)期結(jié)果一致?；ㄐ蚯秩痉ń緮M南芥收獲種子，經(jīng)含卡那霉素50 mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基篩選，獲得TGG1基因過表達植株幼苗。

2.2 35S∶TGG1轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

對得到的抗性苗進行分子水平上的檢測，結(jié)果（圖2）顯示，除4號樣品為假陽性外，其余20株皆為成功轉(zhuǎn)基因的植株。在載體上選取一段序列設(shè)計一端引物，在目的基因TGG1上選取一段序列設(shè)計另一端引物，提取抗性苗的總DNA進行PCR檢測。

圖2 35S：TGG1轉(zhuǎn)基因植株的DNA檢測

選取5株DNA水平檢測呈陽性的植株進行mRNA水平上的檢測，取同樣生長環(huán)境下、同齡的野生型（WT）作為對照組，提取樣品和對照的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用內(nèi)參基因Actin進行調(diào)平，調(diào)平后進行PCR檢測。結(jié)果（圖3）顯示，1-5號樣品亮度均顯著大于野生型，證明轉(zhuǎn)入的TGG1基因在擬南芥體內(nèi)被成功的過表達，其中1號和2號樣品表達量最高。

圖3 擬南芥TGG1基因過表達植株的RT-PCR檢測

2.3 干旱脅迫下35S∶TGG1種子發(fā)芽率的變化

將野生型和35S∶TGG1的種子分別播在含有0 mmol/L 和150 mmol/L甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不含甘露醇的培養(yǎng)基中，兩種植株均能良好地萌發(fā)，且發(fā)芽率沒有顯著差別。但在150 mmol/L甘露醇脅迫下，野生型幾乎完全不能萌發(fā)，而35S∶TGG1雖然萌發(fā)速度降低，但90%以上種子均能萌發(fā)（圖 4-A）。

2.4 干旱脅迫下35S∶TGG1幼苗相對電導(dǎo)率的變化

在150 mmol/L和250 mmol/L兩種濃度的甘露醇模擬的干旱脅迫下，35S∶TGG1幼苗的相對電導(dǎo)率顯著低于野生型。在150 mmol/L甘露醇脅迫下35S∶TGG1的相對電導(dǎo)率為野生型的79%；250 mmol/L甘露醇脅迫下35S∶TGG1的相對電導(dǎo)率為野生型的90.3%（圖4-B），這說明在甘露醇模擬的干旱脅迫下，35S∶TGG1幼苗的損傷程度低于野生型。

2.5 35S∶TGG1成株離體葉片的相對失水率變化

選取長勢一致的4周齡擬南芥植株，8片葉子為一組樣品測量鮮重，樣品置于空氣中進行自然風干，每組進行3次重復(fù)，計算失水速率。統(tǒng)計結(jié)果顯示（圖4-C），35S∶TGG1植株的離體葉片的相對失水速率顯著低于野生型，5 h后葉片的干癟程度也顯著低于野生型葉片（圖4-D）。

2.6 35S∶TGG1成株干旱復(fù)水后的恢復(fù)

干旱處理14 d后，兩種基因型的植株皆呈萎縮干癟狀，復(fù)水處理7 d之后，兩種基因型中皆有一部分植株復(fù)活（圖4-E），經(jīng)統(tǒng)計，基因型35S∶TGG1的平均存活率為72%，而WT的平均存活率為42%（圖4-F），表明在干旱脅迫復(fù)水后，35S∶TGG1恢復(fù)正常生長的能力明顯提高。

2.7 過表達TGG1促進ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉

未經(jīng)ABA處理的情況下，野生型與35S∶TGG1的氣孔長/寬比沒有差別，而經(jīng)過ABA處理之后，35S∶TGG1植株氣孔的長/寬比明顯大于野生型（如圖4-G，4-H），即35S∶TGG1植株的氣孔關(guān)閉程度顯著大于野生型，由此可知過表達TGG1提高了氣孔對ABA的敏感性，使ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉更加強烈。

圖4 35S∶TGG1抗旱性的變化

3 討論

芥子油苷的代謝一直以來被認為主要與病蟲害抗性相關(guān)，與非生物脅迫關(guān)系的報道較少，本研究證明了芥子油苷的降解與植物的抗旱性密切相關(guān)。以野生型及超量表達TGG1的擬南芥為實驗材料，進行干旱脅迫處理，多種生理指標均顯示35S∶TGG1的抗旱能力強于野生型，證明超量表達TGG1可增強擬南芥對干旱的抗性。

前人研究認為，TGG1的主要作用是降解脂肪族芥子油苷，將無毒穩(wěn)定的芥子油苷水解成有毒物質(zhì)參與到植物對病蟲害的抵御過程中去［31］，而對其在非生物脅迫中所起的作用研究相對較少。以往有研究表明短鏈脂肪族芥子油苷能影響植物體內(nèi)水的平衡與運輸，從而在鹽脅迫的情況下減少水分的流失起到抵御非生物脅迫的作用［32］。而本實驗證明了芥子油苷的代謝不僅僅參與鹽脅迫的抵御，還與植物的抗旱性密切相關(guān)，通過統(tǒng)計過表達植株的發(fā)芽率、相對電導(dǎo)率和耐旱性的變化，證明了TGG1與植物抗旱性有關(guān)的推測，得到了過表達TGG1可提高擬南芥抗旱性的結(jié)論。結(jié)合前人的研究結(jié)果，我們推測過量表達TGG1提高擬南芥抗旱性的機制有3個方面：（1）芥子油苷被降解后釋放的各級水解產(chǎn)物可能作為滲透物質(zhì)增加了細胞液的濃度，從而提高了植物的滲透勢，增強了抗旱能力；（2）芥子油苷是一種富含氮硫的重要次級代謝產(chǎn)物［33］，被TGG1水解后釋放出氮硫等營養(yǎng)元素，而氮營養(yǎng)元素含量的增加會使植物體內(nèi)Na+和K+等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的升高［34］，進而提高植物的抗干旱能力；（3）減少失水率是提高植株耐旱性的一個主要因素，植物體內(nèi)水分的散失主要通過氣孔的蒸騰作用，大量證據(jù)顯示，在干旱狀況下，ABA會在植物體內(nèi)大量積累，并引起氣孔的關(guān)閉。本研究發(fā)現(xiàn)35S∶TGG1植株的葉片經(jīng)ABA處理后，氣孔的關(guān)閉程度顯著高于野生型，說明35S∶TGG1對于ABA信號的響應(yīng)更加敏感，很可能是因為在干旱脅迫下能更加迅速地關(guān)閉氣孔從而表現(xiàn)出更高的抗旱能力。

芥子酶家族在芥子油苷代謝和植物抗病性方面發(fā)揮著重要作用，但不同芥子酶基因的功能尚未被完全認知，TGG1作為擬南芥黑芥子酶中最為重要的一種，在抵御自然界生物及非生物脅迫的過程中都起著至關(guān)重要作用，本研究證明了TGG1與植物的抗旱性有關(guān)，但具體機制尚不明確，還有待進一步的研究與證明。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了TGG1基因的過表達載體，并成功轉(zhuǎn)入擬南芥獲得了穩(wěn)定遺傳的過表達植株純合子，證明了TGG1基因與擬南芥抗旱能力有關(guān)，過表達TGG1可以提高植物的抗旱能力，且這種抗旱性的提高可能與氣孔敏感性有關(guān)。

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（責任編輯 馬鑫）

The Role of Myrosinase TGG1 in Drought Resistance in Arabidosis thaliana

MAO Ming-yu1ZHANG Wen-yu1XIA Hong-yu1WANG Yang2LI Jing1
（1. College of Life Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin 150030；2. Alkali Soil Natural Environmental Science Center，Northeast Forestry University，Harbin 150040）

In order to illuminate the function of myrosinase TGG1 in drought resistance，an over-expressing vector with TGG1 gene driven by 35S promoter was constructed and transferred into Arabidopsis thaliana. Drought stress were tested using the wild and TGG1-overexpressed transgenic plants. Our results showed that in a simulated drought stress by the treatment of mannitol，the seed germination rate of transgenic seedlings was significantly higher than those of wild type，while relative conductivity rate of leaves in transgenic plants was significantly lower than that in wild type. In the condition of natural drought stress followed by re-watering，35S∶TGG1 showed higher survival rate and was more sensitive to ABA in the process of stomatal closure，and consequently presented the decreased water loss rate and permeability of cell membrane. In general，our study suggested that overexpressed TGG1 gene improved the drought tolerance of A. thaliana，and the mechanism is likely related to degree of stomata closing in stress.

myrosinase；TGG1；Arabidopsis thaliana；drought stress；stomata

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.029

2016-02-03

國家自然科學(xué)基金項目（31170368），黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究資助項目（12531003），國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金子項目（J1210069）

毛明宇，女，碩士研究生，研究方向：植物學(xué)；E-mail：1719722363@qq.com

李晶，女，博士，研究方向：植物次生代謝；E-mail：lijing@neau.edu.cn